Lecture / Presentation 2 / Методичка Часть 2 леч пед МПФ. Част МБ и ВИР

З А Н Я Т И Е 1

Дата ______________

Тема: ООИ. Микробиологическая диагностика чумы, туляремии

План занятия:

1. Возбудитель чумы. Морфология - демонстрация готовых препаратов-мазков.

2. Знакомство со свойствами возбудителей псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза.

3. Возбудитель туляремии. Морфология - микроскопия готовых препаратов-мазков из чистой культуры и из органов зараженных животных.

4. Правила взятия материала, пересылки в лабораторию и условия работы с возбудителями особо опасных инфекций.

5. Знакомство с иммунопрепаратами, применяемыми для диагностики, профилактики и лечения чумы, туляремии (диагностикумы, аллергены, вакцины, сыворотки).

Методические указания

1. Промикроскопировать готовые препараты-мазки возбудителя чумы и зарисовать в рабочую тетрадь. Обратить внимание на морфологию и тинкториальные свойства микроорганизма.

3. Промикроскопировать готовые препараты-мазки возбудителя туляремии из чистой культуры и из органов зараженных животных. Зарисовать в рабочую тетрадь. Обратить внимание на морфологию и тинкториальные свойства микроорганизма.

Контрольные вопросы

Каковы морфологические особенности палочки чумы и ее культуральные свойства? Что такое пестин и для какой цели он применяется?

Какой материал берется для бактериологического исследования при различных клинических формах чумы?

Какие микробиологические методы используются для диагностики чумы? Каковы основные пути заражения человека возбудителем чумы?

Как осуществляется специфическая профилактика чумы?

Какие признаки используют для дифференциации возбудителя чумы от возбудителей ложного туберкулеза грызунов и кишечного иерсиниоза?

Какие подвиды чумных бактерий Вы знаете?

Каковы морфологические культуральные и биохимические свойства возбудителя туляремии?

Какой материал берется от больного при различных клинических формах туляремии? Каковы особенности выделения возбудителя туляремии от больного человека?

3

Какие микробиологические методы используются для диагностики туляремии? Как осуществляется серологическая диагностика туляремии?

Какие препараты используются для аллергической диагностики туляремии? Как ставятся и оцениваются аллергические реакции?

На какой день заболевания рекомендуется ставить реакцию агглютинации и аллергическую пробу при туляремии?

Каковы общие правила взятия, пересылки материала и лабораторного режима при особо опасных инфекциях? В чем заключаются особенности работы с больными чумой и зараженными животными?

Какие вакцины используются для профилактики чумы, туляремии и как они применяются?

Методы микробиологической диагностики чумы

А. Бактериологический

Материал: от больных - пунктат из бубона, мокрота, кровь из вены; от трупов - кусочки органов, лимфоузлы, кровь, костный мозг.

Б. Биологический

Исследуемый материал (см. метод А)

В. Аллергический

(для ретроспективной диагностики) – проба с пестином.

Г. Серологический

Применение иммунологических реакций для обнаружения антигенов возбудителя (РПГА и ее модификации, ИФМ, РИМ).

5

Методы микробиологической диагностики туляремии А. Бактериологический и биологический

Материал: пунктат из бубона, гной из конъюнктивы, пленка из зева

Б. Серологический

Реакция агглютинации по типу реакции Райта (с 10-12 дня заболевания, диагностический титр 1:100)

В. Аллергический

Аллергическая проба с тулярином – накожная и внутрикожная (с 5-7 дня заболевания).

Приложение к ЗАНЯТИЮ 1

А. Иерсинии - возбудители псевдотуберкулеза (Yersinia pseudotuberculosis) и кишечного иерсиниоза (Y. enterocolitica)

Эти два вида иерсиний играют значительную роль в патологии человека. Бактерии представляют собой полиморфные, не образующие спор грамотрицательные палочки,

6

имеющие часто овоидную форму. Клетки в старых культурах окрашиваются неравномерно. Бактерии псевдотуберкулеза, взятые с влажного агара, могут иметь биполярную окраску, образуют капсулу, но с различной степенью выраженности. Оба вида бактерий обладают подвижностью, обусловленной наличием перитрихиальных жгутиков. Подвижность выявляется посевом в столбик полужидкого агара уколом, но только при 18-20ºC , при 37°C подвижность отсутствует.

