6 курс / Кардиология / Диагностика_инфекций,_передаваемых_половым_путём_Хворик_Д_Ф

Методы лабораторной диагностики. Результаты лабораторных исследований в процессе лечения позволяют оценить адекватность проводимой терапии, а по ее окончании – полноту излечения. Вместе с тем следует отметить, что на сегодняшний день не существует единого алгоритма и схемы диагностического обследования пациентов с подозрением на хламидиоз [72, 94].

Особенности хламидий свидетельствуют об их нетрадиционности в плане выявления классическими бактериологическими методами диагностики, а именно, данные микроорганизмы не растут на обычных питательных средах [65, 73, 75]. В этой связи для лабораторной диагностики УГХ в настоящее время используются основные четыре группы методов:

бактериоскопические (цитологические), с окраской мазка по Гименезу, Романовскому–Гимза, Макиавелли или раствором Люголя;

культуральные – выделение хламидий на клеточных линиях L-929, Mс Coy, Hela, куриных эмбрионах и др.;

иммунологические, основанные на выявлении антигенов (реакция иммунофлюоресценции) либо антител (ИФА)

С.trachomatis;

молекулярно-генетические (молекулярнобиологические), направленные на выявление нуклеиновых кислот С.trachomatis;

серологические методы выявления антител к

С.trachomatis.

Достоверность лабораторной диагностики УГХ возрастает при одновременном использовании нескольких методов, особенно при обследовании пациентов с локализованными и системными формами инфекционного процесса [78, 80].

Первостепенное значение для диагностики хламидий имеет качество взятия и обработки материала от пациентов [74].

На результатах диагностики сказываются количество взятых образцов, а также место, из которого они были получены. Наиболее информативным может быть клинический материал, если он получен при следующих условиях:

мазки взяты при наличии клинических признаков

11

заболевания;

пациент не использовал лекарственные препараты для местного применения минимум в течение последних 4872 часов;

у женщин при исследовании материалов из УГТ взятие образцов желательно проводить приблизительно в середине менструального цикла (если заболевание не имеет явных проявлений) или в дни, когда нет кровянистых выделений (при обострении процесса);

у мужчин взятие образцов из уретры необходимо проводить при условии задержки мочеиспускания не менее 3-4 часа;

пациент не принимал душ в течение 24 часов;

пациент не принимал антимикробные препараты в

течение последних 3-4 недель.

Из-за возможной токсичности отобранного материала для диагностики имеют значение типы тампонов, с помощью которых берутся соскобы со слизистых. Так, было показано, что дакроновые тампоны лучше ватных, а их основа из пластика или металла лучше деревянной, причем, использование специальных щеточек особых преимуществ, в сравнении с дакроновыми тампонами, не дает.

Перечень медицинских показаний для обследования на УГХ представлен в таблице 4 (согласно Приложению №1 к приказу МЗ РБ № 486 от 20 мая 2009 г.).

Таблица 4 – Перечень медицинских показаний для обследования на ХИ

	Показания	Рекомендуемый
		вид исследований

Мужчины
Воспалительные заболевания половых путей	МАНК
(уретрит, эпидидимит, простатит, парауретрит,
дизурия, кольцевидный баланит и баланопостит,
деферентит, фуникулит, куперит; везикулит;
колликулит; проктит и/или проктоколит).
Бесплодие, эпидидимит, орхит, орхоэпидидимит,	МАНК
простатит.
Плановые оперативные вмешательства на органах	МАНК
мочеполовой системы.

12

		Показания				Рекомендуемый
						вид исследований
Воспалительные заболевания суставов.						МАНК
Длительно		текущий		конъюнктивит		МАНК
неустановленной этиологии.
Длительно текущий назофарингит неустановленной						МАНК
этиологии.
		Женщины
Воспалительные		заболевания	половых		путей	МАНК
(выделения из мочеполовых органов; уретрит,
вульвовагинит, цервицит, ВЗОМТ, бартолинит,
пельвиоперитонит,		посткоитальные			или
межменструальные кровянистые			выделения из
половых путей, дизурия).
Воспалительные заболевания органов малого таза,						МАНК
хронические боли в области малого таза, бесплодие.
Женщины, которым ранее проводилось лечение						МАНК
влагалищной части шейки матки (консервативное,
хирургическое лечение) без предварительного
углубленного обследования.
Женщины с ранним сексуальным дебютом (до 17						МАНК
лет).
Перед проведением медицинских вмешательств:						МАНК
прерывание		беременности,		проведение
репродуктивных		технологий	(ЭКО,		ИКСИ,
инсеминация донорской спермой), проведение
внутриматочных		вмешательств,		введение
внутриматочных систем, плановыми операциями на
органах мочеполовой системы.
Женщины	с	отягощенным		акушерско-		МАНК
гинекологическим		анамнезом,		планирующие
беременность.
Беременные женщины при постановке на учет.						МАНК
Беременные с осложненным течением настоящей						МАНК
беременности: кольпит, цистит, пиелонефрит,
кондиломатоз, угроза прерывания, истмико-
цервикальная недостаточность, хориоамнионит,
преждевременное излитие околоплодных вод.
Воспалительные		заболевания			суставов	МАНК
неустановленной этиологии.
Длительно		текущий		конъюнктивит		МАНК
неустановленной этиологии.

