6 курс / Клинические и лабораторные анализы / Руководство_ВОЗ_по_исследованию_и_обработке_эякулята
.pdfПриложение 2 Оборудование и безопасность 249
При работе с ВИЧ-инфицированными образцами спермы выполняют тепловую инактивацию.
•Суховоздушная стерилизация в течение 2 ч при температуре 170о С (340о F). Накройте контейнер фольгой, чтобы избежать охлаждения до начала работы.
•Стерилизация паром (автоклавирование) в течение 20 мин при температуре 121о С (250о F) при давлении 101кПа (15 psi или 1 атм) выше атмосферного.
•Продолжительное кипячение в течение 20–30 мин.
A2.5 Безопасность и меры предосторожности при работе с жидким азотом
•Манипуляции с жидким азотом опасны. Всегда работайте с ним аккуратно, используйте только сертифицированные емкости и не пытайтесь плотно закрыть сосуды. Используйте щипцы для извлечения образцов, погруженных в жидкий азот.
•Защищайте глаза специальным экраном или защитными очками. Защищайте руки просторными сухими кожаными или изоляционными перчатками. Носите закрытую обувь.
•Если жидкий азот проливается на поверхность, он распространяется на большой площади, и поэтому охлаждает большие области. Объекты мягкие и гибкие при комнатной температуре становятся жесткими и хрупкими при температуре жидкого азота.
•Экстремально низкая температура может нанести серьезный вред. При попадании на кожу азот может вызвать ожог. Газ, выпускаемый из сосуда с жидким азотом, очень холодный. Слизистые оболочки,
такие как у глаза, могут повреждаться даже при недлительном контакте с газом, который не воздействует на кожу лица и руки.
•Дождитесь прекращения бурления и разбрызгивания жидкого азота, а также выделения холодного газа. Бурление и разбрызгивание всегда происходят, когда наполняется теплый контейнер или объекты не уравновешены в азоте. Всегда выполняйте манипуляции медленно для минимизации бурления и разбрызгивания.
•Избегайте контакта с неизолированными трубками с жидким азотом. Никогда не прикасайтесь никакой частью тела к неизолированным трубкам и сосудам, содержащим жидкий азот. Экстремально холодный металлический стержень может воткнуться быстро, и будут нанесены повреждения на тело при попытке достать стержень.
•Работайте в хорошо проветриваемых помещениях. Небольшое количество жидкого азота формирует большое количество газа (при комнатной температуре девять объемов газа на один объем жидкости). Если газ испаряется из жидкого азота в закрытом помещении, процент кислорода в воздухе может снизиться и возникнет риск удушья. Коммерчески доступны кислородные датчики, которые предупреждают, когда
251
ПРИЛОЖЕНИЕ 3 Микроскопия
Наилучшим источником информации по конкретному микроскопу служит руководство пользователя, которое включает описание всех частей прибора. Если такое руководство недоступно, возможно получить информацию о настройке микроскопа и его использовании в сети Интернет.
Для методов оценки эякулята, описанных в данном Руководстве, рекомендуется использовать фазово-контрастный микроскоп. Микроскоп с источником света не ниже 50 Вт, предпочтительно бинокулярный (имеет два окуляра), с фазовым конденсором и фазовыми объективами ×10, ×20 (или ×25) и ×40 (или ×63) (для общей оценки, подвижности, жизнеспособности и подсчета сперматозоидов и клеток эякулята, отличных от половых), а также световой иммерсионный объектив ×100 (для оценки морфологии и жизнеспособности сперматозоидов). Линзы с отрицательным фазовым контрастом могут понадобиться для анализа жизнеспособности и некоторых модулей CASA, а флуоресцентные линзы (фильтры) необходимы для флуоресцентной микроскопии.
•Качество и стоимость объективов широко варьирует (см. Бокс А.3.1). Более дорогие объективы дают более хорошее изображение, но и недорогие объективы могут быть пригодны.
•Сетки на окуляр (сетки, координатные сетки, микрометры) представляют собой стеклянные диски со шкалой, известного размера, обычно 5 или 10 мм, или сетки различных форм, покрытые шкалами. Некоторые окуляры имеют нанесенную расчетную сетку; другие могут откручиваться для вставки сеток. Сетки доступны различных диаметров, что позволяет добиться совмещения сетки и окуляра. Их можно откалибровать с помощью микрометра предметного столика для определения размеров сперматозоида. Также их можно использовать для ограничения поля зрения при оценке подвижности сперматозоидов.
