3 курс / Фармакология / Фармацевтическая_биотехнология_Технология_производства_иммунобиологических

ции на аппаратах с мембранами с порогом отсечения 15–50 кДа. Процесс осаждения проводят при температуре 4–8 °С.

5.Хроматографические и гельфильтрационные методы очистки на различных сорбентах: катионно- и анионообменных на основе сефадексов (ДЕАЕ (диэтиламиноэтил) – сефадекс; QAE (QAE-аминоэтил-2-оксипропил- аминоэтил) – сефадекс, А-25, А-50; SP (SP-сульфопропил), С-25, С-50; CM (СМ-карбоксиметил ), С-25, С-50; сефадексы G-100 и G-200; ионообменные целлюлозы: карбоксиметилцеллюлоза (КМ-целлюлоза); фосфоцеллюлоза (Ф-целлюлоза); диэтиламиноэтилцеллюлоза (ДЭАЭ-целлюлоза).

6.Для выделения и очистки иммуноглобулинов из крови человека ис-

пользуют также и другие методы, которые сегодня используются в промышленных условиях еще недостаточно широко, а именно: аффинная хро-

матография на различных носителях, способных специфически связывать иммуноглобулины; осаждение иммуноглобулинов ионами металлов: Zn, Cu, Ba, Mn, Ca; очистка с помощью жирных кислот, например, каприловой ки-

слоты; осаждение ионными полимерами, например, поливинилпирролидоном.

Необходимо отметить, что все чаще при выделении иммуноглобулинов используют комбинацию двух или более методов. Для промышленного выделения наиболее активно используют осаждение этиловым спиртом при температуре ниже 0 °С с привлечением хроматографических методов на различных носителях.

Схему получения иммуноглобулина человека нормального для внутримышечного введения спиртовым осаждением можно представить следую-

щим образом:

1.К сыворотке крови человека, охлажденной до температуры 0–2 °С при постоянном перемешивании добавляют, охлажденный до минус 10 °С этиловый спирт до конечной концентрации 8,0 %. В конце осаждения температура смеси должна находиться в пределах от 0 °С до минус 2 °С . На этой стадии происходит осаждение остатков фибриногена, денатурированного белка, тканевых частиц и других нерастворимых примесей. Выпавший балластный осадок удаляют центрифугированием при низких температурах. Важным условием получения стабильных иммуноглобулинов, как на этой стадии, так и на всех последующих, является строгое соблюдение температурных режимов и минимального вспенивания смесей при перемешивании и

центрифугировании. Наиболее интенсивной при перемешивании является зона, которая прилегает к лопастям мешалки и захватывается ими. Подачу спирта осуществляют именно в эту зону для предупреждения денатурации белков за счет высокой концентрации осадителя. Охлажденный спирт поступает в реактор либо самотеком из мерника, расположенного на определенной высоте над реактором (около 0,8–1,0 метра), либо из мерника с помощью дозирующего насоса, снабженного устройством, позволяющим регулировать скорость подачи спирта.

2.Центрифугат охлаждают до температуры минус 3–4 °С и осаждают медленным прибавлением, охлажденного до минус 20 °С этилового спирта до конечной концентрации 25 %. Осаждение проводят в течение 3–4 часов. Конечная температура смеси минус 5–6 °С. Обязательным условием является поддерживание величины рН на уровне 7,1–7,3. Смесь центрифугируют (температура центрифугата на выходе не выше минус 6 °С). Центрифугат используют для выделения альбумина. Осадок (фракция II + III по Кону), содержащий фракцию иммуноглобулинов подвергают дальнейшей очистке.

3.Полученный осадок при 0 °С растворяют в 0,9 % изотоническом растворе хлорида натрия до получения гомогенной суспензии и процесс переосаждения повторяют при тех же условиях (см. п. 2). Получают осадок А1.

4.Осадок А1 растворяют при температуре от 0 °С до минус 1 °С в концентрированном растворе хлорида натрия при ионной силе 0,01, доводят величину рН до 5,0–5,1 (по другим данным оптимальная величина рН – 5,3–5,4)

иосаждают, охлажденным до минус 20 °С этиловым спиртом. Конечная концентрация спирта 17 % и температура минус 5–6 °С. Осаждение проводят в течение 3–5 часов, постепенно увеличивая скорость добавления спирта. Для формирования осадка смесь оставляют при указанной температуре на 10–16 часов. На этой стадии при рН 5,1–5,2 (изоэлектрическая точка альфа- и бетаглобулинов) в осадок выпадают балластные компоненты, потери иммуноглобулиновой фракции незначительны. Смесь центрифугируют при низких температурах. На выходе центрифугат (Б), содержащий иммуноглобулины, должен иметь температуру не выше минус 5 °С.

5.К центрифугату Б, охлажденному до температуры минус 3–4 °С прибавляют концентрированный раствор натрия хлорида до ионной силы 0,05–0,07 и начинают осаждение медленным прибавлением, охлажденного до минус 20 °С этилового спирта до конечной концентрации 25 %. Осаждение

218

219

проводят в течение 3–4 часов. Конечная температура смеси минус 5–6 °С. Обязательным условием является поддерживание величины рН на уровне 7,1–7,3. Смесь центрифугируют (температура центрифугата на выходе не выше минус 6 °С). Осадок содержит иммуноглобулины.

6.Осадок подвергают прессования для удаления остаточного количества спирта, затем растворяют в 0,9 % растворе натрия хлорида и проводят стерилизующую фильтрацию. Стерильный раствор иммуноглобулина выдерживают при комнатной температуре в течение 30–45 суток и при температуре 2–8 °С – 30–45 суток. Указанный срок необходим для формирования осадков небольших количеств лабильных примесей и их последующего удаления фильтрацией. Выпавший осадок удаляют фильтрацией.

