Таблица 1.
Классификация ингибиторов канцерогенеза
Уровень |
Фазы |
|
Пути влияния |
||
воздействия |
воздействия |
|
(механизмы) |
||
|
|
Ингибирующее эндогенное образование мутаге- |
|||
Внеклеточный |
Прединициа- |
нов/канцерогенов |
|
||
Препятствующие достижению КГ клеток- |
|||||
уровень |
ционные события |
||||
мишеней |
или |
способствующие |
|||
|
|
выведению КГ из организма |
|
||
|
|
Модулирующие метаболические |
|||
Внутриклеточ- |
Фаза инициации |
процессы |
|
|
|
ный |
Блокирующие реактивные состояния |
||||
канцерогенеза |
|||||
уровень |
Влияющие на репарацию и репликацию ДНК, |
||||
|
|||||
|
|
генную экспрессию |
|
||
|
Фаза промоции |
Ингибирующие опухолевую промоцию |
|||
Межклеточный |
|
Тормозящие опухолевую прогрессию и преду- |
|||
уровень |
Фаза прогрессии |
преждающие инвазию и метастазирование зло- |
|||
|
|
качественных клеток |
|
||
Эта классификация отражает временной и пространственный аспекты канцерогенеза и соответственно действия ингибиторов, а также механизмы ингибирования. Необходимо сразу обратить внимание на 2 важных обстоятельства. Во-первых, в реальной ситуации в отличие от модельных экспериментов на животных, человек, как правило, одновременно подвергается воздействию ингибиторов и промоторов канцерогенеза. В его организме постоянно появляются и элиминируются иммунной системой трансформированные клетки. Поэтому провести четкую грань между отдельными фазами канцерогенеза на практике почти невозможно за исключением некоторых ситуаций. Т.е. временные аспекты ингибирования канцерогенеза весьма расплывчаты. Во-вторых, одни и те же соединения, используемые или испытываемые в качестве ингибиторов, могут обладать многосторонними и даже разнонаправленными свойствами, например, тормозить возникновение опухолей в одном органе под действие одного КГ и стимулировать возникновение опухолей в другом органе под действием того же или другого КГ. И тем не менее, при анализе групп ингибиторов, или правильнее сказать, модификаторов канцерогенеза, мы будем пользоваться классификацией В.В. Худолея, как наиболее удобной.
Ниже будет перечислено большое количество разнообразных соединений, модифицирующих канцерогенез. Многие из них при опреде-
49
ленных условиях стимулируют возникновение и прогрессию опухолей. Большинство исследовано только на экспериментальных моделях in vitro и in vivo. На первый взгляд такое детальное перечисление не вполне уместно для практикующих врачей. Однако часто возникают ситуации, когда на основе только экпериментальных или малопроверенных клинических данных некоторые “целители” навязывают обществу или отдельным гражданам то или иное вещество, выдавая его чуть ли не за панацею от рака, да еще и преследуя при этом корыстные цели. Поэтому знание этих веществ полезно, даже если они заведомо никогда не будут использоваться в клинике, для того чтобы не идти на поводу у таких полуграмотных “целителей” и ограждать от них своих будущих пациентов. Другие препараты, наоборот, широко применяются во врачебной практике при лечении разнообразных заболеваний. И поэтому их способность модифицировать канцерогенез, в т. ч. стимулировать его, должна учитываться врачами, особенно при постоянном длительном использовании.
Химические соединения, взаимодействующие с генотоксикантами вне клетки, принято называть «десмутагенами». Внеклеточное перехватывание мутагенов экскреторными ферментами или иными агентами, связывающими мутагены и т.о. препятствующими достижению ими клетокмишеней, является важным моментом в защите организма от мутагенных и КГ веществ. К таким агентам относят гумиковую кислоту, экстрацеллюлярный глутатион, некоторые биофлавоноиды, эрготионеин, циннамальдегид, гемин, хлорофиллин.
В выведении мутагенов и КГ из организма принимают участие пищевые волокна, обладающие сорбентной способностью. Они содержатся в овощах, фруктах и действуют различными путями. В частности водонерастворимые пищевые волокна, присутствующие в больших количествах в пшенице и рисе, не метаболизируются ферментами кишечной флоры, они задерживают воду, “разводя” КГ и снижая тем самым частоту возникновения рака кишечника. Водорастворимые пищевые волокна, содержащиеся во фруктах, овощах и в овсе, снижают частоту возникновения рака молочной железы, как предполагают путем включения каких-то эндокринных механизмов.