Иерсинии неприхотливы к питательным средам, хорошо растут на обычных универсальных средах, способны активно размножаться в почве и воде. Оптимальная для роста температуре 30ºС, верхняя и нижняя границы роста составляют 43°С и 0-2°С соответственно, оптимум рН 6,6-7,8. На среде Эндо колонии имеют диаметр 0,1-0,2 мм, круглые выпуклые, блестящие с ровными краями, бесцветные (не ферментируют лактозы). Колонии возбудителя псевдотуберкулеза, находящиеся в R-форме, почти не отличаются от колонии возбудителя чумы (пигментированный центр и фестончатый "кружевной" край). Биохимические различия трех видов иерсиний представлены в таблице.

Все три вида иерсиний отличаются и по своим антигенным свойствам.

Возбудитель псевдотуберкулеза по O-антигенам разделяется на восемь групп (1-8) с 20 O-факторными антигенами (1-20). По O- и Н-антигенам (а-е) этот вид подразделяют на

13 сероваров и подсероваров (la, 1в, 2а, 2в, 2с, 3, 4а, 4в, 5а, 5в, 6, 7, 8).

Y. enterocolitica характеризуется антигенной неоднородностью по 0-антигену. В настоящее время различают более 30 сероваров этого вида. Большинство из них адаптированы к некоторым видам животных или широко распространены во внешней среде. Подавляющее большинство штаммов, выделенных от человека, принадлежат к сероварам 03

и09, реже встречаются серовары 08, 05в и очень редко - серовары 01, 02, 06, 07, 010, 011,

013, 014, 015, 016, 017.

От людей, больных псевдотуберкулезом, чаще всего выделяются штаммы, относящиеся к серовару 1, реже 3 и 4.

Входе эволюции у иерсиний закрепилась необходимость существования в двух средах обитания - внешней (сапрофитическая фаза жизни) и в организме теплокровных животных и человека (паразитическая фаза). Для осуществления паразитической стадии иерсинии должны проникнуть в организм теплокровного животного. Заражение возбудителем псевдотуберкулеза чаще всего происходит при употреблении в пищу инфицированных иерсиниями продуктов, хранившихся при пониженной температуре (4-12ºС) в холодильниках и овощехранилищах. В этих условиях бактерии в силу своей психрофильности могут размножаться и накапливаться в пищевых субстратах.

Иерсинии при пониженной температуре обладают высоким потенциалом клеточной

итканевой инвазивности и способны сохранять высокий уровень вирулентности, однако возбудитель может проникнуть в организм человека и через любые слизистые оболочки, вероятно, за счет неспецифических механизмов.

Основным источником иерсиниозов являются дикие и синантропные грызуны, домашние и сельскохозяйственные животные. Возможно заражение человека от человека. Штаммы Y. pseudotuberculosis выделены от 175 видов млекопитающих, 124 видов птиц, 7 видов рыб. Зараженные грызуны, животные и люди выделяют возбудителя с испражнениями и мочой, загрязняя воду, растения и другие объекты внешней среды. Таким образом, пищевой путь в передаче возбудителей псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза является ведущим. Заражение происходит в результате употребления в пищу сырых или недостаточно термически обработанных продуктов (мяса, мясных продуктов, молока, овощей, фруктов, зелени). Оба вида возбудителя способны существовать внутри растений (салата, гороха, овса и т.п.).

Заболевания, вызываемые иерсиниями, характеризуются полиморфностью клинических проявлений, поражением желудочно-кишечного тракта, тенденцией к генерализации, септикопиемии и поражению различных органов и систем.