7.Раствор иммуноглобулина подвергают диафильтрации на разделительных аппаратах для полного удаления этилового спирта, низкомолекулярных примесей и фрагментов. Устанавливают рН раствора – (7,0 ± 0,4); белок – (10 ± 0,5) %; в качестве стабилизатора прибавляют аминокислоту – глицин в количестве 12–30 мг/мл; подвергают стерилизующей фильтрации. Добавление полярных веществ к раствору повышает диэлектрическую постоянную, что приводит к повышению заряда глобулярного белка и стабильности молекул иммуноглобулинов в растворе. Так, для стабилизации иммуноглобулинов добавляют аминокислоту – глицин в количестве от 1,2 до

3,0 %.

8.Проведение контроля препарата иммуноглобулина в форме in bulk и разлив в первичную упаковку (ампулы или флаконы).

9.Контроль готового препарата.

10.Маркировка и упаковка иммуноглобулина для внутримышечного

введения.

Представленная схема получения иммуноглобулина в различных вариантах сегодня используется большинством производителей препаратов крови

ипо праву может считаться «классической». Однако и ей присущи определенные недостатки: большой расход этилового спирта, соблюдение низкотемпературных режимов и, что наиболее важно потеря иммуноглобулинов (до 50 %) в процессе фракционирования. В связи с этим в течение всех 50 лет использования метода Кона проводятся работы по увеличению выхода иммуноглобулинов за счет введения в технологию дополнительных стадий. Для понимания технологических потерь в табл. 15 приводятся данные по содержанию иммуноглобулинов в плазме и фракциях, полученных при спиртовом осаждении.

Таблица 15 – Содержание IgG, IgA и IgM в плазме крови человека и фракциях при спиртовом осаждении

		Содержание иммуноглобулинов в				%
№	Фракции	граммах в пересчете на 1 литр			от содержания
п/п		исходной плазмы				в плазме
		IgG	IgA	IgM	IgG		IgA	IgM
1	Плазма	8,46±0,37	1,6±0,13	0,83±0,07	100		100	100
2	Осадок А8	0,1±0,02	0,02±0,001	следы	1,2		1,25	0,0
3	Центрифугат А	0,85±0,04	0,56±0,04	следы	10,0		35,0	0,0
4	Центрифугат А1	0,3±0,05	следы	следы	3,5		0,0	0,0
5	Осадок Б	1,91±0,09	0,78±0,04	0,74±0,03	22,6		48,75	89,2
6	Осадок В	Конечный	0,02±0,001	0,01±0,001	62,7		1,25	1,2
		продукт

Как видно из табл. 15 основные потери иммуноглобулина класса G наблюдается на стадии осадка Б. Из приведенных данных также видно, что использование спиртового осаждения приводит практически к полной потере иммуноглобулинов классов А и М. Это заставляет специалистов постоянно работать над введением дополнительных стадий с целью увеличения выхода иммуноглобулина для внутримышечного применения.

Можно привести несколько технологических схем дополнительного извлечения иммуноглобулина.

Способ извлечения иммуноглобулина класса G спиртовым осаждением

сводится к следующему:

1.Экстрагирование IgG из осадка Б проводили при рН 5,3–5,4, в условиях близких к изоэлектрической точке плазминогена. Для этой цели осадок суспендировали в воде в соотношении 1 : 15, устанавливали рН 5,3–5,35 и охлаждали до 0 ºС или минус 1 ºС.

2.Охлажденную суспензию осаждают, охлажденным до минус 20 °С этиловым спиртом. Конечная концентрация спирта 17 % и температура минус 5–6 °С. Осаждение проводят в течение 2–3 часов, постепенно увеличивая скорость добавления спирта. Для формирования осадка смесь оставляют при указанной температуре на 10–12 часов. На этой стадии при рН 5,3–5,4 (изоэлектрическая точка плазминогена) в осадок выпадают балластные компо-