Одна из сеток, показанная на Рис. 2.4(а) и Рис. А7.4(а), имеет размер 5 × 5 мм, что является хорошим размером для оценки подвижности сперматозоидов при увеличении как ×20, так и ×40. Некоторые исследователи предпочитают сетки размером 10 × 10 мм для оценки кон-
центрации и морфологии сперматозоидов.
•Микрометр для предметного столика — модифицированное предметное стекло для микроскопии со шкалой, нанесенной на его поверхность, обычно 1 мм, поделенный на отрезки по 10 мкм. Микрометр предметного столика используют для калибровки микрометра окуляра или координатной сетки и измерения расстояний, например, для расчета подвижности (см. Рис. А7.5).
Процедура, описанная ниже, обеспечит наилучшее изображение с микроскопа. Если поток света как следует выровнен и отрегулирован, изображение будет четким, резким и, вероятно, не вызовет напряжение глаз. Следующую процедуру необходимо выполнить при использовании нового микроскопа или если получено изображение плохого качества.
Приложение 3 Микроскопия 253
Ph, Ph1, Ph2, Ph3, NP, N: указывает, что линзы имеют фазовое кольцо. Ph — положительные фазовые кольца, NP или N — отрицательная фаза. Ph1, Ph2 и Ph3 — каждая линза требует различные фазовые кольца в конденсоре. Оптика с положительным фазовым контрастом позволяет наблюдать внутриклеточные структуры (используется при влажных препаратах и для расчета подвижности). При этом негативный фазовый контраст дает белое изображение на темном фоне (используется на влажных препаратах для расчета жизнеспособности и CASA).
Imm, immersion, oil, W: указывает на линзы, разработанные для работы с жидкостями — чаще всего с маслом, водой (W) или глицерином — между объектом и линзой для обеспечения более четкого изображения (если не указано обратное, линза считается «сухой» и не следует использовать никакую жидкость).
Iris: указывает на линзу с ирисом, управляемую кольцом.
Corr: указывает на линзу с нанесенным коррекционным кольцом, которое позволяет использовать иммерсионную среду с различными индексами преломления.
160, ∞: длина трубки или расстояние между окуляром и объективом. Обычно составляет 160 мм, однако в современных линзах может быть равно бесконечности (∞).
0.17, – : толщина покровного стекла, необходимого для объектива. Покровные стекла номер 1,5 (толщина 0,16–0,19 мм) являются универсальными и пригодны для большинства исследовательских задач. Гемоцитометр требует покровных стекол номер 4 (толщина 0,44 мм). Знак «–» означает, что толщина покровного стекла неважна или что иммерсионная среда может быть добавлена непосредственно на предметное стекло.
WD: рабочее расстояние; расстояние от переднего элемента линзы объектива до ближайшей поверхности покровного стекла, где образец находится в фокусе. Рабочее расстояние в общем случае снижается с повышением увеличения и числовой апертуры, рабочее расстояние может быть нормальным (до 5 мм), длинным (5.25–9.75 мм), экстра длинным (10–14 мм) и супер длинным (15–30 мм). Некоторые микроскопы могут использовать линзы с длинным рабочим расстоянием при работе с улучшенной камерой Нэйбауера.
Показатель преломления: величина фазового преломления света при его прохождении через среду. Показатель преломления (RI, h, eta — эта) вакуума равен 1,0000, воздуха — приблизительно 1,0 (1,0008), воды — 1,33, глицерина — 1,47, а большинства иммерсионных масел
— 1,515. Установочная среда после высыхания имеет сходный показатель преломления (1,488–1,55) с показателем стекла (1,50–1,58).
Приложение 3 Микроскопия 255
маленьким и четким. Эта позиция будет в общем случае достижима, когда конденсор находится в самом верхнем положении. Края светового пятна могут меняться от голубого до красного, так как конденсор сфокусирован (хроматическая аберрация), а края конденсора будут оставаться немного размытыми. Свет может быть как центрирован, так и нет.
Важно: Если апертура поля не имеет ирисовую диафрагму, фокусируйтесь на резкость объекта (то есть карандашная точка), помещенного в световое поле.