7

Патогенные свойства иерсиний обоих видов, как и возбудителя чумы, во многом определяются наличием у них плазмид с молекулярной массой 42-48 МД и 82 МД. Плазмиды контролируют такие свойства возбудителей, как зависимость роста от наличия в среде кальция, способность синтезировать антигены вирулентности (v-w), пили адгезии, способность вызывать кератоконъюнктивит у морской свинки и т.п.

Микробиологическая диагностика иерсиниозов включает использование бактериологического метода и серологических реакций.

При бактериологическом методе исследуемый материал от больных (испражнения, кровь, слизь из зева), а также подозрительные продукты или воду засевают на среды Эндо, Плоскирева, Серова (индикаторную и дифференциальную) и инкубируют при 37°C в течение 48-72 часов.

Подозрительные колонии (мелкие бесцветные на средах Эндо и Плоскирева и окрашенные колонии двух различных форм на средах Серова) пересевают для получения чистых культур, которые идентифицируют по биохимическим признакам и окончательно типируют с помощью диагностических агглютинирующих сывороток.

Для серологической диагностики псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза используют развернутую реакцию агглютинации (по типу реакции Видаля) с соответствующими диагностикумами или реакцию пассивной гемагглютинации (РПГА) с антигенным эритроцитарным диагностикумом. Положительными считают реакции при титре антител 1:400 и выше. Реакции рекомендуется ставить с парными сыворотками (с интервалом в несколько дней). Нарастание титра антител будет свидетельствовать о специфичности инфекционного процесса.

Б. Дифференциальные признаки биоваров Y. рestis

В. Отечественная классификация вида Yersinia pestis (Саратов, 1985)

Г. Особенности генетического контроля факторов патогенности у возбудителя чумы

Контроль наиболее важных факторов патогенности возбудителя чумы осуществляется плазмидами, на которых локализованы гены вирулентности. Известны три плазмиды, контролирующие важнейшие факторы патогенности возбудителя: рYР (м.м.6 МД); рYТ

(м.м. 60 МД) и рYV (м.м. 47 МД).

Плазмида рYР (6 МД) несет гены, определяющие синтез пестицина. фибринолизина и плазмокоагулазы.

8

Плазмида рYТ (60 МД) несет детерминанты, контролирующие синтез антигена фракции I и "мышиного" токсина.

Плазмида рYV (47 МД) ответственна за синтез антигенов v и w и термоиндуцибель-

ных белков внешней мембраны, а также зависимость роста чумной палочки от наличия в среде ионов Са++.

Д. Основные различия между возбудителями чумы, псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза

Е. Географические разновидности туляремийных бактерий

Ж. Ландшафтные типы природных очагов туляремии

Пойменно-болотный, луго-полевой, степной, лесной, предгорно-ручьевой, тугайный (пойменно-пустынный) и тундровый.

9

З А Н Я Т И Е 2

Дата ______________

Тема: ООИ. Микробиологическая диагностика бруцеллеза

и сибирской язвы

План занятия:

1.Приготовление, окраска и микроскопия препаратов-мазков из убитых культур бруцелл.

2.Бактериологическая диагностика бруцеллеза. Выделение гемокультуры (разбор).

3.Серологическая диагностика бруцеллеза. Реакция Райта. Регистрация результатов реакции Райта.

4.Ускоренный метод серологической диагностики бруцеллеза – реакция Хеддлъсона и др.

5.Аллергическая диагностика бруцеллеза. Постановка пробы Бюрне (разбор).

6.Знакомство с препаратами, применяемыми для диагностики, профилактики и лечения бруцеллеза (диагностикумы, бруцеллин, профилактические и лечебная вакцины).

7.Возбудитель сибирской язвы. Изучение морфологических и культуральных свойств. Приготовление и микроскопия мазков из чистой культуры авирулентной сибиреязвенной палочки.

8.Знакомство с иммунопрепаратами, применяемыми для диагностики, профилактики и лечения сибирской язвы (антраксин, вакцины, сыворотки).

