Микробиология

71

9. Тщательно прокаливают петлю. Прокаливание петли начинают о участка проволоки, примыкающего к кольцу, для того, чтобы микробная масса, оставшаяся на петле, подсохла. Затем петлю переводят в вертикальное положение и прокаливают докрасна. Такой порядок стерилизации петли необходим потому, что при быстром нагревании влажной микробной массы происходит ее разбрызгивание и образование аэрозоля, что может загрязнить воздух. Только после прокаливания петлю можно положить на место (в штатив).

10.Отставив в сторону пробирку с исходной культурой, но не выпуская из рук вновь засеянной пробирки, подписывают (если этого не было сделано заранее) на ней название засеянного микроорганизма и дату посева. Только после этого пробирку с посеянным материалом ставят в штатив или коробку, которую затем помещают в термостат на сутки-двое для выращивания культуры.

Посев на жидкие и полужидкие среды

Техника и принципы посева на жидкие и полужидкие среды в основном такие же, как и на плотные среды. Как отличительные особенности нужно учесть следующее:

1.Недопустимо, чтобы жидкость питательной среды выливалась при перемещениях пробирки.

2.Нужно следить, чтобы жидкость не смачивала краев пробирки и ватномарлевый тампон.

3.При пересеве можно пользоваться петлей, стерильной градуированной пипеткой или стерильной пастеровской пипеткой. Капилляр пастеровской пипетки отламывают прокаленным пинцетом или стерильным ватно-марлевым тампоном, после чего пипетку вносят в посевной материал. Набирают жидкость с материалом путем засасывания пипеткой. При этом в другом конце пипетки должна находиться вата для предупреждения выхода материала за пределы пипетки. В практике микробиологических лабораторий пользуются обычно медицинскими грушами для создания разряжения и засасывания материала. Их с помощью резиновых шлангов соединяют с пипеткой, перед соединением ставят зажим Мора. При отсутствии таких приспособлений пользуются пальцевым прижатием пипетки со стороны, где размещается вата. В микробиологии строго запрещается создание разряжения в пипетке и засасывание материала ртом. После взятия необходимого количества материала, пипетку переносят во вторую пробирку(или другой сосуд) со свежей средой, куда и выдувают содержимое. Для этого конец пипетки опускают в среду, пробулькивание материала не допускается из-за опасности создания аэрозоля. После посева пипетки немедленно помещают в дезинфицирующий раствор.

Посев уколом

Такой посев в агар столбиком(прямой агар) применяется для выращивания анаэробов или выявления характерного признака микроорганизма, т.к. рост по уколу типичен для многих микроорганизмов.

72

Рис.5 - Разжижение желатины при посеве уколом (схема)

При посеве уколом в столбик желатины наблюдается разжижение ее у бактерий, обладающих протеолитическими ферментами. Посев уколом практикуется также с целью длительного хранения культур.

Процесс разжижения желатины идет сверху, причем многие виды микроорганизмов делают характерную для них форму разжижения(рис.6): в форме гвоздя - холерийный вибрион, в форме чулка - стафилококк, послойное (т.е. идущее ровно сверху вниз) - синегнойная палочка и т.д.

При посеве уколом пробирку с прямым агаром или столбиком желатины держат дном кверху (рис. 7), вынимают пробку и обжигают край пробирки. Материал, содержащий микроорганизмы, забирают простерилизованной на пламени длинной прямой иглой и прокаливают ею столбик питательной среды снизу вверх почти до самого дна пробирки. Вынимают иглу, обжигают края пробирки и пробки, закрывают пробирку, прожигают иглу, ставят ее в штатив, надписывают пробирку и помещают ее в штатив, а затем и в термостат.

Рис.7 - Посев уколом

Посев на плотную среду в чашки Петри

Для посева заранее готовят стеклянные шпатели, завернутые в бумагу и простерилизованные. Чашку Петри с плотной питательной средой приоткрывают настолько, чтобы в образовавшуюся щель свободно проходили бактериологическая петля, пипетка или шпатель. Материал вносят петлей или пипеткой (рис. 8), а уже затем равномерно распределяют по всей поверхности для получения ровного газона шпателем.