Среди соединений, модифицирующих мутагенез и канцерогенез на внеклеточном уровне или влияющих на фазу прединициации, наиболее изучены ингибиторы эндогенного образования генотоксикантов. Установлено, что активированные макрофаги и бактерии могут продуцировать КГ нитрозосоединения из химических предшественников. Эндогенное нитрозирование происходит на фоне воспалительных процессов в ротовой поло-
50
сти, желудке, мочевом пузыре. В многочисленных экспериментах показано, что аскорбиновая кислота, биофлавоноиды (катехин), полифенолы (гидроксичавикол, танниновая кислота, токоферол), куркумины, тиопролин тормозят нитрозирование. Важно отметить, что независимые эпидемиологические исследования на больших контингентах добровольцев доказали роль подобных ингибиторов (главным образом, аскорбиновой кислоты и токоферола), свежих овощей и фруктов, содержащих полифенолы и витамины, в достоверном снижении риска возникновения раков ЖКТ и других локализаций. Весьма сильные ингибиторы содержаться в яблоках, имбире, зеленом чае, капусте, ананасе, зеленом перце, репейнике, листьях мяты, семенах некоторых растений и других природных источниках. Интересно, что никотин, котинин и норникотин и даже водный экстракт сигаретной смолы ингибируют бактериальный мутагенез и хромосомные нарушения в культуре животных клеток под действием некоторых КГ, содержащихся в табачном дыме.
Среди модификаторов канцерогенза на внутриклеточном уровне в фазе инициации выделяются несколько групп соединений, модулирующих метаболические процессы. Напомним, что нативные КГ, т.н. проКГ подвергаются в организме радикальной биотрансформации. Биохимические реакции, протекающие в 1 фазе биотрансформации КГ, ведут к образованию новых реакционно-способных радикалов. Ферменты 11 фазы биотрансформации обеспечивают конъюгирование радикальных группировок с некоторыми эндогенными соединениями (главным образом с глутатионом) и т.о. инактивируют генотоксичные метаболиты и способствуют их экскреции. Соответственно модуляция метаболических процессов может осуществлятся индукторами или ингибиторами ферментов 1 или 11 фазы биотрансформации.
Индукторами ферментов 1 фазы биотрансформации являются фенобарбитал, арокрол, дибенамин, метилхолантрен, аминоацетонитрил, прегненолон-16-а-карбонитрил, дисульфирам, бутилгидроксианизол и бутилгидрокситолуол, бензил- и фенилизотиоцианаты, индол-3-карбинол и другие. Они модифицируют канцерогенез, вызванный различными веществами, что проявляется в основном в уменьшении частоты возникновения новообразований у животных. Анти-КГ действие этих соединений объясняется увеличением скорости процессов микросомного окисления с одновременной стимуляцией ферментов конъюгации 11 фазы. Это приводит к сокращению персистенции реактивных метаболитов в организме, их обезвреживанию и элиминации, а следовательно и к уменьшению вероятности их взаимодействия с ДНК, РНК и белками. Однако, одновременное и рав-
51
новеликое, сбалансированное усиление процессов окисления и конъюгации под действием одного и того же индуктора ферментов 1 фазы наблюдается не для всех КГ и не во всех органах и тканях. Например, фенобарбитал тормозит образование опухолей в легких, вызываемых уретаном, метилхолантреном, диметилбензо(а)антраценом, а также опухолей печени, вызываемых 2-ацетил-аминофлуореном, афлатоксином и нитрозодиэтиламином. В то же время фенобарбитал не влияет на развитие опухолей печени, вызванных азокрасителями, и увеличивают частоту рака молочной железы при воздействии нитрозодиметиламина. Бутилгидрокситолуол и бутилгидроксианизол ингибируют развитие опухолей печени, но усиливают канцерогенез в мочевом пузыре. Поэтому применение агентов, избирательно стимулирующих ферменты 1 фазы биотрансформации КГ, в качестве антиканцерогенов пока вызывает большие сомнения.
Кингибиторам ферментов 1 фазы метаболизма КГ (цитохромов Р-
450)относятся: 1-арилимидазол, гидразинсульфат, препарат SKF - 525А, антиоксидант припилгаллат, метирапон, а также некоторые индукторы микросом, которые в высоких концентрациях оказывает противоположное действие: дисульфирам, аминоацетонитрил, бензонафтофлавон, 5,8- бензофлавон. Кроме того, известны ингибиторы и других ферментов 1 фазы биотрансформации. Эстеразы угнетаются диэтил-п- нитрофенилфосфатом; ксантиноксидаза-аллопуринолом; фосфолипаза - гидрокортизоном и дексаметазоном; простагландинсинтетазаиндометацином и аспирином. Указанные агенты широко модифицируют канцерогенез, тормозя или стимулируя его в зависимости от того, на каком этапе их применяют, каковы структура, органотропность и особенности действия КГ. Поэтому вопрос об их применении для профилактики рака у человека остается открытым.
