Л_3_Ферменты

Это позволяет рассчитывать активность Е.

За единицу активности принимают такое количество Е, которое способно преобразовать 1 мкмоль S за минуту (МЕ) или 1моль за секунду (катал, СИ).

Удельную активность выражают в единицах активности, отнесенных к 1 мг (МЕ) или 1 кг (СИ) белка.

Это позволяет сравнивать количество активного Е в разных объектах и при разных состояниях, например, в норме и при патологии.

Различают два типа регуляции: быстрый (срочный) и медленный

(хронический).

При медленном типе сигнал проходит через геномный аппарат клетки. Количество Е увеличивается за счет индуцированного синтеза его белка de novo.

Так, в ответ на увеличение концентрации глюкозы в кровотоке в печени у человека появляется индуцибельная изоформа гексокиназы – глюкокиназа. Фермент действует только при высокой концентрации глюкозы. Он исчезает при понижении уровня глюкозы в крови.

Отравление ядами, канцерогенами, алкалоидами, инсектицидами и другими чужеродными веществами (ксенобиотиками) вызывает синтез

гидроксилазы в печени животных. В процессе гидроксилирования

(окисление субстратов путем присоединения гидроксильных групп) растворимость в воде у этих ксенобиотиков увеличивается. Чем выше гидрофильность, тем легче они выводятся из организма. В этом заключается защитная роль этих ферментов.

При экстренном (быстром) типе регуляции эффекторы действуют прямо на уже существующий Е.

Особые вещества – ингибиторы – угнетают активность ферментов. Некоторые ингибиторы используются в качестве лекарств, другие являются сильными ядами.

Некоторые типы ингибирования можно определить графически:

v	1/ v	EI E
Vmax	Vmax =Vimax

Vmax

2

			1/Vmax=1/ Vimax
Km ‹ Kim	[S]	-1/Km -1/Kim	1/[S]

Конкурентное ингибирование (обратимое)

Увеличение Kim указывает на то, что ингибитор присоединяется по активному центру Е. Повышение [S] полностью восстанавливает активность Е (Vmax =Vimax). Субстрат как бы конкурирует с ингибитором и вытесняет его из комплекса EI. Ингибирование конкурентное и обратимое.

Ингибитор имеет структурное сходство с субстратом.

Неконкурентное ингибирование (полная инактивация Е)

происходит при необратимом, ковалентном связывании ингибитора с Е. Поскольку сродство Е к S при этом не меняется (Km=Kim ), следовательно, ингибитор связывается с Е вне активного центра. Он не имеет структурного

сходства с S и снижает Vmax.
	v			1/v	EI	E
			Vmax ‹ Vimax
			Vimax	1/ Vimax
Vmax
2
Vimax					1/Vmax
	2
		Km=Kim	[S]	-1/Km =1/ Kim		1/[S]
		Неконкурентное ингибирование (необратимое)
		1/v	EI E	1/v	EI	E
		1/ Vimax		1/ Vimax
			1/Vmax			1/Vmax
		-1/Km 1/ Kim	1/[S]	-1/Km 1/ Kim		1/[S]
		Смешанный тип ингибирования		Бесконкурентное ингибирование

Смешанное или частично неконкурентное ингибирование отличается от конкурентного и неконкурентного местом пересечения графиков в координатах двойных обратных величин – это четвертый квадрант. Оно обратимое. Снижение Vmax и увеличение Km показывает на возможность замедленного каталитического превращения субстрата в EIS комплексе.

Бесконкурентное ингибирование отличается от конкурентного тем, что ингибитор связывается с ЕS-комплексом, а не со свободным Е.

Это связывание происходит вне активного центра Е. Повышение концентрации субстрата увеличивает ингибирование Е. Графики для Е и

EI параллельны в координатах двойных обратных величин. Это отличает данный тип ингибирования от всех предыдущих.

Таким образом, графический анализ скоростей ферментативных реакций в зависимости от концентрации субстрата позволяет получать дополнительную информацию о молекулярных механизмах

ферментативного катализа.

ОСНОВНЫЕ ВИДЫ РЕГУЛЯЦИИ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ

МЕДЛЕННЫЙ ТИП РЕГУЛЯЦИИ

1.Гормональная регуляция (специфическая) осуществляется путем

цитоплазматической рецепции гормонов:

a.Тиреоидные – тироксин (Т4), трийодтиронин (Т3)

b.Стероидные – половые (эстрогены, андрогены), минерало- и

глюкокортикоиды.

2.Физико-химические факторы (неспецифические):

Радиационное облучение

Ксенобиотики

Механизмы действия:

Индукция и репрессия синтеза белка

Изменение соотношение скоростей синтеза и распада Е (временной интервал – часы). Нарушение синтеза Е приводит к энзимопатиям. Медленные изменения – к адаптации.

Амплификация – увеличение копий генов

Экспрессия – увеличение числа копий м-РНК

БЫСТРЫЙ ТИП РЕГУЛЯЦИИ

Существует несколько физиологических механизмов регуляции активности ферментов, важнейшими из них являются:

аллостерия

кооперативность

ковалентная, химическая модификация

Синтез новых молекул Е при этом не происходит.

