Sivolob - Molekulyarna_biologiya_Pidruchnik

Розділ 3. ДНК

торні групи азотистих основ (рис. 3.7): у великому жолобку міститься по два акцептори (O, N) та одному донору (NH2) водневого зв'язку кожної пари; у маленькому – два акцептори пари А-Т, два акцептори й один донор пари G-C.

A

G

T

C

Рис. 3.6. Два варіанти представлення подвійної спіралі ДНК (кристалічна структура додекамеру, 355D)

Таким чином, цілком подібно до білків (розділ 2), гідрофобні взаємодії (розділ 1) між площинами пар азотистих основ зумовлюють формування подвійної спіралі. При цьому реалізується щільна упаковка – утворюються вандерваальсові контакти між сусідніми парами. Велика кількість таких контактів уздовж осі спіралі робить їх суттєвим фактором стабілізації дуплекса. Вандерваальсові взаємодії між парами основ є за своїм характером орієнтаційними та, унаслідок нерівномірності розподілу електронної щільності по кільцях основ, дипольдипольними (див. розділ 1). Такі взаємодії складного характеру (гідрофобний ефект + вандерваальсові взаємодії) у складі стопки мають спе-

ціальну назву – стекінг-взаємодії.

Отже, стекінг-взаємодії – головний фактор стабілізації подвійної спіралі. Точніше, це практично єдиний фактор стабілізації. Роль комплементарних водневих зв'язків між основами, які самі по собі енергетично не дуже важливі (водневі зв'язки основ із водою при розхо-

71

Сиволоб А.В. Молекулярна біологія

дженні ланцюгів майже такі самі), полягає в тому, що вони є необхідною передумовою утворення стабільної стопки. Це знову цілком аналогічно ролі водневих зв'язків між пептидними групами вторинної структури білків у стабілізації глобули (розділ 2). Донорні й акцепторні групи азотистих основ прагнуть утворити водневі зв'язки (енергія водневого зв'язку є надто високою, щоб його втрачати). Опиняючись усередині неполярної стопки, вони стають недоступним для води і єдиний шанс зберегти водневі зв'язки – утворити їх із відповідними групами іншої основи. А це можливо лише за умови комплементарності. Відповідно, за відсутності комплементарності водневі зв'язки з водою зберігаються, що робить подвійну спіраль нестабільною.

Великий жолобок

A T

Маленький жолобок		C1'	C	N O H
Великий жолобок

G C

Маленький жолобок

Рис. 3.7. Комплементарні пари основ у складі ДНК

з водневими зв'язками між основами. Праворуч: атоми тих самих пар зображені відповідно до їхніх вандерваальсових радіусів

Ефективність стекінг-взаємодій залежить від типу контактуючих пар основ, а також їхньої взаємної орієнтації та порядку розташування в ланцюгах дуплекса – типу динуклеотидного контакту вздовж осі по-

72

Розділ 3. ДНК

двійної спіралі. Замість 16 типів динуклеотидних контактів у одноланцюговій нуклеїновій кислоті, у подвійній спіралі залишається 10 – унаслідок комплементарності ланцюгів певні контакти є еквівалентними. Наприклад, контакт AG в одному ланцюзі автоматично означає, що в комплементарному ланцюзі реалізується контакт CT. Слід пам'ятати, що ланцюги є антипаралельними, і що послідовність нуклеотидів читається в напрямку 5' → 3' (усі динуклеотидні контакти подвійної спіралі наведено в табл. 3.2). Для певних контактів (наприклад, пурин-піримідинових порівняно з піримідин-пуриновими) стекінг-взаємодії є більш ефективними. Відповідно, стабільність подвійної спіралі залежить від послідовності пар основ.

Утворення подвійної спіралі працює проти конформаційної ентропії: розходження двох ланцюгів супроводжується значним зростанням їхньої конформаційної свободи (невпорядкованості). Відповідно,

стабільність подвійної спіралі залежить від температури: при зрос-

танні температури ентропійна компонента вільної енергії збільшується (рівняння (1.2)), і відбувається розходження ланцюгів – плавлення подвійної спіралі. Зрозуміло, що температура плавлення – температура за якої 50 % пар основ є розплавленими – є мірою стабільності й залежить від послідовності пар основ.

Суттєвий дестабілізуючий внесок у вільну енергію подвійної спіралі дають також електростатичні взаємодії. Оскільки кожен фосфатний залишок несе на собі негативний заряд (рис. 3.4), молекула ДНК є гігантським поліаніоном із високою поверхневою щільністю зарядів. У розчині ці заряди суттєво нейтралізовані протиіонами – неорганічними катіонами: навколо ДНК утворюється “іонна атмосфера” з досить високою локальною щільністю катіонів, тобто в системі виникає нерівномірний розподіл катіонів – зростає відповідна ентропійна компонента вільної енергії. Цей невигідний ефект буде тим меншим, чим вищою є концентрація солі в розчині, тобто різниця між концентрацією катіонів поблизу від ДНК і на віддаленні від неї. Відповідно, стабі-

льність подвійної спіралі (і температура плавлення) залежить від іонної сили розчину – зростає при підвищенні концентрації солі.

За фізіологічних умов подвійна спіраль є досить стабільною структурою, і саме в цій формі ДНК (і значна частина комплементарних ділянок РНК) існує в живих системах. Розходження ланцюгів, яке має тимчасово відбуватися при різноманітних функціональних процесах, потребує виконання роботи молекулярними машинами з використанням енергії гідролізу АТР.