220

221

ненты, потери иммуноглобулина незначительны. Смесь центрифугируют при	2. Центрифугат, содержащий иммуноглобулины подщелачивают до ве-
низких температурах. На выходе центрифугат (Б1), содержащий иммуногло-	личины рН 6,9–7,3 при помощи 1 М бикарбоната натрия. К полученному
булины (до 86 % IgG), должен иметь температуру не выше минус 5 ºС.	раствору при постоянном перемешивании и температуре 10 °С прибавляют
3. К центрифугату (Б1) охлажденному до температуры минус 3–4 °С	2 % раствор риванола с рН 6,9–7,3. Балластные белки выпадают в осадок и их
прибавляют концентрированный раствор натрия хлорида до ионной силы	отделяют фильтрацией.
0,05–0,07 и начинают осаждение медленным прибавлением, охлажденного до	3. К раствору, содержащему иммуноглобулины, для удаления риванола
минус 20 °С этилового спирта до конечной концентрации 25 %. Осаждение	добавляют натрий хлористый до конечной концентрации 0,87 % при темпе-
проводят в течение 3–4 часов. Конечная температура смеси 5–6 °С. Обяза-	ратуре 8–10 °С. Риванол, выпавший в осадок, удаляют центрифугированием.
тельным условием является поддерживание величины рН на уровне 7,0–7,3.	Центрифугат охлаждают до температуры около 0 ºС.
Смесь центрифугируют. Температура центрифугата на выходе не выше ми-	4. К центрифугату медленно прибавляют, охлажденный до минус 20 °С
нус 5 ºС. При необходимости переосаждение повторяли при тех же условиях.	этиловый спирт до конечной концентрации 25 %. Осаждение проводят в те-
4. Осадок иммуноглобулина растворяют в водном растворе с ионной	чение 1–2 часа. Конечная температура смеси 5–6 °С. Обязательным условием
силой 0,01; рН 6,5–7,5 в соотношении 1 : 5 и содержанием белка 4,0–5,0 %.	является поддерживание величины рН на уровне 7,1–7,3. Смесь центрифуги-
Нерастворившиеся белки отделяли осветляющей и стерилизующей фильтра-	руют (температура центрифугата на выходе не выше минус 6 ºС). Осадок со-
цией.	держит иммуноглобулины.
5. Раствор иммуноглобулина подвергают диафильтрации на раздели-	Дополнительное извлечение иммуноглобулинов из осадка Б позволило
тельных аппаратах для полного удаления этилового спирта, низкомолекуляр-	увеличить выход препарата на 25–30 %. По качественному составу препарат
ных примесей и фрагментов. Устанавливают рН раствора 4,2 ± 4,3; содержа-	не отличался от препарата, полученного спиртовым методом.
ние белка 5,5 ± 0,5 %, подвергают стерилизующей фильтрации.	Один из возможных путей повышения эффективности препаратов им-
6. При кислом значении рН раствор термостатировали при 37 ± 0,2 °С в	муноглобулинов заключается в расширении спектра содержащихся в них
течение 40–48 часов. Затем величину рН доводили до 6,5–7,5 и концентриро-	антител. Между тем некоторые виды антител содержатся во фракции классов
вали белок до 10 ± 0,5 % ультрафильтрацией.	IgM и IgA. Противовирусные антитела содержатся, главным образом, во
7. В раствор иммуноглобулина прибавляли глицин до конечной кон-	фракции класса IgG, а антитела против ряда возбудителей бактериальной
центрации 0,3 М и препарат подвергали стерилизующей фильтрации.	природы (эшерихии, сальмонеллы, шигеллы и другие энтеробактерии) со-
Контроль полученного препарата продемонстрировал его соответствие	держатся во фракции класса IgМ. Как видно из табл. 15, IgM находятся в
требованиям спецификации на иммуноглобулин человека нормальный для	осадке Б.
внутримышечного введения. В то же время хотелось бы отметить, что со-	Были предложены методы для получения иммуноглобулинов, обога-
держание полимеров (2,5 %) превышало их количество в препарате, полу-	щенных классами М и А. Для этого использовали каприлатно-спиртовый ме-
ченном по обычной технологии (0,5 %).	тод или фракционирование риванолом и осаждение аммонием сульфатом.
Также, предложена схема получения иммуноглобулина класса G из	Полученные препараты содержали 80 % IgG и 20 % IgМ или 80 % IgG и
осадков Б риванол-спиртовым методом:	20 % IgA.
1. Осадок Б суспендируется в 0,1 % растворе хлорида натрия, значение	Предложен метод осаждения путем каприлатно-спиртовой обработ-
рН доводится до 5,0–5,1, (1 М ацетатным буфером) перемешивается в тече-	ки:
ние 5 часов при температуре около 0 °С. Суспензия центрифугируется. Тем-	1. Осадок Б суспендируют в 0,05 М ацетатном буфере (рН – 4,8) при
пература центрифугата на выходе не выше минус 5 °С. Осадок удаляется.	соотношении1 : 10. Балластные белки и липопротеиды осаждали из получен-

222

223

ного экстракта каприловой кислотой. К 1 литру суспензии осадка Б при комнатной температуре и постоянном перемешивании прибавляют 25 грамм каприловой кислоты.

2.Полученную смесь выдерживают при 4 °С в течение 18 часов для формирования осадка. Осадок отделяют центрифугированием и удаляют.

3.Надосадочную жидкость, содержащую иммуноглобулины охлаждают до температуры 0–1 °С и прибавляют охлажденный до минус 15 °С 96 % этиловый спирт до конечной концентрации 30 % (рН – 5,0). Смесь центрифугируют на холоде. Надосадочную жидкость удаляют.

4.Осадок растворяют в 0,9 % растворе натрия хлорида и подвергают осветляющей и стерилизующей фильтрации. Полученный комплекс иммуноглобулинов содержал: 54–72 % IgG, 15–24 % IgM и 12–18 % IgA.

Предложен также метод получения комплекса иммуноглобулинов из осадка Б с использованием хлороформа для удаления липопротеидов:

1.К осадку Б при комнатной температуре и постоянном перемешивании прибавляют воду для инъекций в соотношении 1 : 12, после чего в раствор вносят натрий хлористый до конечной концентрации 0,9 %, рН 7,0–7,5.

2.К экстракту осадка Б при постоянном перемешивании добавляют 1 N раствор HCI до величины рН – 4,6. Затем прибавляют хлороформ до конечной концентрации 3 %. Смесь перемешивают в течение одного часа и выдерживают при температуре 0–3 °С в течение 12–14 часов. Выпавший осадок отделяют центрифугированием.

3.Надосадочную жидкость подвергают осветляющей фильтрации. К фильтрату прибавляют 50 % раствор ПЭГ до конечной концентрации 12 % (или проводят осаждение этиловым спиртом до 26 %). Осадок отделяют центрифугированием.

4.Осадок растворяют в 0,3 М глицине, рН – 4,6. Проводят осветляющую и стерилизующую фильтрацию. Выдерживают 20–25 дней при комнатной температуре.

5.Проводят контроль выделенного препарата иммуноглобулинов. Препарат был полностью очищен от липопротеинов и агрегатов. Состав комплекса: IgG – 50–70 %, IgM – 15–25 %, IgA – 15–25 %. Препарат лиофилизирован. Растворимость не более 5 минут. Фракционный состав – не более 5 дуг преципитации. Препарат предлагается для перорального применения.

Содержит высокие титры антител к шигеллам и сальионеллам. Аналогичные результаты были получены при использовании для осаждения каприловой кислоты.

Интерес представляет метод получения иммуноглобулинов из крови человека с использованием в качестве осадителя ПЭГ с молекулярной массой 4000–6000, с последующим использованием ионов цинка. Данную технологию можно представить следующим образом:

1.К плазме крови человека при величине рН – 7,0 прибавляют ПЭГ до конечной концентрации 15 %. Смесь выдерживают в течение 40 минут для формирования осадка. Осадок отделяют центрифугированием. Надосадочную жидкость удаляют.