Специфическими индукторами ферментов 11 фазы метаболизма КГ являются дитиолтионы, в частности олтипраз. Он повышает активность глутатион - S-трансферазы, которая конъюгирует реакционноспособные группировки метаболитов КГ с глутатионом. Подобным же образом действует и эрготионин, пока еще мало изученный. N-ацетил-цистеин, будучи предшественником глутатиона, тоже эффективно тормозит мутагенез и канцерогенез в различных модельных системах. Однако есть мнение, что модификаторы ферментов 11 фазы метаболизма способны усиливать манифестацию поздних стадий канцерогенеза. Последнее обстоятельство исключает их широкое практическое применение у человека.
Способностью угнетать активность ферментов 11 фазы био-
трансформации КГ обладают некоторые тиоловые агенты, бутионин,
52
сульфоксимин, этакриновая кислота и другие. Они интересны только с теоретической точки зрения, т.к. торможение процессов конъюгации реакционно способных группировок неизбежно приводит к накоплению генотоксических метаболитов в клетке, т.е. к стимуляции канцерогенеза.
Следующая группа агентов, претендующих на роль ингибиторов канцерогенеза - это вещества, блокирующие взаимодействие реактивных метаболитов и свободных радикалов с ДНК. Известно, что в процессе метаболизма КГ или их спонтанной неэнзиматической декомпозиции образуются электрофильные соединения. Они взаимодействуют с нуклеофильными центрами на ДНК и т.о. повреждают ее, вызывают мутации. Свободные радикалы продуцируют перекисное окисление липидов, продукты которого (малоновый альдегид, гидроперекиси жирных кислот) тоже обладают мутагенными свойствами. В качестве перехватчиков электрофильных соединений, которые способны экранировать ДНК, используют аскорбиновую кислоту, полисахариды, глутатион, тиоловые эфиры, тиосульфаты, дисульферам, флавоноиды. По антиоксидантному механизму на стадии инициации действуют аскорбиновая кислота, токоферол, ретиноиды, бутилгидрокситолуол и бутилгидроксианизол, эусенол, L-карнозин, имидазол-4-уксусная кислота, полиамины, таурин, кверцитин, N- ацетилцистеин, селен. Однако большинство результатов по антимутагенному действию этих соединений получено в экспериментах in vitro, данные хронических опытов на животных часто противоречивы. Более того, для многих из них характерна инверсия эффекта с протекторного на генотоксический или опухолепромоцирующий. Это является серьезным препятствием для их практического применения в качестве ингибиторов канцерогенеза.
Угнетение канцерогенеза в фазе инициации возможно путем воздействия на системы репарации ДНК. Восстановление ДНК после повреждений осуществляется с помощью нескольких механизмов, в которых участвуют разнообразные репаративные ферменты, контролируемые различными генами. И ферменты и соответствующие гены охарактеризованы недостаточно. И хотя исправление повреждений ДНК на этом этапе инициации представляется более перспективным с теоретической точки зре-
53
ния, чем многие другие способы коррекции, к настоящему времени пока мало даже экспериментальных данных о возможности отбора анти-КГ из этой группы. Имеются сведения об активации систем восстановления ДНК под действием небольших доз УФ- и гамма-лучей, флеомицина, мексамина, интерферона, бета-лапашона, N-аденозил-N-метионина циннамальдегида, хлорида кобальта, полифенолов (таниновой, галликовой, эллагиновой кислот), бутирата натрия и ретиноевой кислоты.
Вероятно, в будущем методы генной инженерии позволят вмешиваться в процессы регуляции генов, ответственных за репаративные функции клетки, с целью коррекции канцерогенеза. Это же замечание полностью относится и к генам, контролирующим ферменты биотрансформации КГ и антиокислительные энзимы, такие как супероксиддисмутаза.