73

Все описанные манипуляции следует проводить около пламени горелки (но не в пламени), по возможности быстро, чтобы не загрязнять культуру посторонними микроорганизмами. После пересева в пробирки, чашки Петри и другие сосуды, в которых выращивались микроорганизмы, помещают в термостаты (термальные комнаты), где с помощью терморегуляторов поддерживается постоянная заданная температура. Посуду с культурами микроорганизмов, подлежащими уничтожению, следует автоклавировать, чтобы убить микробов, и только после этого мыть. Культуры на плотных питательных средах можно на сутки заливать дезинфицирующим раствором, после чего их выбрасывают и посуду моют.

Рис.8 - Посев на плотную среду а чашки Петри петлей и распределение материала по поверхности среды питателем

3. Техника безопасности

При выполнении практического занятия по изучению способов приготовления питательных сред, подготовки посуды для культивирования микроорганизмов, изучению состава питательных сред и техники посевов культур микробов в жидкие, полужидкие и на плотные среды, необходимо неукоснительно соблюдать правила, обязательные при работе с культурами микроорганизмов, газовыми горелками, сосудами, работающими под давлением(автоклавы), лабораторной стеклянной посудой, электрооборудованием.

4.Вопросы по теме занятия

1.Для чего микроорганизмам нужны питательные вещества?

2.Какие элементы питательных сред нужны микроорганизмам для нормального роста и развития?

3.Как питательные среды подразделяются по консистенции?

4.Как классифицируют питательные среды по целевому назначению?

5.Расскажите о предназначении и составе основных(натуральных и синтетических), элективных и дифференциально-диагностических сред.

74

6.Какая реакция среды(рН) используется при выращивании микроорганизмов?

7.Какие индикаторы добавляют в микробиологические питательные среды?

8.Какое количество общего и аминного азота требуется для выращивания большинства микроорганизмов?

9.Как готовится мясная вода и мясо-пептонный бульон?

10.На чем основано приготовление триптических гидролизатов из мяса(по Хоттингеру)?

11.Как готовятся ферментативный и кислотный гидролизаты казеина?

12.Как приготовить дрожжевой аутодизат и для каких целей он используется?

13.Как готовят плотные (агаровые) питательные среды?

14.Как разливают агаровые среды в чашки Петри?

15.Расскажите об использовании сухих питательных сред.

16.Для каких целей в микробиологии используют среды Эндо, Левина, Плоскирева и как их готовят?

17.Как готовят и для каких целей используют среды Гисса?

18.Как готовят "кровяной" агар?

19.Какую лабораторную посуду используют для культивирования и как ее готовят?

20.Как стерильно извлечь культуру микроорганизма из пробирки?

21.Как пересеять культуру микроорганизма из пробирки в пробирку?

22.Расскажите о способах посева жидких и полужидких сред.

23.Как и для каких целей проводят посев уколом?

5. Литература по теме занятия

1. Руководство к практическим занятиям по микробиологии/ Н.С.Егорова. - М., изд-во МГУ, 1983.

2.Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования / Под ред. М.О.Бергера. - М., Медицина, 1982.

3.Лебедева М.Н. Руководство к практическим занятиям по медицинской микробиологии. - М., Медицина, 1973.

4. Методы общей бактериологии в трех томах/ Под ред. Ф.Герхардта и др. Пер. с англ., под ред. Е.Н.Кондратаевой и Л.В.Калакуцкого. -М., Мир, 1933.

5.Руководство к лабораторным занятиям по микробиологии/ Под ред. проф. Л.В.Борисова. - М., Медицина, 1984.

75

Лабораторная работа № 2.3.

Методы количественного учета микроорганизмов: определение количества клеток с помощью стандарта мутности, счетной камеры и чашечный метод Коха

1.Общие сведения

Оросте микроорганизмов в естественных субстратах или в питательных средах микробиологи судят по изменению количества клеток или биомассы микробов в процессе их культивирования. Такой подход основан на способности микроорганизмов размножаться, т.е. начинать и завершать клеточное деление, что предполагает возможность контроля увеличивающегося числа бактериальных дискретных единиц. При этом используются разные методы контроля(определения) количества клеток микроорганизмов: визуальным сравнением со стандартом мутности; нефелометрическим анализом культур; микроскопическим подсчетом микробных частиц в определенном объеме с применением счетных камер; элек- тронно-микроскопическим подсчетом бактерий, проходящих через соответствующий канал (жиклер); микрокультуральными методами и путем обычного визуального подсчета колоний, выросших на плотной среде в чашках Петри(чашечный метод).