2.Осадок ресуспендируют в 20 мМ буфере ацетата натрия (рН – 4,7) в соотношении 1 : 10. К этому ресуспендированному осадку прибавлен ПЭГ до конечной концентрации 6,0 %. Смесь выдерживают в течение 40 минут для формирования осадка. Осадок отделяют центрифугированием. Надосадочную жидкость сохраняют. Осадок удаляют.

3.рН надосадочной жидкости при помощи 0,25 М NaOH доводят до величины 8,0.

4.Затем к надосадочной жидкости добавлен ПЭГ в буферном растворе

свеличиной рН 8,0 (10 мМ Трис) до конечной концентрации 12,0 %. Смесь выдерживают в течение 40 минут для формирования осадка. Осадок отделяют центрифугированием. Надосадочную жидкость удаляют. Осадок сохраняют.

5.Осадок ресуспендируют в 15 объемах буферного раствора 20 мМ ацетата натрия с величиной рН 4,0 и рН доведен 0,25 М NaOH до величины 8,5.

6.К полученному раствору при 0 °С добавлен 50 мМ раствор ацетата цинка до конечной концентрации 2 мМ. Смесь выдерживают в течение 40 минут для формирования осадка. Осадок отделяют центрифугированием. Надосадочную жидкость удаляют.

7.Осадок иммуноглобулинов растворяют в 20 мМ буферном растворе ацетата натрия (рН – 4,0) в соотношении 1 : 10. Раствор иммуноглобулина подвергают анализу. При необходимости можно провести ультрафильтрацию для освобождения от ионов цинка.

224

225

Процесс осаждения ПЭГ можно проводить как при температуре 2–8 °С, так и при комнатной температуре. Степень чистоты выделенного иммуноглобулина не отличается от чистоты препарата, выделенного по методу Кона. Остаточный уровень ионов цинка находится на физиологическом уровне. Выход иммуноглобулинов составляет 75–90 % от их содержания в плазме крови человека, в то время как по методу Кона удается выделить 50–60 % иммуноглобулинов. Использование ПЭГ и ионов цинка полностью сохраняет структуру белковой молекулы иммуноглобулинов.

Для получения нормального иммуноглобулина были попытки выделения и очистки препарата с использованием риванол-спиртового метода выделения. Несмотря на преимущества данного метода (уменьшение объемов реакционных смесей, сокращение расхода этилового спирта, уменьшение трудозатрат практически в 2 раза и снижение количества стадий выделения) этот метод не нашел практического использования при выделении иммуноглобулинов из крови человека.

Продолжается поиск и разработка методов позволяющих предотвратить деградацию молекул иммуноглобулинов в процессе производства. Известно, что причинами дестабилизации белковых молекул иммуноглобулина является конформационные изменения и частичная денатурация белка. Последнее может быть связано не только с условиями фракционирования (добавление спирта, риванола и других осадителей), но и с термическими воздействиями при лиофилизации препарата. В связи с этим, отдельным вопросом получения иммуноглобулинов является стадия лиофилизации, так как ряд продуктов представлен в виде лиофилизатов. Режим сублимационного высушивания препарата иммуноглобулина оказывает существенное влияние на количество образующихся агрегатов. Высокое содержание фрагментов коррелирует с содержанием агрегатов после сушки. Методом молекулярного светорассеивания была изучена денатурационная устойчивость иммуно-

глобулинов. Для этого 1,5 % раствор иммуноглобулина термостатиривали при 60 ºС в течение 30 минут. В различных концентрациях изучали аминокислоты: глицин, аланин, валин, фенилаланин; сахара и многоатомные спирты. Установлено, что стабилизирующим действием обладают глицин, аланин, валин, в то время как фенилаланин не проявляет стабилизирующего действия. Их защитный эффект возрастает с увеличением концентрации в растворе и увеличением молекулярной массы. Из сахаров наилучшие результаты

получены при использовании маннита и сорбита в количестве 2–3 %. Для стабилизации препаратов в процессе лиофилизации наиболее часто используют глицин или глюкозу, а для стабилизации иммуноглобулина – маннит. Препараты иммуноглобулинов, изготовленные методом фракционирования этиловым спиртом на холоде с последующей сушкой (вариант А) более стабильны, чем препараты иммуноглобулинов, приготовленные по варианту Б, содержащему спирт. Однако использование для удаления спирта диафильтрации приводит к тому, что препараты, полученные таким способом более стабильны по сравнению с лиофильно высушенными продуктами.

Все приведенные методы позволяют получить преимущественно иммуноглобулин класса G. Последнее связано с тем, что в процессе фракционирования иммуноглобулины классов М и А практически полностью теряются. В случае необходимости выделения этих классов иммуноглобулинов или препаратов содержащих терапевтические дозы классов А и М необходимо применять специальные методы выделения.

Требования к качеству препаратов иммуноглобулинов для внутримышечного и внутривенного введения изложены в требованиях ВОЗ и соответствующих статьях ряда фармакопей. Для лучшего понимания принципов контроля препаратов крови мы остановимся только на основных методах контроля, присущих большинству известных препаратов крови с указанием на источник – Европейская фармакопея (Е. Ф.), Государственная фармакопея Украины (ГФУ).

Основные методы контроля:

1.Подлинность – определение проводят методом иммуноэлектрофореза. На электрофореграмме, полученной при взаимодействии исследуемого препарата и антисыворотки, против белков нормальной крови человека должны обнаруживаться линии преципитации, идентичные линиям преципитации, полученным со стандартным раствором иммуноглобулина. Должно отсутствовать взаимодействие с антисыворотками к крови животных

(Е. Ф. 0338, 0918).

2.Фракционный состав также определяют методом иммуноэлектрофореза против антисыворотки крови человека. На иммунофореграмме должны выявляться дуги преципитации, соответствующие IgG, IgA, IgM в зависимости от состава препарата. (Е. Ф. 0338, 0918).