Способностью ингибировать промоцию обладают следующие группы веществ:
агенты, нормализующие процессы дифференцировки (бета-каротин, бутират натрия, инозим, витамин А, синтетические ретиноиды);
нестероидные противовоспалительные средства (вольтерен, индометацин, ортофен);
антиоксиданты (бутилгидрокситолуол и бутилгидроксианизол, токоферол, эпигаллокатехингаллат, саркофитол А);
ингибиторы протеинкиназы С (сфинголипиды);
ингибиторы протеаз (лейпептин, антипаин, эпсилон-аминокапроновая кислота);
полиамины (путресцин);
антиэстрогены (тамоксифен):
антипролиферативные агенты (эфлорнитин);
ингибиторы фосфоэстеразной активности (теофиллин, пентоксифиллин);
гипохолестеринэргики (мисклерон);
транквилизаторы (диазепам, дифенин, карбонат лития);
антидиабетические препараты (фенформин);
другие (малотодиапамин, 3-метил-3 гидроксишалкон).
54
Антипромоторы могут найти применение и в период прогрессии опухолей, т.е. проявить свойства антипрогрессоров, как компонент противорецидивной, антиинвазивной и антиметастатической терапии. В качестве примера необходимо отметить работы, выполненные под руководством проф. Б.М. Клячкина в 80 гг. Так, в экспериментах по химически индуцированному канцерогенезу и на моделях перевивных опухолей у мышей было показано протективное действие таких НПВС как мефенаминовая кислота, оксиферрискарбон, делагил, а также ингибиторов протеазгордокса и контрикала. Было зафиксировано удлиннение латентного периода возникновения опухолей, индуцированных метилхолантреном, уменьшение инвазии и метастазирования перевивных опухолей, Акатол, ММТ-1, карциномы Льюис и меланомы В-16. Более того, зафиксированы и положительные клинические эффекты у отдельных инкурабельных больных раком легкого и меланомой.
Однако, некоторые антиКГ, проявляющие положительную активность в фазе инициации, способны активизировать уже иницированные клетки, т.е. демонстрируют опухолепромоцирующие свойства, как, например, некоторые оксиданты. Это обстоятельство заставляет с осторожностью относится к применению подобных препаратов без специальных показаний.
Все изложенное выше позволяет заключить, что ингибирование начальных фаз канцерогенеза может быть осуществлено различными путями. Вместе с тем, такие вмешательства не являются избирательными, их направленность зависит от химической структуры и особенностей действия отдельных КГ, эффектов дозы, времени, порядка экспозиции, множественности КГ влияния, а также характеристики генотипа и эпигенетических особенностей организма. Принимая это во внимание, можно постулировать, что искать единые, универсальные для любого человека пути ингибирования канцерогенеза вряд ли целесообразно. И хотя имеющиеся к настоящему времени данные по ингибиции канцерогенеза носят в основном экспериментальных характер, все же разработка методов химиоприфилактики рака у человека является перспективной.
55
Все большую популярность в качестве антиканцерогенов приобретают препараты природного происхождения:
выделенные из лекарственных растений (лабазник вязолистый, солодка голая и уральская, крапива двудомная, подорожник большой, береза повислая, левзея сафлоровидная, элеутерококк колючий, женьшень);
выделенные из клеточных культур лекарственных растений (биоженьшень, панаксел);
биологически активные пищевые добавки (кламин - таблетированный препарат на основе концентрата ламинарии омыленной, фиточай “Соло” из сбора лабазника, солодки, крапивы, подорожника и березы, по- лиен-капсулы с концентратом из рыбьего жира, фибромед - на основе отрубей пшеничных пищевых);
другие природные вещества (хвойный натуральный комплекс, оксигумат торфяной, мумие и т.д.)
Внастоящее время проводятся десятки эпидемиологических исследований, ищущих подтверждение антиКГ свойств разнообразных препаратов природного происхождения.
На фармацевтическом рынке появилось много комплексных препаратов, претендующих на роль антиКГ средств. Например, словенская фирма KRKA предлагает “Триовит”, в состав которого входят витамины С и Е, бета-каротин (провитамин А) и селен. Вит. С действует в качестве биоантиоксиданта в гидрофильной среде клетки, а также и по другим путям влияния на канцерогенез. Вит. Е (токоферол) и бета-каротин действуют в качестве биоантиоксидантов в липофильной среде и тормозят свободнорадикальные процессы в клеточных мембранах. Селен входит в состав фермента глутатион-пероксидазы и защищает липиды клеточных мембран от реактивных кислородных соединений.
Помимо перечисленных подходов к химиопрофилактике рака в настоящее время начата разработка принципиально новых методов, в часности, создание антиканцерогенных вакцин.
