Методическое пособие биохимия человека

II. ТЕМЫ СЕМИНАРОВ.

ЗАНЯТИЕ 1. БЕЛКИ.

Вопросы для подготовки:

1.Белки - важнейшие компоненты организма: функции, классификация, форма и размеры белковых молекул.

2.Физико-химические свойства: растворимость, оптическая активность, ионизация, изоэлектрическая точка, осаждение белков.

3.Первичная структура белков, характеристика, значение. Наследственные и приобретенные протеинопатии. Полиморфизм белков.

4.Вторичная и третичная структуры, характеристика. Типы внутримолекулярных связей в белках. Нативная структура и денатурация белков. Структура белков и функция.

5.Четвертичная структура белков. Кооперативный эффект. Способность белков к специфическим взаимодействиям. Самосборка белков.

6.Схема и методы выделения индивидуальных белков и характеристика гомогенности выделенного белка. Количественные определения белков.

Темы докладов:

1.Биологическая роль иммуноглобулинов.

Литература:

1.Ленинджер А. Основы биохимии. М.: Мир, 2006.

2.Овчинников Ю.А. Биоорганическая химия. М.: Просвещение, 1987.

3.Степанов В.М. Молекулярная биология. Структура и функции белков: Учебное пособие для биол. спец. вузов / под ред. А.С. Спирина. М.: Высшая школа, 2002. 335 с.

4.Страйер Л. Биохимия. М.: Мир, 2008

5.Уайт А., Хендлер Ф., Смит Э. и др. Основы биохимии. М.: Мир, 1981, Т. 1-3.

6.Якубке Х.Д. Ешкайт Х. Аминокислоты, пептиды, белки. М.: Мир, 1985.

7.Комов В.П., Шведова В.Н. Биохимия:Учеб. для вузов. М.:Дрофа, 2004. 640с.

ЗАНЯТИЕ 2. ФЕРМЕНТЫ.

Вопросы для подготовки:

1.Понятие ферменты. Основные части ферментативной молекулы.

2.Активный центр ферментативной молекулы.

71

3.Небелковые части ферментов: кофакторы, коферменты, простетические группы.

4.Свойства ферментов, специфичность, зависимость активности от рН, термолабильность.

5.Единицы измерения ферментативной активности.

6.Кинетика ферментативных реакций. Уравнение МихаэлисаМентен и его вывод. Кs, Km, Vmax.

7.Ингибиторы, их классификация. Кинетические параметры ферментов в присутствии различных типов ингибиторов.

8.Причины высокой каталитической активности ферментов. Теория переходного состояния.

9.Механизм действия ферментов. Теории в историческом плане. Гипотеза индуцированного соответствия фермента и субстрата Кошланда.

10.Регуляция ферментативной активности в клетках.

11.Аллостерические ферменты.

12.Изоферменты.

13.Классификация ферментов. Номенклатура.

14.Локализация ферментов в клетке.

Темы докладов:

1.Преобразования уравнения Михаэлиса-Ментен.

2.Диагностическое значение определения активности отдельных

ферментов. Литература:

1.М.Диксон, Э. Уэбб Ферменты. /Пер. с англ. М.: Мир, 1982. в 3-х т.

2.Бернхард С. Структура и функция ферментов. М.: Мир, 1971. 334с.ъ

3.Коэн Ф. Регуляция ферментативной активности. М.: Мир, 1986. 144с.

4.Корниш-Боудэн Э. Основы ферментативной кинетики. М.: Мир, 1979. 280с.

5.Курганов Б.И. Аллостерические ферменты. М. Наука, 1978. 248с.

6.Плакунов В.К. Основы энзимологии. М.: Логос, 2011. 128с.

7.Райдер К., Тейлор К. Изоферменты. М.: Мир, 1983. 107с.

8.Розанов А.Я. Ферментативные процессы и их коррекция при экстремальных состояниях. Киев: Здоров'я, 1985. 208с.

9.Химическая энзимология. / Под ред. И.В. Березина, К. Мартинека. М.: Изд-во МГУ, 1983. 277с.

10.Шугалей В.С., Кесслер Р.М. Ферментология. Ростов-на- Дону: Изд-во Рост. ун-та, 1986. 91с.

