Основы иммунологии

Прямая и непрямая антииммуноглобулиновая реакция Кумбса

Эти реакции используются для выявления "неполных" (неагглютинирующих) антител, которые образуются при различных заболеваниях: резус-конфликте, аутоиммунных заболеваниях, некоторых инфекциях. Для постановки этих реакций необходима антиглобулиновая сыворотка, которую получают путем иммунизации кролика иммуноглобулинами человека. Такая сыворотка содержит полные (бивалентные) антитела-антииммуноглобулины (рис 5.3.)

	АНТИГЕНЫ	НЕПОЛНЫЕ РЕАКЦИЯ НЕ ВИДНА
		АНТИТЕЛА

АНТИГЛОБУЛИНОВАЯ	МАКРОАГРЕГАТ
СЫВОРОТКА (ПОЛНЫЕ	(РЕАКЦИЯ
АНТИТЕЛА)	ВИДНА)

Рис. 5.3. Реакция Кумбса

Прямая реакция позволяет уже адсорбированные на клетках неполные АТ. Для этого к отмытым эритроцитам из крови больного добавляют антииммуноглобулиновую сыворотку. Если на эритроцитах есть неполные антитела (иммуноглобулины), что наблюдается при гемолитической анемии, резус-конфликте (эритроциты пуповинной крови новорожденного), то они агглютинируются.

Непрямая реакция выявляет свободные антиэритроцитарные антитела в сыворотке крови больного. К этой сыворотке добавляют отмытые эритроциты донора 0(I) группы крови. Смесь инкубируют при 370С в течение 30 минут и отмывают эритроциты. Затем к ним

131

добавляют антииммуноглобулиновую сыворотку. Если в сыворотке больного были неполные антиэритроцитарные антитела, то наступит агглютинация.

Реакции преципитации

Воснове реакций преципитации лежит образование и выпадение

восадок комплексов антиген-антитело. В реакции участвуют

растворимые антигены – преципитиногены (продукты микроорганизмов, тканей, химические вещества и лекарства). Антитела (преципитины), соединяясь с растворимыми антигенами, вызывают их агрегацию, что проявляется в помутнении прозрачных жидкостей или выпадении осадка (преципитата). Диагностические преципитирующие сыворотки выпускают с высоким титром антител. Их получают путем иммунизации лабораторных животных соответствующим антигеном. Титром преципитирующей сыворотки является минимальное количество антигена, которое данная сыворотка может преципитировать.

Иммунодиффузия в геле лежит в основе реакции преципитации по Манчини, которая используется для определения классов иммуноглобулинов в сыворотке крови (см. гл. «Оценка иммунного статуса, характеристика В-лимфоцитов»).

Реакции преципитации используются для: определения антигенов бактерий, тканей человека и животных; диагностики некоторых инфекционных заболеваний; определения видовой принадлежности белка в судебной медицине; выявления примесей в мясных, рыбных, мучных изделиях в санитарной практике.

Реакцию преципитации можно проводить в жидкой и плотной среде – (в агаре или геле).

Реакция преципитации в жидкой среде (кольцепреципитация).

Реакцию ставят в узких пробирках, куда вносят преципитирующую антисыворотку, а сверху осторожно наслаивают прозрачный раствор антигена. При положительной реакции через несколько минут на границе соприкосновения двух жидкостей появится кольцо преципитации. При малых количествах реагентов реакцию можно проводить в капиллярах (микропреципитация).

132

Реакция преципитации в агаре.

Сущность реакции в том, что антигены и антитела, помещенные в разные лунки в агаре, диффундируют навстречу друг другу и при взаимодействии образуют комплекс, который осаждается в виде линии преципитации.

Метод определения токсигенности микробов в реакции преципитации.