226

227

3.Электрофоретический состав белков – определение проводят мето-

дом зонального электрофореза, используя пластины с гелем ацетата целлюлозы в буфере из барбитуратов с рН 8,6 (Е. Ф. 2.2.31.).

4.Общий белок – определение проводят с биуретовым реактивом при сравнении со стандартным раствором иммуноглобулина (Е. Ф. 2.5.9.).

5.Молекулярные параметры – определение проводят методом жидкостной хроматографии (УФ детектор при 280 нм). Хроматографию проводят, используя калибровочный стандарт с известным фракционным составом. Проводят определение мономеров, димеров, агрегатов и фрагментов

(Е. Ф. 2.2.29.).

6.Стерильность – определение проводят методом мембранной фильтрации. Стерильность контролируют на двух видах сред: тиогликолевой (при температуре 30–35 °С) и соево-казеиновой (при температуре 20–25 °С) в течение 14 суток (Е. Ф. 2.6.1.).

7.Аномальная токсичность – определение проводят на животных (мыши и морские свинки), вводя указанную в спецификации тест дозу.

8.Пирогенность – определение проводят на животных (кроликах), вводя указанную в спецификации тест дозу. Повышение температуры не бо-

лее по Е. Ф. 2.6.12.

9.Бактериальные эндотоксины – определение проводят LAL-тестом.

10.Стабильность. Препарат не должен образовывать гель при инкубации при температуре 56–58 ºС в течение 4 часов.

11.Термостабильность. Определение проводят для изучения стабильности специфической активности иммуноглобулинов. Препарат в течение 28 суток выдерживают при температуре 37 °С. Потеря специфической активности не более 20 % от первоначальной.

12.рН. Определение проводят потенциометрически (Е. Ф. 2.2.3.).

13.Специфическая активность. Определение проводят согласно спецификациям. Антитела к поверхностному антигену гепатита В (Е. Ф. 0722, 1016); антитела к вирусу гепатита А (Е. Ф. 0769); антитела к вирусу бешенства (Е. Ф. 0723); антитела к вирусу краснухи (Е. Ф. 0617); антитела к вирусу кори (Е. Ф. 0397); антитела к вирусу оспы (Е. Ф. 0724); антитела к бактериям столбняка (Е. Ф. 0398); анти-D-антитела к антистафилолизину (Е. Ф. 0557,

1527) и др.

14.	Объем,	который изымается. Метод описан в спецификации на
препарат.
15.	Прекалликреиновый активатор.		Определение	проводят	по
Е. Ф. 2.6.17.
16.	Антикомплементарная активность. Определение проводят по
Е. Ф. 2.6.17.
17.	Анти-А	анти-В гемагглютинины.	Определение	проводят	по
Е. Ф. 2.6.20.

18.Растворимость (для лиофилизированных препаратов). Метод опи-

сан в спецификации на препарат.

19.Вода (для лиофилизированных препаратов). Определение проводят по методу указанному в спецификации (Е. Ф. 2.5.12.; 2.2.32.; 2.2.40.).

20.Осмоляльность. Определение проводят по Е. Ф. 2.2.35.

21.Функциональная активность Fc-фрагментов иммуноглобулинов.

Определение проводят по Е. Ф. 2.7.9.

Предусматривается контроль осмолярности иммуноглобулинов для внутривенного применения. Этот параметр может определять возможность наличия побочного действия и всегда должен учитываться при введении больших доз препарата у детей с полиорганной недостаточностью и нарушением гомеостаза. Так, например, гиперосмолярные по отношению к плазме крови препараты с большей вероятностью могут вызывать нарушение функции почек, что следует учитывать при назначении того или иного препарата.

Особый интерес представляют иммуноглобулины направленного дей-

ствия, содержащие специфические антитела к ряду возбудителей инфекционных заболеваний. Сегодня выпускаются препараты, содержащие высокие титры антител к вирусам (краснухи, кори, гепатиту В, бешенства и др.) и бактериям (стафилококку, столбняку и др.) Довольно часто специфические иммуноглобулины вводятся одновременно с соответствующей вакциной для создания пассивного иммунитета. Так, например, в случае укуса человека животными (поскольку вакцина обеспечивает выработку антител только через 10–14 дней после введения), для создания пассивного иммунитета человеку вводят антирабический иммуноглобулин из расчета 20–40 МЕ на 1 кг массы тела. Иммуноглобулин антирабический из крови человека производит ряд стран: Австрия, Китай, Франция. Для лечения клещевого энцефалита используется иммуноглобулин для внутримышечного введения, полученный из

228

229

крови доноров, вакцинированных против клещевого энцефалита. В настоящее время в России на 10-ти предприятиях выпускается иммуноглобулин против клещевого энцефалита. Хорошо зарекомендовал себя препарат ФСМЕ-Булин (Австрия), содержащий антитела против вируса клещевого энцефалита. Защитное действие проявляется уже через 24 часа после инъекции и сохраняется около 4-х недель. Специфические иммуноглобулины для внутримышечного введения используются для профилактики и лечения дифтерийной, столбнячной, коклюшной, стафилококковой и других инфекций. Содержание белка в этих препаратах составляет 100 мг/мл, глицина от 22,5 до

30 мг/мл.

Получение специфических иммуноглобулинов для внутримышечного введения проводится по той же схеме, как и иммуноглобулин человека нормальный. Отличие только в используемом сырье: либо используют кровь доноров, иммунизированных соответствующим антигеном, либо кровь нормальных доноров путем контроля сывороток – используют сыворотки с максимальным содержанием специфических антител. Контроль этих препаратов проводится с дополнительной характеристикой – определением содержания специфических антител.