КГ, будучи низкомолекулярными соединениями, сами по себе не способны вызывать специфический иммунный ответ. Но после ковалентного присоединения к макромолекулярному носителю они становятся гап-
56
тенами, т.е. приобретают свойство индуцировать синтез специфических АТ. Впервые конъюгаты КГ с белками были синтезированы в 1937 г. в Канаде. Ученые Creech H. и Franks W. иммунизировали крыс таким конъюгатом и обнаружили некоторое угнетение возникновения и роста опухолей, индуцированных КГ, входящих в состав конъюгата. И только в начале 70-х годов ученые США вновь вернулись к эти разработкам, подтвердили анти-КГ эффект иммунизации животных конъюгатом КГ-белок и даже пошли дальше.
Они заменили явный КГ в конъюгате на его химический аналог, не обладающий КГ активностью. Анти-КГ эффект после предварительной иммунизации таким комплексом сохранялся. Впервые была высказана идея о возможности анти-КГ вакцинации человека с помощью не КГ аналогов.
Ближе всех к решению этой проблемы подошли ученые Университета Бордо (Франция). В начале 90-х годов они получили моноклональные анти-идиотипические АТ к КГ. Технология была такова. Сначала иммунизировали кролика конъюгатом бензопирен-белок и выделяли из его крови АТ к БП. Такие АТ называли АТ 1. Затем АТ 1 иммунизировали чистолинейных мышей и выделяли из их селезенки клоны лимфоцитов, секретирующих АТ против АТ 1. Отбирали из этих клонов те, которые секретировали АТ, способные конкурировать с БП за связывание с АТ 1. Такие мышиные АТ называли АТ 2. Этими АТ 2 иммунизировали крыс и вводили им БП. Контрольных крыс иммунизировали мАТ другой специфичности. У опытных крыс развивался иммунный ответ на БП и одновременно - устойчивость к БП. Опухоли под действием БП появлялись не у всех крыс, и латентный период канцерогенеза был значительно длиннее, чем в контроле. Иными словами, АТ 2 несли в себе внутренний иммунологический образ КГ, не являясь самим КГ.
Учитывая то, что анти-идиотипические мАТ мышей , как группа фармакологических препаратов, уже применяются в клинической практике, в т.ч. для лечения онкологических заболеваний (см. лекцию 6), использование анти-КГ мАТ 2 в качестве анти-КГ вакцин у человека представляется весьма перспективным. Этот подход используется нами, в Отделе иммунологии рака КемНЦ СО РАН, в создании новой технологии профилактики рака у человека, основанной на повышении иммунохимической устойчивости к КГ окружающей среды.
57
Лекция 5. ОПУХОЛЕВЫЕ МАРКЕРЫ
В предыдущих лекциях мы останавливались на методах исследования канцерогенеза в фазе индукции-промоции. Определение параметров индивидуальной чувствительности к канцерогенам окружающей среды и генетической предрасположенности к раку относится к новой области онкологии, которая получила название молекулярной онкоэпидемиологии. Несмотря на важность этих методов в плане определения показаний и противопоказаний для химио-, иммуно- и генопрофилактики рака, а также для лабораторной оценки эффективности этих и других превентивных мероприятий, методы молекулярной эпидемиологии еще не нашли широкого применения в клинике. Во-первых, потому, что сами технологии профилактики канцерогенеза еще недостаточно апробированы и их место в противораковых мероприятиях не определено. Во-вторых, практикующие врачи-онкологи имеют дело с опухолевыми заболеваниями в фазе прогрессии. У них просто нет нужды в определении чувствительности к КГ и генетической предрасположенности к раку, главноекак можно раньше обнаружить уже возникшую и растущую опухоль и поскорее уничтожить ее. В онкологической клинике обязательны специалисты по хирургии, химио- и лучевой терапии, морфологии, но вы не встретите здесь специалистов по молекулярной биологии, иммунологии, биохимии. И тем не менее мостик в будущее онкологии постепенно формируется. Все более уверенно используются исследования опухолевых маркеров, их ассортимент постоянно расширяется, уточняется их диагностическая и прогностическая значимость, на смену одним приходят другие, более информативные и привлекательные для практикующего врача. В этом разделе онкологии уже достаточно точно определены свои принципы и законы развития. На основании клинического опыта стали понятны реальные возможности анализа опухолевых маркеров и обозначены вероятные перспективы развития. По-видимому, именно через оптимизацию исследования опухолевых маркеров мы перейдем от задач по диагностике и лечению рака к решению задач по прогнозированию и профилактике.
Опухолевые маркеры представляют собой глико- и липопротеины, присутствие и изменение концентрации которых в периферической крови или других биологических жидкостях организма коррелирует с наличием и ростом опухоли. Часто в обозначении опухолевых маркеров наличествует термин “антиген”. Это явление историческое и отчасти методологическое. Отправной точкой поиска веществ, специфичных, харак-
58