11.Ленинджер А. Основы биохимии. М.: Мир, 2004.

12.Комов В.П., Шведова В.Н. Биохимия:Учеб. для вузов.

М.:Дрофа, 2004. 640с.

72

ЗАНЯТИЕ 3. МЕТАБОЛИЗМ УГЛЕВОДОВ.

Вопросы для подготовки:

1.Углеводы как энергетические субстраты

2.Общая характеристика гликолиза

3.Ферментативные стадии собирательной стадии гликолиза.

4.Ферментативные стадии окислительной стадии гликолиза.

5.Суммарное уравнение гликолиза

6.Регуляция гликолиза

7.Фосфорилирование АТФ на уровне субстрата.

8.Энергетический баланс гликолиза.

9.Общая характеристика пентозофосфатного пути

10.Стадии ПФП

11.Трансальдолазные и транскетолазные реакции и их смысл Темы докладов:

1.Метаболизм гликогена, гормональная регуляция. Литература:

1.Браунштейн А.Е. Процессы и ферменты клеточного метаболизма. М.: Наука, 1987. 546с.

2.Теппермен Д, Теппермен Х. Физиология обмена веществ и эндокринной системы. М.: Мир, 1989. 653с.

3.Ньюсхолм Э. Регуляция метаболизма. М.: Мир, 1977. 407с.

4.Мак-Мюррей У. Обмен веществ у человека. М.:Мир, 1980. 368с.

5.Ленинджер А. Основы биохимии. М.: Мир, 1985.

6.Комов В.П., Шведова В.Н. Биохимия:Учеб. для вузов. М.:Дрофа, 2004. 640с.

ЗАНЯТИЕ 4. ЦИКЛ КРЕБСА И ДЫХАТЕЛЬНАЯ ЦЕПЬ.

Вопросы для подготовки:

1.Источники промежуточных продуктов для ЦТК (пирувата и ЩУК).

2.Пируватдегидрогеназный комплекс, механизм действия, биологическая роль.

3.Цикл Кребса, его стадии.

4.Баланс цикла Кребса

5.Регуляция.

6.Понятие окислительно-восстановительный потенциал в приложении к биологическим системам.

7.Характеристика компонентов дыхательной цепи.

8.Перенос электронов в дыхательной цепи, биологический смысл.

9.Гипотезы сопряжения механизмов окисления и фосфорилирования

Темы докладов:

1. Макроэргические соединения. Литература:

73

1.Ленинджер А. Основы биохимии. М.: Мир, 1985.

2.Овчинников Ю.А. Биоорганическая химия. М.: Просвещение, 1987.

3.Комов В.П., Шведова В.Н. Биохимия:Учеб. для вузов. М.:Дрофа, 2004. 640с.

ЗАНЯТИЕ 5. КАТАБОЛИЗМ АМИНОКИСЛОТ.

Вопросы для подготовки:

1.Аминокислоты как энергетические субстраты

2.Трансаминирование и трансаминазы

3.Окислительное дезаминирование аминокислот

4.Способы вывода аммонийного азота из организма у различных классов животных

5.Цикл мочевины. Реакции

6.Энергетический баланс цикла мочевины

7.Связь цикла мочевины и ЦТК

8.Судьба углеродных скелетов аминокислот С3

9.Судьба углеродных скелетов аминокислот С4

10.Судьба углеродных скелетов аминокислот С5

11.Наследственные нарушения обмена аминокислот

Темы докладов:

1.Регуляция процесса распада белков. Литература:

1.Ленинджер А. Основы биохимии. М.: Мир, 1985.

2.Овчинников Ю.А. Биоорганическая химия. М.: Просвещение, 1987.

3.Якубке Х.Д. Ешкайт Х. Аминокислоты, пептиды, белки. М.: Мир, 1985.

4.Мак-Мюррей У. Обмен веществ у человека. М.:Мир, 1980. 368с.

5.Комов В.П., Шведова В.Н. Биохимия:Учеб. для вузов. М.:Дрофа, 2004. 640с.

ЗАНЯТИЕ 6. МЕТАБОЛИЗМ ЛИПИДОВ.

Вопросы для подготовки:

1.Общая характеристика, биологические функции и классификация липидов.

2.Характеристика отдельных классов липидов.