2.1.2. Иммуноглобулины для внутривенного введения

Иммуноглобулины для внутривенного применения используются для лечения инфекционно-воспалительных осложнений, которые возникают на фоне вторичного иммунодефицита у больных острой и хронической лейкемией, обусловленных патологическими процессами и влиянием цитостатических препаратов. Известно, что лечение онкогематологических больных всегда связано с высоким риском бактериальных осложнений, что в значительной степени усложняет лечение и ухудшает прогноз основного заболевания. Это прежде всего связано с подавлением как специфического так и неспецифического механизма резистентности организма больного к опухолевому заболеванию, а также химиотерапией, которая используется при лечении данного контингента пациентов и еще больше подавляет иммунные реакции организма. При хронических лейкемиях, особенно в третей стадии хронической лимфоидной лейкемии, обнаруживается гипогаммаглобулинемия за счет значительного снижения содержания IgG в сыворотке крови, что в свою очередь

приводит к возникновению бактериальных осложнений (пневмония, бронхит, отит и др.). Наибольшую угрозу представляет грамнегативный сепсис, который в 25 % случаев заканчивается септическим шоком. В связи с этим незаменимыми лекарственными средствами в этих случаях являются иммуноглобулины для внутривенного введения. Основной причиной летальных исходов при остром панкреатите являются гнойносептические осложнения, в патогенезе которых ведущую роль играет формирование вторичного иммунодефицита. У 30 % больных в 1–3 сутки заболевания обнаруживается дефицит IgG и IgM. Применение иммуноглобулина для внутривенного введения нормализует содержание иммуноглобулинов к 7 дню. Значительно снижается число гнойно-септических осложнений. Практически во всех случаях применения иммуноглобулина применяются достаточно высокие дозы вводимого препарата: при синдромах первичного иммунодефицита – 200–800 мг/кг; при синдромах вторичного иммунодефицита – 200–400 мг/кг; при бактериальных инфекциях (включая сепсис) и вирусных инфекциях – 400–1000 мг/кг.

Побочные действия иммуноглобулинов для внутривенного введения

изучены еще в недостаточной степени. Побочные действия более вероятны при первой инфузии и возникают чаще всего после начала введения или в течение первого часа: со стороны ЦНС – головная боль, тошнота, реже головокружение; со стороны пищеварительного тракта в редких случаях – рвота, боль в животе, диарея; со стороны сердечнососудистой системы – редко артериальная гипотензия, тахикардия, ощущение сдавливания или боль в груди, цианоз, одышка. Аллергические реакции: очень редко отмечались тяжелая артериальная гипотензия, коллапс и потеря сознания. Возможна гипертермия, озноб, повышенные потоотделение и утомляемость, недомогание; редко – боль в спине, миалгия, онемение, приливы и ощущение холода. Кроме того, иммуноглобулины представляют опасность переноса вирусных гепатитов и ВИЧ-инфекции. При крайне низких показателях лейкопении у больных с сепсисом в стадии септикобактериемии внутривенное введение иммуноглобулинов угнетает клиренс иммунных комплексов и бактерий, тем самым повышая чувствительность организма к инфекции, в результате чего даже авирулентные штаммы микроорганизмов могут вызвать летальный исход инфекционного процесса.

Ограничением применения иммуноглобулинов для внутримышечного введения является: невозможность введения больших объемов препарата,

230

231

медленная резорбция антител из мышечной ткани и значительный местный	Учитывая, что основные требования к препаратам плазмы крови – ка-
протеолиз иммуноглобулинов. Этих недостатков лишены иммуноглобулины	чество и безопасность, необходимо отметить, что в рекомендациях ВОЗ обя-
для внутривенного введения. Введение иммуноглобулинов для внутривенно-	зательным является контроль препаратов по тестам: стерильность, пироген-
го применения позволяет вводить большие дозы препарата (500–1000 мг на	ность, безопасность, специфическая активность. Безопасность контролируют
кг массы больного) и достаточно быстро создать в крови больного кон-	на двух видах животных – мышах при внутривенном введении 0,5 мл препа-
центрацию антител в защитной концентрации. В тоже время появление по-	рата и морских свинках при введении внутрибрюшинно 5 мл препарата. Кон-
бочных действий при введении иммуноглобулинов в значительной степени	троль пирогенности рекомендован в дозе 0,5 грамма иммуноглобулина на
связаны с используемым способом изготовления препарата. Так, например,	1 кг массы кролика. Для 5 % раствора препарата эта доза составляет 10 мл.
основным недостатком препаратов, полученных с применением гидролити-	Специфическая активность иммуноглобулина человека нормального для
ческих ферментов, является наличие в препаратах фрагментов. Фрагменти-	внутривенного введения контролируется по содержанию двух видов антител
рованные молекулы в течение суток выводятся из организма, в то время как	– против вируса и против бактерий. Выбор микроорганизмов определяется
период полураспада мономерных молекул составляет 21–30 дней, то есть	непосредственно производителем по его усмотрению. Наиболее часто опре-
действие препарата, защита организма от микробов и вирусов становится бо-	деляют антитела против полиомиелита, кори, дифтерийного токсина, столб-
лее продолжительной. Присутствующие в препаратах полимеры могут при-	нячного токсина, стафилококкового токсина, вируса гепатита В и др. В пре-
водить к тяжелым анафилактоидным реакциям. Наличие димеров может спо-	паратах, выпускаемых сегодня в Украине, например, регламентируется кон-
собствовать появлению побочных эффектов, включая лихорадку, тошноту,	центрация антител против вируса кори и стафилококкового токсина. Необхо-
понижение кровяного давления. В связи с этим перед производителем стоит	димо отметить, что все используемые методы контроля иммуноглобулинов
задача – максимально уменьшить содержание димеров в препарате, исклю-	должны быть одобрены национальным органом контроля иммуно-
чить присутствие в иммуноглобулинах фрагментов и полимеров. Учитывая,	биологических препаратов.
что подкласс иммуноглобулина IgG3 обладает более высокой способностью	Сегодня в Украине еще недостаточно развита нормативная база по
образовывать димеры необходимо в процессе производства препарата мак-	производству и контролю препаратов, полученных из плазмы крови. Прика-
симально снизить его содержание в препарате. В соответствии с рекоменда-	зы МОЗ Украины от июля 2005 года за № 247 и № 375 «Про затвердження
циями Всемирной организации здравоохранения иммуноглобулины для	документів з питань контролю якості препаратів крові» не отражают пол-
внутривенного введения должны подвергаться дополнительному тестиро-	ностью рекомендации ВОЗ и требования Европейской фармакопеи к им-
ванию, по сравнению с препаратами для внутримышечного введения, по те-	муноглобулинам для внутримышечного введения и не определяют требова-
стам: на гипотензивную активность; на антикомплементарную активность; на	ния к иммуноглобулинам для внутривенного введения. Это особенно важно,
количественное содержание гемагглютининов. Выпускаемые препараты им-	так как выпускаемые сегодня в Украине иммуноглобулины для внутривенно-
муноглобулинов для внутривенного применения должны быть максимально	го введения по ряду показателей определяющих безопасность препарата не
очищены от полимеров и агрегатов (содержание мономеров и димеров не	отвечают международным требованиям. Так, Европейскими требованиями
менее 90 % от общего содержания белка); антикомплементарная активность	предусмотрен контроль препаратов по тесту осмоляльность (норма – мини-
– связывание комплемента не более чем 50 % (не более 1 гемолитической	мум 240 ммоль/кг); прекалликреиновый активатор (норма – не более
единицы СН на 1 мг иммуноглобулина); содержание активатора прекалли-	35 МЕ/ мл); анти-А и анти-В гемагглютинины (норма – не более 1 : 64).
креина, обладающего гипотензивным действием – не более 35 МЕ/мл; анти-А	Необходимость контроля над содержанием в иммуноглобулинах для
и анти-В гемагглютинины в титрах не более 1 : 64 в реакции Кумбса.	внутривенного применения прекалликреинового активатора определено
	ролью данного соединения в активации системы кининов. Активатор приво-