13

	Показания		Рекомендуемый
			вид исследований
Длительно текущий назофарингит неустановленной			МАНК
этиологии.
	Новорожденные
Длительно	текущий	конъюнктивит	МАНК
неустановленной этиологии.
Длительно текущий назофарингит неустановленной			МАНК
этиологии.
Новорожденные с	осложнением	перинатального	МАНК
периода: внутриутробная инфекция, конъюнктивит,
заболевания органов дыхания, заболевания ЛОР-
органов.
	Прочие контингенты
Лица, предполагающие у себя наличие ХИ.			МАНК
Лица, имевшие половой контакт с лицом с			МАНК
установленной ХИ.
При обследовании на другие ИППП.			МАНК
Лица, подвергшиеся половому насилию.			МАНК или
			культура клеток
Группы риска: МСМ; лица, занимающиеся			МАНК
коммерческим сексом.

Хламидии являются «требовательными микроорганизмами» к соблюдению надлежащих условий их транспортировки (состав транспортной среды, температура, при которой осуществляется доставка и хранение материала, длительность транспортировки и хранения), поэтому условия транспортировки должны соблюдаться очень точно [76]. В случае несоблюдения правил взятия и условий доставки биологического материала образцы не подлежат исследованию; об этом сообщается врачу, направившему биологический материал на исследование; разбитые стекла подлежат уничтожению. При взятии и транспортировке материала для проведения молекулярно-биологических и иммунологических методов исследования на С.trachomatis и использовании рекомендуемой для этого транспортной среды необходимо четко соблюдать инструкцию производителя применяемой тест-системы [75].

Далее приведена характеристика диагностических приемов, которые используются для диагностики УГХ.

14

Бактериоскопические (цитологические) методы.

Методы цитологических исследований – микроскопическое исследование клинического материала. Соскобы со слизистых оболочек мочеиспускательного канала и шейки матки берут ложкой Фолькмана, специальной щеточкой или зондом, соблюдая правила антисептики. Выделения и слизистую пробку цервикального канала удаляют тампоном. Соскобы из глубины уретры и цервикального канала осуществляют со всех четырех квадрантов. В материале должны присутствовать эпителиальные клетки. Присутствие выделений и примесей крови маскирует хламидии и затрудняет диагностику. При экстрагенитальных поражениях соскобный материал получают аналогичным способом.

Наиболее распространенными методическими приемами являлась окраска препаратов из клинических материалов по Романовскому-Гимза, по Гименезу, окраска раствором Люголя, окраска по Макиавелли.

Для постановки предварительного диагноза УГХ достаточно обнаружить одно типичное цитоплазматическое включение. Метод прост в исполнении. Одновременно в препаратах можно оценивать морфофункциональное состояние лимфоцитов и нейтрофилов. Однако выявленные клеточные изменения могут служить лишь косвенным признаком наличия хламидий в материале. Необходимо помнить, что этот метод выявляет и псевдовключения (клеточные структуры и бактерии), напоминающие включения хламидий.

Чувствительность метода составляет 30% при хламидийных конъюнктивитах, 10-20% – при УГХ, 15-20% – при пневмохламидиозах, 10-15% – при хламидиозах с поражением центральной нервной системы. Данный метод не пригоден для скрининговых исследований.

Культуральные методы. В связи со сложным жизненным циклом C.trachomatis труднее поддается выделению по сравнению с большинством бактерий. Для того чтобы оптимизировать все этапы культурального метода, необходимо иметь тесные связи с сотрудниками лаборатории, выполняющими данное исследование: от взятия пробы, ее транспортировки (предпочтительно с помощью холодильной камеры) и

15

последующего лабораторного исследования. Все вышеперечисленные факторы делают данный метод дорогостоящим, однако он имеет высокую чувствительность и специфичность. При этом специфичность может быть повышена увеличением кратности исследования.