Принцип иммунодиффузии в геле положен в основу метода, который применяется для изучения токсигенности (способности вырабатывать токсин) бактерий. Например, для обнаружения дифтерийного токсина на чашку Петри с агаром посередине накладывают полоску фильтровальной бумаги, пропитанную антитоксической сывороткой. Рядом засевают исследуемые культуры бактерий. Если они выделяют токсин, то при взаимодействии с антитоксинами между колониями и полоской бумаги образуются линии преципитации.

Реакции лизиса

Сущность этих реакций состоит в том, что при взаимодействии специфических антител с антигенами клеток (эритроцитов, бактерий, лейкоцитов), на их поверхности образуется комплекс, который активирует добавленный комплемент по классическому пути, вследствие чего наступает лизис этих клеток. Многие бактерии устойчивы к литическому действию комплемента или их лизис происходит медленно. Отсюда реакция иммунного лизиса бактерий (реакция бактериолиза) в настоящее время применяется редко.

Реакция лизиса используется для типирования (выявления) антигенов системы HLA на лимфоцитах. К типируемым лимфоцитам добавляют антисыворотки против различных HLAантигенов, затем их отмывают и добавляют комплемент. Если соответствующий антиген есть, то наступает лизис лимфоцитов. Нежизнеспособные клетки в отличие от живых окрашиваются трипановым синим.

133

Реакция связывания комплемента (РСК).

Еще одной разновидностью реакций лизиса является реакция связывания комплемента (РСК).

В РСК помимо антигена и антител принимает участие комплемент, который способен связываться с комплексом антигенантитело. РСК позволяет выявлять антигены при использовании известных антисывороток или антитела с помощью антигеновдиагностикумов.

Образование комплексов антиген-антитело и фиксация комплемента не сопровождаются видимыми изменениями. Для обнаружения связывания комплемента используют дополнительную

индикаторную гемолитическую систему (рис. 5.4.)

АГ Э

								отрицательная РСК
		+						(гемолиз)
					ГС
АТ
				Гемсистема

АГ		Э

положительная РСК (гемолиза нет)

		ГС
АТ

АГ – антиген; АТ – антитела; С – комплемент; Э – эритроциты барана; ГА – гемолитическая сыворотка. Объяснения в тексте.

Рис. 5.4. Схема реакции связывания комплемента

134

Гемолитическая система состоит из эритроцитов барана, обработанных гемолитической сывороткой против эритроцитов барана. Эту антисыворотку предварительно прогревают при 56 С 30 мин для разрушения ее комплемента. В присутствии комплемента (сыворотки морской свинки) происходит лизис этих эритроцитов.

Принцип метода состоит в том, что если в опытной системе образовался комплекс антиген-антитело, который связал добавленный комплемент, то не будет лизиса эритроцитов в индикаторной гемолитической системе (РСК положительная, выявлен антиген или антитело). Если в опытной системе комплекс антиген-антитело не формируется, комплемент остается свободным, взаимодействует с гемолитической системой и вызывает лизис эритроцитов (РСК отрицательная, есть гемолиз, см.)

РСК лежит в основе реакции Вассермана, которая применяется для диагностики сифилиса. Также она используется для иммунодиагностики эпидемического сыпного тифа.

Реакции нейтрализации экзотоксинов и вирусов

Реакция нейтрализации экзотоксина происходит при его взаимодействии с антитоксической сывороткой (антителаантитоксины). В результате образования комплекса антиген-антитело токсин теряет свои ядовитые свойства.

Реакцию нейтрализации проводят с целью обнаружения и титрования токсинов, анатоксинов или антитоксинов.

Токсины получают путем фильтрования жидкой питательной среды или исследуемого материала, где размножались токсигенные бактерии. При обработке формалином в течение 30-45 дней при температуре 370С токсин превращается в анатоксин, который используют для иммунизации животных с целью получения антитоксической сыворотки.

Разработано несколько вариантов реакции нейтрализации токсинов.

Реакция флоккуляции основана на способности токсина или анатоксина при смешивании в эквивалентных соотношениях с антитоксической сывороткой образовывать помутнение в пробирке. Механизм флоккуляции аналогичен механизму реакции

135

преципитации. Используют для количественного определения токсинов или антитоксинов.