232

233

дит в рабочее состояние калликреины (протеиназы типа трипсина), а эти ферменты в свою очередь отщепляют кинины из кининогенов. Кинины характеризуются широким спектром биологической эффективности, главным проявлением которого является гипотензивное действие.

Иммуноглобулины выделяют из донорской плазмы. Каждая серия препарата изготавливается из смеси исходного материала не менее чем от 1000 человек, что нивелирует различие в содержании антител в препарате и обеспечивает достаточную стандартность в отношении иммунологической активности. Это требование для национального производителя полностью совпадает с требованиями Европейской фармакопеи для иммуноглобулина человека нормального для внутримышечного и внутривенного введения. Фракции иммуноглобулинов плазмы крови доноров выделяют, очищают и концентрируют методом фракционирования спиртово-водными осадителями при температуре ниже 0 ºС. Все доноры тщательно проверяются лабораторными тестами для снижения риска передачи патогенов от инфицированных доноров, которые тестируются на отсутствие антител к вирусу иммунодефицита (ВИЧ 1/2), антител к вирусу гепатита С и антигена вируса гепатита В

(НВsAg).

Технология получения иммуноглобулинов для внутривенного введения с использованием гидролиза пепсином можно представить следующим образом:

1.К сыворотке крови человека, охлажденной до температуры 0–2 °С при постоянном перемешивании добавляют, охлажденный до минус 10 °С этиловый спирт до конечной концентрации 8,0 %. В конце осаждения температура смеси должна находиться в пределах от 0 °С до минус 2 °С. На этой стадии происходит осаждение остатков фибриногена, денатурированного белка, тканевых частиц и других нерастворимых примесей. Выпавший балластный осадок удаляют центрифугированием при низких температурах. Важным условием получения стабильных иммуноглобулинов, как на этой стадии, так и на всех последующих, является строгое соблюдение температурных режимов и минимального вспенивания смеси при перемешивании и центрифугировании.

2.Центрифугат охлаждают до температуры минус 3–4 °С и осаждают медленным прибавлением, охлажденного до минус 20 °С этилового спирта до конечной концентрации 25 %. Осаждение проводят в течение 3–4 часов. Конечная температура смеси минус 5–6 °С. Обязательным условием является

поддерживание величины рН на уровне 7,1–7,3. Смесь центрифугируют (температура центрифугата на выходе не выше минус 6 °С). Центрифугат используют для выделения альбумина. Осадок (фракция II + III по Кону), содержащий фракцию иммуноглобулинов подвергают дальнейшей очистке.

3.Полученный осадок при 0 °С растворяют в 0,9 % изотоническом растворе хлорида натрия до получения гомогенной суспензии и процесс переосаждения повторяют при тех же условиях (п. 2). Получен осадок А1.

4.Осадок А1 растворяют при температуре от 0 °С до минус 1 °С в концентрированном растворе хлорида натрия при ионной силе 0,01, доводят величину рН до 5,0–5,1 и осаждают, охлажденным до минус 20 °С этиловым спиртом. Конечная концентрация спирта 17 % и температура минус 5–6 °С. Осаждение проводят в течение 3–5 часов, постепенно увеличивая скорость добавления спирта. Для формирования осадка смесь оставляют при указанной температуре на 10–16 часов. На этой стадии при рН 5,1–5,2 (изоэлектрическая точка альфа- и бета-глобулинов) в осадок выпадают балластные компоненты, потери гамма-глобулиновой фракции незначительны. Смесь центрифугируют при низких температурах. На выходе центрифугат Б, содержащий иммуноглобулины, должен иметь температуру не выше минус

5 °С.

5.К центрифугату Б охлажденному до температуры минус 3–4 °С прибавляют концентрированный раствор натрия хлорида до ионной силы 0,05–0,07 и начинают осаждение медленным прибавлением, охлажденного до минус 20 °С этилового спирта до конечной концентрации 25 %. Осаждение проводят в течение 3–4 часов. Конечная температура смеси минус 5–6 °С. Обязательным условием является поддерживание величины рН на уровне 7,1–7,3. Смесь центрифугируют (температура центрифугата на выходе не выше минус 6 °С). Осадок содержит иммуноглобулины.