1.Гормональная регуляция (специфическая) осуществляется путем

мембранной рецепции гормонов: белки, пептиды, производные аминокислот (фен - катехоламины)

2.Аллостерическая регуляция:

 Активирование:

а. предшественником (гл-6-ф – Гликогенсинтетаза)

б. метаболитом (АМФ, АДФ) в. коферментом (НАД+)

 Ингибирование:

а. конечным продуктом (ретроингибирование) (пальмитат, холестерин,

нуклеотиды)

б. метаболитами (АТФ, цитрат, ацетил-КоА – ГК, ФФК, изоцитратдегидрогеназа)

3. Физико-химические факторы:

Специфические:

1)Белки-ингибиторы (антиэнзимы, сывороточный антитрипсин) или пептиды.

2)Ингибиторные субъединицы (протеинфосфатаза)

3)Регуляторные (R) субъединицы протеинкиназ

Неспецифические:

1)Посттрансляционная модификация белков

2)Компарментация: лизосомы, митохондрии, пероксисомы

3)Химические вещества:

Активаторы:

а. НСI – пепсиноген

б. желчные кислоты – панкреатическая липаза в. глутатион, цистеин, SH-группы меркаптанов

г. металлы (катионы): Mg и Mn (киназы), K (енолаза) Co Zn Fe Cu (цитохромоксидазы)

д. анионы: СI – аденилатциклаза, амилаза, оксидоредуктаза

Ингибиторы:

а. факторы денатурации: соли тяжелых металлов, кислоты, щелочи, ацетон б. лекарства: сульфаниламиды (п-аминобензойная кислота), боевые отравляющие вещества (фосфорорганические – ацетилхолинэстераза)

КЛАССИФИКАЦИЯ ФЕРМЕНТОВ

В основу положен тип катализируемой реакции. Каждый фермент имеет свой шифр из 4 цифр. Первая цифра – это номер класса: всего 6.

1. Оксидоредуктазы: перенос ẽ и Н+ - окислительно-восстановительные реакции

ẽ		1.1.	Дегидрогеназы
Д окис. + А восс. ↔ Д+ восс.	+ А− окис.	1.2.	Редуктазы
		1.3.	Оксидазы
Н+		1.4.	Оксигеназы
Д восс. + А окис. ↔ Д−окис. + А+восс.		1.5.	Антиоксидантные ферменты
2. Трансферазы: перенос групп атомов и радикалов
		2.1.	Киназы
Д-R + А ↔ Д	+ А- R	2.2.	Ацилтрансферазы
Донор Акцептор		2.3.	Аминотрансферазы
		3.4.	Метилтрансферазы

3. Гидролазы: расщепление внутримолекулярных связей с присоединением элементов Н2О

3.1.Гликозидазы

		НО-Н			3.2. Эстеразы (Липазы, Фосфатазы)
	S	S1	–ОН + S2	–Н
					3.3.	Пептидазы
					3.4.	Нуклеазы

4. Лиазы (синтазы): отщепление группы атомов от S с образованием двойных связей или присоединение группы атомов по двойным связям

	S ↔	S1 ═ S2	+ R	4.1.	Декарбоксилазы
				4.2.	Синтазы
				4.3.	Альдолазы

5. Изомеразы: реакции изомеризации – перенос атомов и групп атомов в пределах одной молекулы

S1 ↔ S2	5.1.	Изомеразы
	5.2.	Мутазы

6. Синтетазы (лигазы): синтез веществ с обязательным участием АТФ

			6.1.Ацил-КоА-синтетаза
	АТФ		6.2.ДНК-лигаза
S1 + S2		S
			6.3.РНК-полимераза

ОСНОВНЫЕ ТЕРМИНЫ И ПОНЯТИЯ

Активность фермента – способность фермента изменять определенное количество субстрата за единицу времени.

За единицу активности фермента принято считать такое количество фермента, которое изменяет 1 мкмоль (1 моль = 106 мкмоль) субстрата за 1 мин при 25оС.

Активный центр – участок молекулы фермента, в котором происходит связывание и катализ субстрата.

Аллостерический ингибитор – ингибитор, вызывающий обратимые изменения в структуре активного центра молекулы фермента. Это ведет к потере каталитической активности фермента.

Аллостерический фермент – регуляторный фермент, каталитическая активность которого контролируется через аллостерический центр химическими веществами (аллостерическими модификаторами).

Денатурация – потеря белками (ферментами) их естественных (нативных) свойств вследствие нарушения третичной структуры их молекул в результате действия денатурирующих факторов.

Изоэлектрическая точка (pI) — кислотность среды (pH), при которой определённая молекула или поверхность не несёт электрического заряда. Каждый белок обладает своим значением pI, и оно является константой.

Изменение каталитической эффективности фермента – все изменения активности фермента, происходящие при его постоянном количестве в системе.

Каталитическая эффективность - это удельная активность фермента: отношение активности фермента к его массе, вступившей в реакцию.

Количество оборотов - количество молекул субстрата измененных с помощью одной молекулы фермента за 1 секунду.

Компартментация – разделение метаболических процессов так, чтобы они происходили независимо друг от друга и не вмешивались в процессы, происходящие в каждом из отсеков (компартменте).

Константа скорости реакции – коэффициент пропорциональности, выражающий скорость химической реакции при концентрации реагирующих веществ, равной 1 моль\л.

Обновление ферментов – сочетание процессов синтеза и распада фермента. Скорость реакции – изменение количества вещества одного из реагирующих веществ в единицу времени в единице реакционного объема.

Измеряется в молях на литр на секунду [моль\л∙с].

Субстрат - вещество, подвергающееся изменению со стороны фермента в ходе каталитического акта.

Фермент – биологический катализатор белкового происхождения, осуществляющий биохимические реакции.

Энергия активации – энергия, необходимая для того, чтобы вещество вступило в реакцию.