Реакция нейтрализации токсинов in vivo.

Для определения типа токсина его смешивают с диагностической антитоксической сывороткой и эту смесь вводят белым мышам. При нейтрализации токсина антитоксической сывороткой мыши не погибают, что указывает на вид токсина.

Реакция нейтрализации вирусов.

Данная реакция используется для идентификации вирусов. Для этого к исследуемому материалу, содержащему неизвестный вирус, добавляют специфическую противовирусную сыворотку. После инкубации эту смесь вводят либо в куриный эмбрион, либо лабораторному животному, либо в культуру клеток. Наиболее распространена реакция нейтрализации вирусов в культуре клеток. Здесь в культуральную среду добавляется индикатор. Если антитела соответствуют вирусу (нейтрализуют его), то клеточная культура развивается нормально. При этом происходит выделение кислых продуктов клеточного метаболизма, рН среды снижается, и индикатор изменяет свой цвет. В контроле вирус быстро разрушает клеточную культуру, рН не меняется, и цвет среды остается прежним.

На этом же принципе основана реакция ингибиции метаболизма для идентификации микоплазм.

Методы, основанные на связывании меченых антигенов и антител

Эти методы высокочувствительны. В качестве метки антигенов или антител применяют флюоресцентные красители, радиоактивные изотопы, ферменты и др.

Иммунофлюоресцентные методы

Прямой метод иммунофлюоресценции (по Кунсу) основан на взаимодействии антител, меченых флюорохромом, с антигеном, который находится на клетке, в клетке или в тканях. В качестве флюорохрома используют флюоресцеинизотиоционат (ФИТЦ). Он

136

дает зеленое свечение в ультрафиолетовых лучах, а тетраметилродаминизотиоцианат – оранжево-красное свечение. Прямой метод одноэтапный: на фиксированный мазок клеток с антигеном наносят диагностическую сыворотку с антителами, мечеными ФИТЦ, инкубируют, отмывают и, при положительном результате, учитывают свечение в люминесцентном микроскопе

(рис. 5.4).

исследуемый материал					антитела	антитела, меченые			меченый
						флюоресцеином			флюоресцеином
									антииммуноглобулин
ПРЯМОЙ ТЕСТ							НЕПРЯМОЙ ТЕСТ

Рис. 5.4. Метод иммунной флюоресценции

Непрямой метод иммунофлюоресценции заключается в том, что первоначально антиген обрабатывают обычной диагностической сывороткой, которую получают путем иммунизации кроликов соответствующим антигеном. Для обнаружения образовавшегося комплекса антиген-антитело используют меченую флюорохромом антисыворотку против иммуноглобулинов кролика. Такую сыворотку получают путем иммунизации барана иммуноглобулинами кролика. Непрямой метод дает возможность обнаруживать различные

137

комплексы антиген-антитело с помощью одной меченой антиглобулиновой сыворотки.

Метод иммунной флюоресценции применяют для идентификации бактерий, риккетсий, вирусов, а также для определения рецепторов и антигенов клеток человека и животных.

Иммуноферментный анализ.

В методах иммуноферментного анализа (ИФА) используют иммунореагенты, меченные ферментами (рис. 5.5). Наиболее широко применяется твердофазный ИФА. В качестве твердой фазы чаще всего используют полистироловые или поливиниловые планшеты или шарики, на которых адсорбированы антигены или антитела.