Выбор метода для определения числа клеток или биомассы зависит от цели исследования, свойств питательной среды и условий выращивания, а также от особенностей роста и морфологии микроорганизмов. Поскольку в культуре микроорганизмов значительная часть клеток может быть мертвая, определение общего числа клеток и определение, основанное на подсчете живых микробов (чашечный и микрокультуральный методы), обеспечивают выявление различных количественных характеристик бактериальной культуры, которые в рутинной микробиологической практике получили названиеоптической концентрации (ОК) и

биологической концентрации (БК) микробных клеток. Оптическая концен-

трация (ОК) микроорганизмов подразумевает учет всех(живых и мертвых) клеток микробов. При определении биологической концентрации(БК) микроорганизмов проводится учет только жизнеспособных микробных клеток.

Методы подсчета живых клеток применимы толькок культурам, разбавленным до такой степени, что в них не происходит взаимодействия между клетками. Например, эти методы в принципе не пригодны для микроорганизмов, которые размножаются половым путем, требующим взаимодействия между мужской и женской особью.

2.Содержание лабораторного занятия

Цели занятия:

-освоить технику определения количества клеток микроорганизмов с помощью стандарта мутности Государственного НИИ стандартизации и контроля медицинских и биологических препаратов (ГИСК) им.Л.А.Тарасевича;

-ознакомиться с принципами метода нефелометрического определения количества клеток микроорганизмов;

76

-ознакомиться с методами подсчета клеток микроорганизмов под микроскопом с использованием счетной камеры Горяева-Тома, капилляров Перфильева, в окрашенных мазках методом Виноградского-Брида;

-освоить микрокультуральный метод определения числа микробов и -оз накомиться с основными принципами микрокультуральных методов подсчета живых микроорганизмов.

Оборудование

Культура микроорганизмов в пробирках, бактериологические петли, пипетки, спиртовки или газовые горелки, стандарты мутности ГИСК, стерильные пробирки, разводящий буферированный (или физиологический) раствор» микроскопы е. осветителями, камеры Горяева-Тома, чашки Петри с плотной питательной средой, термостат.

Ход работы

Определение количества клеток микроорганизмов

спомощью стандартов мутности

Вряде случаев количество клеток в суспензии достаточно определить визуально путем сравнения со стандартом мутности. Стандарты мутности представляют собой взвесь частиц стекла"Пирекс" диаметром 0.5-3.5 мкм в дистиллированной воде. Их выпускает ГИСК им.Л.А.Тарасевича. Взвесь частиц стекла "Пирекс" устойчива в химическом отношении, не коагулирует при седиментации частиц, при взбалтывании осадка образует взвесь исходной дисперсности и мутности.

За единицу мутности стандарта мутности общего назначения условно принята мутность суспензии живых клеток бактерий-возбудителей тифа в физиологических растворах, содержащих в 1 мл 100 млн клеток. Стандарт мутности включает несколько эталонов на5, 10, 20 международных единиц мутности. Мутность стандарта на 10 единиц соответствует следующей концентрации микроорганизмов: 850 млн/мл микробов кишечной группы, 10 млрд/мл микробов коклюшной группы, 1.5 млрд/мл бруцеллезных микробов, 2 млрд/мл холерных вибрионов, 4.5 млрд/мл туляремийных микробов.

К комплекту бактериальных эталонов прилагаются шрифтовая таблица, содержащая набор различных шрифтов, и две пустые пробирки, диаметр, толщина стенок и цвет стекла которых точно соответствуют пробиркам-эталонам, т.к. при сравнении микробной взвеси одной концентрации, содержащейся в пробирках разных диаметров, мутность жидкости будет неодинаковой.

Для приготовления микробной взвеси с помощью стандарта мутности обычно пользуются 18-48-часовыми микробными культурами, выращенными на скошенном мясо-пептонном агаре или другой плотной среде. Старые культуры микроорганизмов непригодны, т.к. они содержат большое количество мертвых клеток. Культуру из пробирки или чашки Петри берут петлей с микробного газона или смывают его полностью изотоническим раствором хлорида натрия с -по мощью бактериологической пипетки или шпателя. Для смыва культуры с матра-

77

ца используют заранее заготовленные бусы или мелкий гравий, который высыпают в матрац на поверхность газона, а затем пипеткой наливают 10-20 мл омывающей жидкости и плавными движениями рук встряхивают матрац в горизонтальной плоскости.