Методика культуральной диагностики ХИ представлена в таблице 5 (согласно Приложению №5 к Приказу МЗ РБ № 486 от

20 мая 2009 г.).

Таблица 5 – Методика культуральной диагностики ХИ

Название				Описание
	Метод основан на выделении культуры C.
Принцип метода	trachomatis		с	использованием	специальных
	питательных сред
	1)	соскоб из уретры;
	2)	соскоб из цервикального канала;
Биологический	3)	отделяемое из заднего свода влагалища;
	4)	сперма;
материал для	5)	секрет предстательной железы;
исследования
	6)	соскоб из конъюнктивы;
	7)	соскоб из ротоглотки;
	8)	синовиальная жидкость.
	1)	камера Горяева;
	2)	светооптический микроскоп с			иммерсионным
		объективом;
	3)	инвертный микроскоп;
	4)	стерильные		пенфлаконы или	культуральные
		панели;
Оборудование,	5)	водяная баня;
	6)	шейкер;
инструменты и	7)	центрифуга с горизонтальным ротором;
материалы	8)	эксикатор или СО2-инкубатор;
	9)	автоклав;
	10) влажная камера или чашка Петри с
		увлажненным фильтром;
	11) средства индивидуальной защиты персонала;
	12) предметные стекла;
	13) карандаш для маркировки стекол.

культура клеток McCoy; линии L-929, Hela и др. Реагенты ростовая среда;

0,02% раствор Версена;

16

	Название		Описание
		0,25% раствор трипсина;
		раствор трипанового синего;
		среда роста: среда Игла с 3% глютамина, содой,
		HEPES, 5–7% эмбриональной телячьей сыворотки
		(ЭТС) и гентамицином (20 мкг/мл);
		изолирующая среда: среда Игла с 3% глютамина,
		содой, HEPES, гентамицином (20 мкг/ мл),
		эмбриональная телячья сыворотка (ЭТС) в
		количестве 10% от общего объема, 40% раствор
		глюкозы (1,25 мл на 100 мл среды);
		транспортная	среда на основе сахарозо-
		фосфатного буфера;
		раствор Хенкса;
		метанол или формалин;
		дистиллированная вода;
		НСl для корректирования рН;
		изолирующая среда.
		Ведение культуры клеток
		Для ведения культуры McCoy, L-929, Hela и др.
		используется ростовая среда. Пересев клеток
		проводится на 4-е сутки.
		Для более быстрого и полного снятия клеток со
		стекла к 0,02% раствору Версена добавляют 0,25%
		раствор трипсина в соотношении 2:1.
		Контроль качества культуры клеток проводится
		прижизненно под светооптическим микроскопом. В
		работу берутся клетки с отсутствием зернистости в
	Подготовка к	цитоплазме и четкими границами. Подсчет клеток
		выполняют по общепринятой методике в камере
	проведению
		Горяева с использованием трипанового синего.
	анализа
		Приготовление клеточного монослоя.
		Суспензия клеток McCoy, линии L-929, Hela и др. в
		ростовой среде в концентрации 50-100 тыс/мл
		разливается по 2 мл в стерильные пенфлаконы,
		содержащие на дне подложки (покровные стекла),
		или по 1 мл – в лунки специальных 24-луночных
		культуральных панелей типа «Costar» с подложками
		или без них.
		Монослой на поверхности покровных стекол
		должен стать слитным через 2 суток. Его следует
		оценивать в	инвертном микроскопе. Нельзя

17

Название		Описание
работать с культурой, если среда мутная, щелочная
или	контаминирована.		Следует	подобрать
концентрацию клеток таким образом, чтобы
формирование монослоя происходило через 2
суток. Если крышки культуральных панелей не
обеспечивают герметичность, культуру инкубируют
во влажной атмосфере CO (около 5%) с тем чтобы
регулировать рН.
Клеточный		монослой	можно	формировать
непосредственно на дне лунки панели. Отсутствие
подложки		увеличивает	площадь	монослоя,
упрощает процесс его снятия при проведении
пассажей. При наличии погружного объектива
индикацию хламидий можно выполнять в лунках
панелей.

Образцы биологического материала, если они были заморожены, оттаивают на водяной бане при 37°С. Во флаконы, содержащие клинический материал, добавляют по 2–3 мл изолирующей среды.

Для придания образцам однородности их встряхивают на шейкере.

Маркируют лунки панелей.