Антиген сорбирован на планшете

Отмывка

Добавление сыворотки, содержащей антитела

Отмывка

АТ-Ф

Добавление антииммуноглобулиновых антител, меченых ферментом, отмывка

АТ-Ф

Добавление субстрата фермента (изменение цвета)

Оценка реакции

Рис. 5.5. Принцип выявления антител в твердофазном ИФА

138

Для выявления антител известный антиген адсорбируют в лунках полистироловой пластины. Затем вносят исследуемую сыворотку, в которой хотят обнаружить антитела к данному антигену. После инкубации лунки промывают для удаления несвязавшихся белков и вносят в них антииммуноглобулиновые антитела, меченные ферментом (обычно пероксидазой). После инкубации и отмывания в лунки добавляют специфичный для фермента субстрат (перекись водорода) и хромоген (орто-фенилендиамин) для регистрации конечных продуктов расщепления субстрата. О наличии и количестве антител судят по изменению цвета и интенсивности окраски раствора. Для регистрация окраски используют специальные спектрофотометры с вертикальным ходом луча (ридерымультисканы).

Методы ИФА обладают высокой чувствительностью и специфичностью и получили широкое распространение в различных областях биологии и медицины.

Иммуноблотинг (вестерн-блотинг).

Часто бывает, что АГ представляет собой сложную смесь разнородных молекул. С другой стороны, к такому комплексному АГ вырабатывается набор различных АТ. Для одновременного обнаружения различных фракций АГ либо АТ в исследуемом материале применяют метод вестерн-блотинга. В частности, он используется при диагностике ВИЧ-инфекции для обнаружения АТ к различным вирусным АГ. Для этого известный набор вирусных белковых АГ подвергают электрофорезу в полиакриламидном геле. АГ мигрируют в геле в зависимости от их молекулярной массы и заряда. После окончания электрофореза на пластину с гелем накладывают лист нитроцеллюлозной мембраны (НЦМ) и проводят повторный электрофорез в поперечном направлении. АГ выходят из геля и прикрепляются к листу нитроцеллюлозной мембраны.

Далее лист НЦМ с отпечатками АГ (блот – отпечаток) обрабатывают сывороткой больного, содержащей АТ. Если АТ есть, то они связываются с НЦМ по месту локализации различных фракций АГ.

Далее метод не отличается от гетерогенного иммуноферментного анализа: НЦМ промывают для удаления несвязавшихся белков и вносят в них антииммуноглобулиновые антитела, меченные ферментом (пероксидазой). После инкубации и отмывания НЦМ

139

помещают в раствор субстрата (перекись водорода) и хромогена (диаминобензидин и др.) О количестве фракций антител к различным АГ фрагментам судят по появлению нескольких окрашенных пятен на НЦМ.

Радиоиммунологический анализ.

Принцип радиоиммунологического анализа (РИА) основан на выявлении комплекса АГ-АТ, в котором один из иммунореагентов был мечен радиоактивным изотопом. Обычно используют изотопы йода (125I или 131I). Учет реакции проводят по убыванию или по возрастанию радиоактивности (в зависимости от методики РИА) с помощью специальных счетчиков - или -излучения. Метод высокочувствителен, но постепенно вытесняется иммуноферментным анализом, учитывая небезопасность работы с радиоактивными изотопами и необходимость в сложном регистрирующем оборудовании.

Однако там, где в качестве АГ выступает низкомолекулярный гаптен (например, лекарственные препараты, стероидные и пептидные гормоны и др.) РИА используется весьма широко. Существуют его гетерогенные варианты, аналогичные ИФА, а также конкурентные варианты.

В последнем случае на твердую фазу (например, полистироловые шарики) сорбируют известные АТ в комплексе с радиоактивно меченым АГ (например, лекарственным препаратом) в известной концентрации. К этому комплексу добавляют исследуемый материал, содержащий неизвестную концентрацию изучаемого лекарственного препарата-АГ. Он вытесняет из комплекса меченый АГ пропорционально своей концентрации. Радиоактивность вытесненного АГ измеряют с помощью счетчика и определяют концентрацию неизвестного АГ.

Клеточные методы оценки иммунитета

Реакция бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ).

Переход малых лимфоцитов в бластные формы, способные к пролиферации и дальнейшей дифференцировке называется бласттрансформацией и сопровождается морфологическими изменениями лимфоцитов. Бласты – крупные, округлой формы

140