Небольшое количество (0.1-0.4 мл) полученного смыва набирают в стерильную градуированную пипетку объемом1-2 мл и переносят в стандартную пробирку или близкую к ней по диаметру и толщине стенок лабораторную пробирку. Далее к содержимому этой пробирки небольшими, но точно учитываемыми порциями приливают изотонический раствор хлорида натрия, сравнивая при этом мутность опытной пробирки с выбранным эталоном(стандартом мутности на 10 единиц).

Сравнение мутности в опытной и эталонной пробирках производят невооруженным глазом при хорошем дневном освещении в лучах падающего света, подложив под обе пробирки шрифтовую таблицу.

После уравнения мутности в опытной пробирке с эталоном мутности на 10 единиц можно, с целью контроля, провести сравнение опытной пробирки с эталонами на 5 и 20 единиц. Приготовленная взвесь должна быть более мутной, чем содержимое первого, и более прозрачной, чем содержимое второго эталонов. Зная количество изотонического раствора хлорида натрия, прибавленное к определенному объему исходной микробной взвеси, можно определить число микробных тел, содержащихся в 1 мл исходной бактериальной взвеси, и приготовить микробную взвесь любой необходимой концентрации.

Подсчет клеток микроорганизмов под микроскопом

Подсчитать клетки микроорганизмов под микроскопом можно, используя счетные камеры, капилляры Перфильева, препараты фиксированных и окрашенных клеток, приготовленные на предметных стеклах или мембранных фильтрах. Перечисленные методы позволяют определить общее количество клеток в единице объема. Следует помнить, что подсчитываются все клетки: как живые, так и мертвые. Основное ограничение большинства указанных методовнеобходимость достаточно высоких концентраций клеток в единице исследуемого -суб страта.

Подсчет клеток в счетных камерах

Этот метод рекомендуется использовать для подсчета крупных объектовдрожжей, одноклеточных водорослей, конидий грибов и некоторых относительно крупных бактерий. Обычно используют камеру Горяева-Тома (рис.3), хотя можно применять и другие счетные камеры. Камера представляет собой толстое предметное стекло, разделенное бороздками. На центральную часть стекла нанесена сетка. Площадь квадрата сетки указана на одной из сторон предметного стекла и соответствует 0.04 мм2 (большой квадрат) или 0.0025 мм2 (малый квадрат). Может быть указано 1/25 мм2 или 1/400 мм2 соответственно.

Часть предметного стекла, на который нанесена сетка, на 0.1 мм ниже двух других сторон. Это глубина камеры, она всегда указывается на предметном стекле.

78

При работе с камерой необходимо соблюдать особый порядок ее заполнения. Вначале углубление с сеткой покрывают специальным шлифованным -по кровным стеклом и, слегка прижимая, смещают покровное стекло в противоположные стороны до появления колец Ньютона. Это указывает на то, что покровное стекло притерто к сторонам камеры. Только при таком условии объем взвеси микроорганизмов, находящийся в камере, соответствует расчетному. После этого камеру заполняют исследуемой суспензией микроорганизмов. Суспензию вносят через бороздку камеры капилляром или пипеткой. Подсчет клеток рекомендуется начинать через 3-5 мин после заполнения камеры, чтобы клетки осели и при микроскопировании были видны в одной плоскости. Подвижные клетки перед заполнением камеры, убивают нагреванием или суспендированием в 0.5%-ном растворе формалина.

Число клеток подсчитывают с объективом8x или 40х. С иммерсионным объективом работать нельзя, т.к. его фокусное расстояние меньше толщины стекла камеры. Обычно подсчитывают клетки микроорганизмов в 10 больших или 20 малых квадратах сетки, перемещая подсчет по диагонали. Учитывают все клетки, лежащие в квадрате сетки, а также клетки, пересекающие верхнюю и правую стороны квадрата, при подсчете количество клеток в большом квадрате не должно превышать 20, а в малом 10, в противном случае суспензию разводят водопроводной водой. Для получения достоверного результата общее число подсчитанных клеток должно быть не менее 600 (3 повтора по 200 клеток при однократном монтаже камеры).

Рис.3 - Камера Горяева-Тома:

А - вид сверху, В - вид сбоку, Б - при малом увеличении микроскопа

Точность определения зависит от того, насколько плотно пришлифовано стекло к поверхности камеры, поэтому подсчет клеток лучше повторять 3-4 раза, каждый раз заново монтируя камеру и заполняя ее исследуемой взвесью микроорганизмов. Это обеспечивает большую точность, чем подсчет 600 клеток при однократном монтаже камеры. Количество клеток (М) в 1 мл (см3) исследуемой суспензии вычисляют по формуле:

79

М = а ×103 × n h × S

где: а -среднее число клеток в квадрате сетки; 103 - коэффициент перевода (мм3 в CM3);

h - глубина камеры (мм);

S - площадь квадрата сетки (мм2);

n - разведение исследуемой суспензии.