6.Осадок подвергают прессованию для удаления остаточного количества спирта, затем растворяют в 0,9 % растворе натрия хлорида и проводят стерилизующую фильтрацию. Стерильный раствор иммуноглобулина выдерживают при комнатной температуре в течение 30–45 суток и при температуре 2–8 °С – 30–45 суток и проводят стерилизующую фильтрацию для отделения выпавших в осадок балластных белков.

7.К полученному раствору прибавляют глюкозу (2 %) и глицин (1 %), охлаждают до 3–5 °С и при помощи 0,1 М раствора хлористоводородной

234

235

кислоты доводят величину рН до 3,9–4,0. К раствору добавляют пепсин из	зующей фильтрации. Агрегаты осаждались при выдерживании раствора пре-
расчета 50 мг на 100 грамм белка. Раствор подвергают стерилизующей филь-	парата в течение 24–48 часов при 8–10 °С. Затем раствор подвергают стери-
трации, помещают в термостат при 37 ± 0,5 °С для проведения гидролиза на	лизующей фильтрации. Введение описанной стадии очистки в растворах с
16–18 часов. На этом этапе снижаются антикомплементарные свойства им-	низкой ионной силой позволило снизить содержание агрегатов в 2,7 раза. Так
муноглобулинов.	же было показано, что на этапе спиртового фракционирования в процессе от-
8. Раствор иммуноглобулина после проведения гидролиза охлаждают	деления IgG от бета-глобулинов при рН не ниже, чем 5,4 происходит удале-
до температуры 20–25 °С, доводят величину рН до 4,0–4,5 и прибавляют гель	ние IgA из препарата. Содержание IgA снижается с 2,3 мг/мл до 0,41 мг/мл,
гидроокиси алюминия для удаления пепсина. Смесь перемешивают в течение	т.е. в 5,6 раза. При изменении рН готового препарата до 4,1–5,2 происходит
одного часа. Комплекс пепсина с гидроокисью алюминия удаляют фильтра-	диссоциация не только димеров (их количество снижалось в 4 раза), но и ос-
цией.	новной части агрегатов с (0,6 ± 0,1) % до (0,18 ± 0,06) %. Одновременно было
9. Раствор иммуноглобулина стабилизируют добавлением 120–150 г	установлено, что хранение препаратов в течение 3-х лет практически не из-
глюкозы на литр и прибавляют ПЭГ 4000 в количестве 60–80 грамм на литр	меняло первоначальный состав на протяжении всего срока годности.
при величине рН 6,0–6,2. Смесь выдерживают в течение 1–2 часов. Осадок	Хорошо известен препарат Хумаглобин (Human, Венгрия) – иммуно-
выпавших полимеров отделяют центрифугированием. К супернатанту при-	глобулин для внутривенного применения. Препарат содержит общий белок
бавляют ПЭГ 4000 до конечной концентрации 130 грамм на литр при вели-	50 мг/мл, глицина – 15 мг/мл, глюкозы – 15 мг/мл, IgG не менее 99,0 %, IgA
чине рН 6,8–7,2. Смесь выдерживают при 4–8 °С в течение 20–24 часов. В	не более 50 мкг/мл. Технология данного препарата сводится к следующему:
осадок выпадают иммуноглобулины, которые отделяют центрифугировани-	 спиртовое фракционирование плазмы на холоду;
ем. В супернатанте остаются фрагменты иммуноглобулинов.	 удаление остаточного этилового спирта путем ультрафильтрации ;
10.Осадок иммуноглобулинов растворяют в 0,9 % изотоническом рас-	 проведение вирусной инактивации при 60 °С в течение не менее
творе натрия хлорида, подвергают ультрафильтрации, прибавляют глюкозу и	10 часов в кислой зоне рН;
глицин до конечных концентраций 12 грамм и 5 грамм на литр, соответ-	 осаждение иммуноглобулинов полиэтиленгликолем с молекулярной
ственно. Раствор иммуноглобулина подвергают стерилизующей фильтрации.	массой 6000. Осадок отделяют центрифугированием. Агрегаты в надосадоч-
11.Контроль препарата иммуноглобулина в форме in bulk и разлив в	ной жидкости;
первичную упаковку (флаконы).	 осадок иммуноглобулинов растворяют в воде для инъекций, подвер-
12.Контроль готового препарата.	гают ультрафильтрации, прибавляют глюкозу и глицин до конечных концен-
13.Маркировка и упаковка препарата иммуноглобулина для внутри-	траций 15 и 15 г/л. Раствор иммуноглобулина подвергают стерилизующей
венного введения.	фильтрации;
Приведенная схема является одной из первых технологических схем	 проводят контроль препарата in bulk, разлив, маркировку и упаков-
получения иммуноглобулина для внутривенного введения. За последние го-	ку.
ды появилось множество дополнительных методик для выделения и очистки	Сегодня в Украине производителями препаратов крови являются об-
иммуноглобулинов, а также способов инактивации вирусов.	ластные станции переливания крови и два предприятия: ЗАО «Биолек» (им-
Так, для отделения агрегатов использовали растворимость агрегатов в	муноглобулин человека нормальный для внутривенного и внутримышечного
растворах с низкой ионной силой. Для этого осадок иммуноглобулинов, вы-	введения) и ЗАО «Биофарма» (иммуноглобулины человека для внутримы-
деленный спиртовым методом, растворяли в воде очищенной. Соотношение	шечного введения: нормальный, противогриппозный, против вируса
осадка и воды составляло 1 : 5. Раствор подвергали осветляющей и стерили-	Эпштейна – Барра, антирезусный, против герпеса простого 1 и 2 типов, про-

236

237