3.Строение, биологические функции и свойства биологических мембран.

4.Переваривание и всасывание липидов пищи.

5.Транспорт липидов.

6.Катаболизм триацилглицеролов.

7.Окисление жирных кислот (α, β, ω-окисление).

74

8.Кетоновые тела.

9.Биосинтез жирных кислот.

10.Биосинтез триацилглицеролов и глицерофосфолипидов.

11.Биосинтез стероидов.

12.Регуляция липидного обмена.

Темы докладов:

1. Стероидные гормоны. Литература:

1.Климов А.Н., Никульчева Н.Г. Обмен липидов и липопротеидов и его нарушения. СПб:Питер Ком, 1999. 512с.

2.Геннис Р. Биомембраны: Молекулярная структура и функции.

М.:Мир, 1997. 624с.

3.Мак-Мюррей У. Обмен веществ у человека. М.:Мир, 1980. 368с.

4.Комов В.П., Шведова В.Н. Биохимия:Учеб. для вузов. М.:Дрофа, 2004. 640с.

5.Ленинджер А. Основы биохимии. М.: Мир, 1985.

ЗАНЯТИЕ 7. ВИТАМИНЫ.

Защита рефератов по теме «Витамины» Темы докладов:

1.Витамин В1. История открытия и изучения, химическое строение, физико-химические свойства, распространение и суточная потребность, биологическая роль.

2.Витамин В2. История открытия и изучения, химическое строение, физико-химические свойства, распространение и суточная потребность, биологическая роль.

3.Витамин ВЗ. История открытия и изучения, химическое строение, физико-химические свойства, распространение , суточная потребность, биологическая роль.

4.Витамин В5. История открытия и изучения, химическое строение, физико-химические свойства, распространение, суточная потребность, биологическая роль.

5.Витамин В6. История открытия и изучения, химическое строение, физико-химические свойства, распространение, суточная потребность, биологическая роль.

6.Витамин В12. История открытия и изучения, химическое строение, физико-химические свойства, распространение, суточная потребность, биологическая роль.

7.Витамин ВН. История открытия и изучения, химическое строение, физико-химические свойства, распространение, суточная потребность, биологическая роль.

8.Витамин Вс. История открытия и изучения, химическое строение, физико-химические свойства, распространение, суточная потребность, биологическая роль.

9.Витамин С. История открытия и изучения, химическое строение,

75

физико-химические свойства, распространение, суточная потребность, биологическая роль.

10.Витамины группы А. История открытия и изучения, химическое строение, физико-химические свойства, распространение, суточная потребность, биологическая роль.

11.Витамины группы К. История открытия и изучения, химическое строение, физико-химические свойства, распространение, суточная потребность, биологическая роль.

12.Витамины группы Д. История открытия и изучения, химическое строение, физико-химические свойства, распространение, суточная потребность, биологическая роль.

13.Витамины группы Е. История открытия и изучения, химическое строение, физико-химические свойства, распространение, суточная потребность, биологическая роль.

14.Витаминоподобные соединения. История открытия и изучения, химическое строение, физико-химические свойства, распространение, суточная потребность, биологическая роль.

76

ПРИГОТОВЛЕНИЕ РЕАКТИВОВ:

1.Аммиачный раствор серебра. К 1-3% раствору нитрата серебра прибавляют концентрированный раствор аммиака до растворения образующегося осадка; образуется так называемый аммиачный раствор гидрооксида серебра.

2.Биуретовый реактив. Растворяют 0,15 г CuSO4 5H2O и 0,6 г NaKC4H4O6 4H2O (виннокислый натрий-калий или сегнетовая соль) в 50 мл воды при энергичном перемешивании, приливают 30 мл 10% раствора NaOH (свободного от Na2CO3), добавляют 0,1 г KI для предотвращения самопроизвольного восстановления и доводят раствор водой до объема 100 мл (хранят в холодильнике в парафинированной склянке).