Методические указания

1. Приготовить, окрасить по Граму и промикроскопировать препарат из убитой культуры бруцелл. Обратить внимание на размеры микроорганизмов.

3. Поставить реакцию Райта с сывороткой больного бруцеллезом по классической схеме пробирочной реакции агглютинации (см. Часть I, занятие 16). Диагностический титр реакции Райта - 1:200.

Зарегистрировать в таблице результаты реакции Райта. Сформулировать и записать вывод: указывают ли результаты реакции на наличие заболевания бруцеллезом у данного больного?

Регистрация результатов реакции Райта

Вывод: ______________________________________________________________________

_____________________________________________________________________________

_____________________________________________________________________________

4. На стекле размечают карандашом 4 квадрата размером 3x3 см каждый. Микропипеткой наносят в квадраты капли сыворотки объемом 0,04, 0,02 и 0,01 мл, в последний квадрат одну каплю (0,03 мл) физиологического раствора (контроль). В каждую каплю другой микропипеткой добавляют по 0,03 мл бруцеллезного диагностикума. Перемешивают капли стеклянной палочкой пли петлей, начиная с контрольной капли и идя от меньших количеств сыворотки к большим. Слегка подогревая и покачивая стекло, наблюдают за появлением агглютинации, которая должна наступать в течение 5 минут.

10

Оценка реакции: агглютинация только в первой капле – реакция сомнительная; агглютинация в первой и второй каплях – реакция положительная; агглютинация во всех трех каплях – реакция резко положительная.

Примечание: Реакция Хеддльсона имеет только скрининговое, ориентировочное значение. В случае ее положительного результата необходимо ставить более надежные серологические реакции (Райта, РПГА, ИФМ) и/или аллергическую пробу Бюрне.

Зарисовать реакцию Хеддльсона с указанием доз сыворотки в каждой капле.

Регистрация результатов реакции Хеддльсона

Заключение __________________________________________________________________

_____________________________________________________________________________

_____________________________________________________________________________

5. Реакция Бюрне. Техника постановки реакции:

а) стерильным тампоном, смоченным спиртом, тщательно дезинфицируют кожу на границе верхней и средней трети передней поверхности предплечья;

б) в шприц с делениями по 0,1 мл и о тонкой иглой набирают бруцеллин (обратить внимание на внешний вид, данные этикетки и срок годности препарата!);

в) держа шприц по возможности параллельно поверхности кожи, вводят иглу внутрикожно. Для этого необходимо держать иглу срезом вверх и толчкообразными движениями насаживать на нее кожу. Когда срез иглы скроется в коже, иглу поворачивают срезом вниз и, осторожно нажимая на поршень, вводят содержимое шприца в кожу (0,1 мл бруцеллина). На месте инъекции должен образоваться небольшой белый волдырь, указывающий на правильное введение препарата;

г) реакцию учитывают дважды: через 24 и 48 часов. В случае положительной реакции (наличие отека и гиперемии) миллиметровой линейкой измеряют размер отека (длина

иширина).

7.Рассмотреть невооруженным глазом и под малым увеличением микроскопа колонии сибиреязвенных палочек (вакцинный штамм СТИ).

Приготовить, окрасить по Граму и зарисовать препарат из культуры авирулентного штамма сибиреязвенной палочки.

11

Методы микробиологической диагностики бруцеллеза

А. Бактериологический

Б. Биологический

Материал: загрязненный или с низким содержанием бруцелл

Вводится морской свинке по 1,0 мл подкожно

в паховую область

В. Серологический

Для диагностики бруцеллеза используются следующие серологические реакции:

А. Для обнаружения антител

1.Реакция Райта (титр антител определяют в международных единицах - МЕ. Диагностическое значение имеет титр антител более 200 МЕ/мл.

2.Реакция Кумбса (для определения неполных антител).

3.Ускоренные реакции: Хеддльсона, роз-бенгал, латекс-агглютинация, непрямая реакция гемолиза (эритроциты сенсибилизируют липополисахаридом бруцелл, добавляют

12