Определение числа клеток высевом на питательные среды

В отличие от подсчета клеток под микроскопом, этот метод дает возможность определить число только жизнеспособных клеток в популяции. Поскольку сред, одинаково пригодных для роста различных микроорганизмов, не существует, метод высева дает возможность определить число клеток микроорганизмов, способных расти на среде данного посева, но не позволяет учесть те микроорганизмы, которые на ней не растут или растут крайне медленно.

Микрокультуральный количественный анализ основан либо на определении колониеобразующих единиц - классический чашечный метод, либо на учете популяциеобразующих единиц - классический метод предельных разведении. В основе обоих методов лежит предположение о том, что для образования популяции в жидкой среде или колонии на плотной среде необходимо и достаточно наличия в исследуемом образце одной живой микробной клетки.

Определение количества клеток высевом на плотные питательные среды (чашечный метод Коха)

Сущность метода заключается в высеве определенного объема исследуемой суспензии микроорганизмов в чашки Петри и подсчета выросших после инкубации колоний. Принято считать, что каждая колония - потомство одной клетки. Работа этим методом включает три этапа: приготовление разведений, посев в плотную среду на чашки Петри, подсчет выросших колоний.

Приготовление разведений. Разведения исследуемой суспензии готовят на стерильном физиологическом растворе(0.85%-ный раствор хлорида натрия), используя постоянный коэффициент разведения, чаще всего равный 10. В ходе опыта целесообразно использовать один и тот же коэффициент разведения, т.к. это уменьшает вероятность ошибки. Для приготовления разведений стерильным физиологическим раствором разливают по 9 (4.5) мл в стерильные сухие пробирки. Затем 1 (0.5) мл исследуемой суспензии стерильной пипеткой переносят в пробирку с 9 (4.5) мл физиологического раствора - это первое разведение, 10-1. Полученное разведение тщательно перемешивают новой стерильной пипеткой, вбирая и в пипетку и выпуская из нее полученную взвесь. Эту процедуру выполняют 3-5 раз. Затем этой же пипеткой отбирают 1 мл полученной суспензии и переносят во вторую пробирку - получается второе разведение, 10-2. Таким же образом готовят и последующие разведения. Количество разведений зависит от плотности исследуемой популяции микроорганизмов: соответственно она тем больше, чем больше плотность популяции. Обычно перед проведением серийных десятикратных разведений исследуемую суспензию разводят до 108-109 микробных кле-

80

ток в мл с помощью оптического стандарта мутности ГИСК им.Л.А. Тарасевича, что существенно облегчает проведение эксперимента и подсчет результата.

Следует помнить, что для приготовления каждого разведения необходимо обязательно сменить (использовать новую) пипетку. Пренебрежение этим правилом приводит к получению ошибочного результата.

Проведение посева. Высевать суспензию можно поверхностным или глубинным способом. Перед посевом поверхностным способом разливают расплавленную питательную среду в ряд стерильных чашек Петри по 15-20 мл в каждую. Чашки оставляют на горизонтальной поверхности, пока среда не застынет. Поверхность агаризованных сред перед посевом рекомендуется подсушивать для удаления конденсационных вод. С этой целью чашки Петри открывают и- за стывшей средой вниз помещают на край крышки на20-40 мин в термальную комнату или сушильный шкаф при температуре35-70°С. Следует помнить, что все операции с лабораторной посудой с готовыми к употреблению средами необходимо проводить с максимальным соблюдением антисептики и асептики. Агаризованную среду можно подсушить, поместив чашки Петри на 2-3 суток крышками вниз (не открывая), при комнатной температуре. После того, как среда приготовлена, на ее поверхность стерильной пипеткой наносят точно измеренный объем (0.05 или 0.1 мл) соответствующего разведения и распределяют его стерильным стеклянным шпателем по поверхности среды (рис.5).

Рис.5 - Схема приготовления разведений и рассева суспензии микроорганизмов поверхностным способом (чашечный метод Коха)

Высевы на плотную среду проводят, как правило, из трех последних разведений, причем из каждых делают 3-4 параллельных высева. Посевы можно де-