3.2,6-Дихлорфенолиндофенол, натриевая соль, 0,001 н

раствор. Для приготовления этого реактива применяют буферную фосфатную смесь (1/15 М) по Серенсену, так как индикатор водном растворе довольно быстро разрушается. Для этого берут водные

растворы KH2PO4 – 9.078 г в 1 литре Na2HPO4 2H2O – 11,867 г в 1

литре. Растворы хранят отдельно. Затем их смешиваю в соотношении 2:3; рН смеси 6,9-7,0. Отвешивают 0,25 г красителя, приливают 700 мл воды, взбалтывают и добавляют 300 мл буферной смеси. На следующий день раствор отфильтровывают и тщательно перемешивают. Определяют титр по тированному раствору соли Мора. Для этого точно отмеривают в маленькую коническую колбочку 10 мл индикатора, добавляют 5 мл насыщенного раствора оксалата аммония и тируют из микробюретки 0,01 н. Раствором соли Мора до тех пор, пока голубой цвет индикатора не сменится соломенножелтым. Для получения 0,01 н раствора соли Мора 3,92 г соли растворяют в 1 л 0,02 н раствора серной кислоты. Титр соли Мора устанавливают по 0,01 н раствору перманганата калия.

4.Крахмал 0,1% раствор (рабочий раствор) для определения активности амилазы в сыворотке крови: 100 мг растворимого крахмала суспендируют в 1 мл холодной воды и количественно переносят для растворения в кипящую воду. После охлаждения при комнатной температуре объем доводят до 100 мл водой. Раствор крахмала годен при хранении в холодильнике 5 дней.

5.Раствор белка для цветных реакций: 10 г белка куриных яиц растворяют в 100 мл воды – получают 1% раствор белка (10 г яичного белка содержится в 1 г белка). Белок одного куриного яйца растворяют в 250 мл воды, фильтруют через слой марли и хранят в холодильнике. Можно взять лошадиную сыворотку развести ее 0,85% раствором NaCl в 5 раз; хранят в холодильнике.

6.Раствор яичного белка для гидролиза. Белок от двух куриных яиц растворяют в 1 л воды, фильтруют через слой марли; хранят в холодильнике. Гидролизат яичного белка: 8 белков растворяют в 4 литра воды фильтруют через марлю и переносят в большую

77

круглодонную колбу с воздушным холодильником и добавляют 1 л концентрированной HCl. Смесь кипятят на асбестовой сетке 45 мин от начала кипения, затем фильтруют. Активированный уголь не используют.

7.Раствор яичного белка для реакций осаждения (не высаливанием). Белки куриных яиц отделяют от желтков, смешивают

с19-20 кратным объемом воды и фильтруют через складчатый фильтр или несколько слоев марли. Раствор белка для высаливания: 3 белка куриных яиц смешивают с 700 мл воды и с 300 мл насыщенного раствора NaCl.

8.Растворы аминокислот для хроматографии. Аминокислоты растворяют в концентрации 1/25 М.

В 10 мл воды растворяют:

глутаминовой кислоты	60 мг
аланина	40 мг
лейцина	50 мг

Можно также пользоваться следующими сочетаниями аминокислот

(на 10 мл воды):
1.	глутаминовой кислоты	60 мг
глицина		40 мг
аланина		40 мг
2.	глутаминовой кислоты	60 мг
лейцина		50 мг
3.	аспарагиновй кислоты	60 мг
серина		40 мг
лейцина		60 мг
4.	аспарагновой кислоты	60 мг
глицина		40 мг
Лейцина		60 мг

Для ускорения растворения аминокислот можно растворять их при нагревании на водяной бане.

9.Раствор йода 10% в йодиде калия. В 50 мл воды растворяют

20 г йодида калия и 10 г йода и доводят водой до объема 100 мл. для реакции на крахмал полученный раствор разводят в 10 раз.

10.Реактив Милона. В 60 мл концентрированной азотной кислоты (относительная плотность 1,40) растворяют 40 г ртути при комнатной температуре, затем помещают на теплую водяную баню до прекращения выделения бурых паров окисла азота и перемешивают. После этого добавляют двойной объем воды (120 мл) и полученный раствор разбавляют водой 1:1.

11.Реактив Фоля. К 5% водному раствору ацетата свинца прибаляют 30% раствор едкого натра (равный объем до растворения образовавшегося мутного осадка).

12.Реактив Фелинга. Медный купорос х.ч. выкристаллизовывают из горячего раствора и высушивают на фильтровальной бумаге. Готовят

78

отдельно два раствора: а) 200 г сегнетовой соли и 150 г едкого натра разводят в мерной литровой колбе и доводят водой до метки; б) 40 г медного купороса разводят в литровой колбе вместимостью 1 л и доводят водой до метки. Перед употреблением смешивают равные объемы этих растворов.