A3.6 Центрирование конденсора
•Центрируйте полевую диафрагму с помощью регулятора центрирования конденсора. Обычно есть два (часто с насечками) регулятора, расположенных диагонально, спереди или снизу конденсора.
•Как только световое изображение отцентрировано, откройте полевуюе диафрагму так, чтобы свет падал на поле в виде точки. Не открывайте область диафрагмы за эту точку.
•Закрывайте апертуру конденсора до тех пор, пока не исчезнет яркий свет.
Важно: Сразу за правым регулятором центровки находятся небольшие шурупы, которые фиксируют конденсор. Будьте аккуратны, не поворачивайте их, когда центрируете конденсор, так как их ослабление может вызвать выпадение конденсора из микроскопа.
A3.7 Регулировка фазовых колец
•Процедуру можно сделать с использованием центрирующего телескопа, доступного у производителя микроскопа.
•Вставьте подходящее фазовое кольцо в конденсор с соответствующим объективом.
•Удалите один окуляр и замените его центрирующим телескопом. Сфокусируйте кольцо центрирующего телескопа, удержанием основания одной рукой и вращением вверх другой рукой, пока не увидите сквозь него изображение. Поворачивайте до тех пор, пока два кольца не будут точно в фокусе: одно кольцо темное (фазовое кольцо), а другое — светлое (световое кольцо).
•Откалибруйте кольца таким образом, чтобы они были концентрическими, путем вращения регулятора настройки фазы, расположенного на фазовом конденсоре. Эти регуляторы обычно расположены сзади конденсора.
•Замените центрирующий телескоп окуляром микроскопа.
257
ПРИЛОЖЕНИЕ 4 Приготовление основных растворов
Для приготовления всех растворов требуется дистиллированная вода (дистиллированная, дважды дистиллированная или деионизированная).
A4.1 Раствор BWW (Biggers, Whitten, Whittingham)
BWW основной раствор (Biggers et al., 1971)
1.К 1000 мл дистиллированной воды добавить 5,54 г хлористого натрия (NaCl), 0,356 г хлористого калия (KCl), 0,294 г гептагидрата сульфата
магния (MgSO4.7H2O), 0,250 г дигидрата хлористого кальция (CaCl2.2H2O) и 0,162 г дигидрата фосфата калия (KH2PO4).
2.Доведите pH до 7.4 с помощью 1 моль/л гидроксида натрия (NaOH).
3.Добавьте 1,0 мл (0,04%, 0,4 г/л) фенола красного на литр раствора.
Важно: Этот раствор может храниться в течение нескольких недель при температуре 4о С.
BWW рабочий раствор.
Для использования в течение 1 дня:
1.Смешайте 100 мл основного раствора с 210 мг бикарбоната натрия
(NaHCO3), 100 мг D-глюкозы, 0,37 мл 60% (v/v) сиропа лактата натрия, 3 мг пуривата натрия, 350 мг фракции V альбумина бычьей сыворотки,
10 000 единицами пенициллина и 10 мг сульфата стрептомицина.
2.Нагревайте при 37о С до использования в атмосфере 5% (v/v) CO2, 95% (v/v) воздуха.
Важно 1: Для инкубации на воздухе: добавьте 20 ммоль/л раствора Hepes (соль Na:5,21 г/л) и уменьшите содержание NaHCO3 до 0,366 г/л.
Важно 2: Для градиента плотностей (см. Раздел 5.5.1): подготовьте 10-кратный концентрированный основной раствор, используя 10 раз компоненты раствора по весу за исключением фенола красного.
После приготовления градиента добавьте 100 мл, как указано выше.
A4.2 Фосфатно-солевой буфер Дульбеко (PBS)
1.PBS: к 750 мл дистиллированной воды добавить 0.2 г хлорида калия
(KCl), 0,2 г дигидрата фосфата калия (KH2PO4), 0,1 г гексагидрата хлорида магния (MgCl2.6H2O), 8,0 г хлорида натрия (NaCl), 2,16 г гептагидрата фосфата натрия (Na2HPO4.7H2O) и 1,00 г D-глюкозы.
2.Растворите 0.132 г дигидрата хлорида кальция (CaCl2.2H2O) в 10 мл дистиллированной воды и медленно добавьте раствор, описанный
выше, перемешивая.