Перед заражением из лунок с монослоем McCoy линии L-929, Hela и др. удаляют ростовую среду. Для повышения чувствительности культуры клеток к хламидиям можно проводить предварительную обработку клеток DEAE-декстраном.

После удаления ростовой среды проводят Процедура анализа инокуляцию образцов и контролей на монослой в количестве 0,5 мл на лунку панели. Панель помещают в центрифугу с горизонтальным ротором и центрифугируют при 2500-3000 оборотов течение

1часа. Необходимая температура (33-35°С) в центрифуге обычно достигается от выделения тепла самим ее механизмом при такой скорости. Центрифуга может быть подогрета холостым ходом или обдувом горячим воздухом.

После центрифугирования зараженную культуру на

2часа помещают в СO2 инкубатор (или эксикатор) при 37°С.

Удаляют инокулят, после чего в каждую лунку или флакон вносят по 1-2 мл изолирующей среды с

18

Название					Описание
	циклогексимидом. Панели инкубируют в СO2-
	инкубаторе в течение 24-72 часов, а флаконы
	помещают в обычный термостат на этот же период.
	Исследование			зараженной			культуры		проводится
	после		24-часового			инкубирования				при
	использовании			иммунофлуоресцентного метода и
	спустя 48-72 часа при использовании окраски по
	Романовскому – Гимза.
	Оценка		полученных				результатов			может
	проводиться одним из следующих методов: окраска
	по Романовскому – Гимза.
	Готовый жидкий краситель перед окрашиванием
	мазков разводят из расчета 1–2 капли красителя на
	1	мл	дистиллированной					воды.		Мазки,
	фиксированные в метиловом спирте, окрашивают
	раствором (1 мл готовой жидкой краски + 2 мл
	основного буферного раствора + 47 мл
	дистиллированной воды)					в	течение		40–120 мин.
	(продолжительность				окрашивания				подбирают
	эмпирически)			при	37°С		во	влажной		камере
	(закрытая чашка Петри с увлажненным фильтром
Учет и оценка	на дне). После окрашивания мазки промывают в
результатов	проточной воде и высушивают на воздухе.
	Препарат микроскопируют, начиная с малого
	увеличения (объектив х10), затем переводят на
	большое увеличение (объектив х40), затем
	используют			иммерсию				(объектив		х100
	иммерсионный), окуляр х7 или х10.
	При детекции с использованием окраски по
	Романовскому – Гимза в зараженной культуре
	выявляются			включения			элементарных			телец
	хламидий в виде нескольких, обычно зернистых,
	микроколоний сине-фиолетового цвета; выявление
	хламидий		с	помощью		иммунофлуоресцентного
	метода		проводится			согласно			инструкции
	производителя к прилагаемой тест-системе.
Заключение	Возбудитель C.trachomatis, выявлен.
лабораторного	Возбудитель C.trachomatis, не выявлен.
исследования

На преаналитическом этапе оценивается:

Контроль качества —взятие биологического материала в соответствии с требованиями;

19

Название	Описание
—выполнение требований хранения и доставки
материала в лабораторию;
—выполнение требований маркировки проб и
соответствия	маркировки	пробы	маркировке
направления;
—контроль	растворов	красителей	(внешнее
состояние, срок годности), условия и сроки
хранения;
—контроль транспортных и питательных сред,
реагентов (внешнее состояние, срок годности),
условия и сроки хранения;

качество лабораторной посуды.

Мероприятия аналитического этапа:

—включение официально зарегистрированных контрольных материалов;

—соблюдение технологии окраски в соответствии с инструкцией производителя;

—контроль качества среды;

—учет результатов в соответствии с официально признанными критериями.

Мероприятия постаналитического этапа:

—правильность внесения результатов в бланк исследования и формулировка лабораторного заключения;

—своевременное доведение информации до врача, назначившего исследование.

	Нарушение техники взятия, правил хранения и
	транспортировки клинического материала. Техника
	взятия	материала,		правила		хранения		и
	транспортировки		биологического				материала
	должны проводиться в строгом соответствии с
Перечень	Приложением 2 настоящей инструкции.
возможных	Неудовлетворительное			техническое			состояние
ошибок при	оборудования. Оборудование, используемое для
выполнении и	проведения культуральных исследований, должно
пути их	иметь	соответствующие			сертификаты			о
устранения	государственной		поверке		и	метрологической
	аттестации.
	Нарушение методики			проведения культурального
	исследования, окраски по Романовскому – Гимза,
	ПИФ. Проведение культурального исследования с
	последующей окраской по Романовскому – Гимза

20