13.Раствор едкого натра (0,1 н) 50 г х.ч. едкого натра и 40 мл воды

не содержащей СО2 (для удаления СО2 воду можно прокипятить), тотчас же переливают в плотно закрывающуюся каучуковой пробкой склянку и оставляют стоять на несколько дней, чтобы выкристаллизовалась сода, нерастворимая в крепком едком натре; 6 мл щелочи разбавляют водой (без СО2) в мерной колбе вместимостью 1 л до метки. Проверяют нормальность раствора по фиксаналу 0,1 н HCl. 0,05 н NaOH готовят ex tempore: 10 мл 0,1 н раствора NaOH

доводят до объема 20 мл.

Раствор едкого натрия (0,01) готовят из 0,1 н раствора: 100 мл этого раствора доводят до 1 л прокипяченной дистиллированной водой.

14.Раствор серной кислоты 0,1 н. 2,8 мл серной кислоты

(относительная плотность 1,84) доводят до объема 1 л водой. Титр устанавливают по тированному раствору едкого натра. 0,001 н раствор серной кислоты готовят из 0,1 н раствора: 100 мл этого раствора доводят до 1 л водой.

15. Фосфатный буфер М 15. отдельно растворяют 11,9 г двузамещенного фосфата натрия и 9,1 г однозамещенного фосфата калия в прокипяченной дистиллированной воде и доводят объем каждого раствора до 1 л. Для получения буферных растворов с нужным рН смешивают полученные растворы в следующих соотношениях.

рН	Количество		1/15 М	рН	Количество		1/15 М
смеси	раствора, мл			смеси	раствора, мл
	Na2HPO4		KH2PO4		Na2HPO4	KH2PO4
5.59	0.5		9.5	6.98	6.0		4.0
5.91	1.0		9.0	7.17	7.0		3.0
6.24	2.0		8.0	7.38	8.0		2.0
6.47	3.0		7.0	7.72	9.0		1.0
6.64	4.0		6.0	8.04	9.5		0.5
6.81	5.0		5.0

79

	ОГЛАВЛЕНИЕ
ТЕХНИКА БЕЗОПАСНОСТИ ПРИ РАБОТЕ В УЧЕБНОЙ ЛАБОРАТОРИИ .............		4
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 1 .........................................................................		7
ЦВЕТНЫЕ РЕАКЦИИИ НА БЕЛКИ И АМИНОКИСЛОТЫ.......................................		7
1.	Биуретовая реакция..................................................................................	8
2.	Нингидриновая реакция.............................................................................	9
3.	Ксантопротеиновая реакция (Мульдера)...................................................	11
4.	Реакция Фоля. ........................................................................................	12
5.	Реакция на тирозин (Миллона).................................................................	13
6.	Реакции на триптофан (Адамкевича и Шульца-Распайля)..........................	13
7.	Реакция на аргинин (Сакагучи).................................................................	15
Вопросы для самоконтроля.........................................................................		15
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 2. ......................................................................		16
ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЙ МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ АМИНОКИСЛОТ.................		16
Радиальная (распределительная) жидкостная хроматография......................		18
Вопросы для самоконтроля:........................................................................		20
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 3 .......................................................................		21
КИСЛОТНЫЙ ГИДРОЛИЗ И ФОРМОЛОВОЕ ТИТРОВАНИЕ ПО СЕРЕНСЕНУ.....		21
1.	Кислотный гидролиз................................................................................	22
2.	Формоловое титрование..........................................................................	22
Вопросы для самоконтроля:........................................................................		23
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 4 .......................................................................		24
ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА БЕЛКОВ..................................................		24
1.	Осаждение белков при кипячении. ...........................................................	25
2.	Реакции осаждения белков при комнатной температуре нейтральными
солями — высаливание. .............................................................................		27
3.	Диализ белка..........................................................................................	28
4.	Осаждение белков солями тяжелых металлов. .........................................	29
5.	Осаждение белков концентрированными минеральными кислотами...........	30
6.	Осаждение белков органическими кислотами............................................	30

80