73

Сиволоб А.В. Молекулярна біологія

Конформаційні параметри подвійної спіралі

Як для будь-якого іншого полімеру, конформаційна рухливість нуклеїнових кислот реалізується завдяки зміни кутів обертання навкруг ковалентних зв'язків. У складі подвійної спіралі ці обертальні рухи обмежені міцними стекінг-взаємодіями та комплементарними водневими зв'язками. Дозволені обертання навкруг різних зв'язків призводять врешті-решт до зміни взаємної орієнтацій основ і пар основ. Саме набором параметрів, що описують такі відносні орієнтації, прийнято характеризувати конформації подвійних спіралей.

В основі номенклатури конформаційних параметрів подвійних спіралей нуклеїнових кислот, прийнятої спеціальною нарадою EMBO (European Molecular Biology Organization), лежить стандартна лока-

льна декартова система координат, що ставиться у відповідність до кожної пари основ (рис. 3.8): початок координат знаходиться в геометричному центрі пари; площина X–Y збігається з площиною пари, вісь Y є паралельною щодо лінії, яка з'єднує С1'-атоми, і спрямована на ланцюг, який береться за перший; вісь Z спрямована на площину наступної (у напрямку 5'-3' по першому ланцюгу) пари основ; напрямок осі X обирається за правилами утворення правої декартової системи координат – жолобок, на який вона спрямована, позначається як “великий”. Насправді, терміни “великий / маленький жолобок” не обов'язково мають буквальне значення (див. нижче).

	Z			Ланцюг ІІ
Ланцюг І	X			5'
3' і + 1
	Y
і
5'				3'
Маленький жолобок

Рис. 3.8. Дві пари основ у молекулі ДНК і локальна декартова система координат, пов'язана з однією з них.

74

Розділ 3. ДНК

Для опису відносного положення двох сусідніх пар достатньо шість параметрів: три зсуви наступної пари відносно попередньої по трьох осях (будь-який зсув можна розкласти на три компоненти) і три кути обертання другої пари відносно першої навколо трьох осей (рис. 3.9):

•Шифт (shift) характеризує зсув у напрямку одного із жолобків.

•Слайд (slide) – зсув у напрямку цукрофосфатного остова.

•Райз (rise) – відстань між парами основ уздовж осі Z.

•кут рола (roll) характеризує локальний вигин подвійної спіралі в напрямку одного із жолобків.

•Кут тилта (tilt) – вигин у напрямку цукрофосфатного остова.

•Твіст (twist) є кутом обертання навкруг осі Z, який характеризує ступінь спірального закручення (для правої спіралі прийнято використовувати позитивні значення твіста).

	Шифт (shift)			Слайд (slide)			Райз (rise)
	Z			Z			Z
Y		X	Y		X	Y		X

	Ролл (roll)		Тилт (tilt)			Твіст (twist)
		Z	Z			Z
Y		X	Y		X	Y

Рис. 3.9. Шість параметрів, які описують конформацію двох сусідніх пар основ

Аналогічно, шість параметрів характеризують відносне положення основ, що належать до однієї пари: зсув уздовж осі X і обертання навколо неї (shear і buckle), зсув і обертання відносно осі Y (stretch і propeller) та відносно осі Z (stagger і opening). Яким чином відбуваються відповідні рухи однієї основи відносно іншої легко зрозуміти з рис. 3.9.

75

Сиволоб А.В. Молекулярна біологія

Структурні форми ДНК

ДНК із майже будь-якою послідовністю пар основ може існувати у двох структурних формах, що позначаються як А і В. Деякі усереднені параметри двох форм у фібрилах ДНК наведено в табл. 3.1, структури показано на рис. 3.10.

В-форма А-форма

Рис. 3.10. В- (структура з рис. 3.6)

та А- (декамер, 401D) форми ДНК у двох проекціях

Обидві спіралі є правими. Основні відмінності між двома формами ДНК зумовлені різною конформацією цукру – С2'- та С3'-ендо. Саме внаслідок цього в А-формі порівняно з В-формою:

•Скорочується відстань між фосфатними залишками.

•Зменшується ступінь правої спіральної закрутки.

•Кожна пара основ суттєво нахиляється до осі спіралі (у В-формі пари майже перпендикулярні до осі).

•Унаслідок нахилу в А-формі скорочується відстань між сусідніми парами основ уздовж осі спіралі (проекція райза на вісь спіралі).

76

Розділ 3. ДНК

•Кожна пара суттєво зсунута до периферії спіралі в А-формі, вісь спіралі проходить майже через центр пари в В-формі.

•“Великий” і “маленький” жолобки є справді великим і маленьким для В-форми, в А-формі їхні відносні розміри міняються місцями.

Таблиця 3.1. Порівняння між А- і В-формами

подвійних спіралей ДНК

		А-форма	В-форма
	Твіст Ω (°)	+32,7	+36,0
	Кількість пар основ на	11	10
	виток спіралі (360°/Ω)
	Слайд (Å)	–1,5	0
	Ролл (°)	11,4	–0,2
	Райз (Å)	3,3	3,3
	Відстань між парами	2,6	3,4
	вздовж осі спіралі (Å)
	Конформація дезокси-	С3'-ендо	С2'-ендо
	рибози
	Відстань між сусідні-	5,9	7,0
	ми фосфатами по ла-
	нцюгу (Å)
	Великий жолобок: гли-
	бина (Å),	13,5	8,5
	ширина (Å)	2,7	11,7
	Маленький жолобок:
	глибина (Å),	2,8	7,5
	ширина (Å)	11,0	5,7

Крім того, є різниця і в конформаційній рухливості: А-форма однорідніша за своєю структурою, В-форма допускає ширші варіації параметрів залежно від послідовності. Узагалі, частіше кажуть не про форми ДНК, а про А- і В-родини структурних форм.

За фізіологічних умов у розчині ДНК існує тільки у В-формі, пе-

рехід в А-форму здійснюється за досить екстремальних умов in vitro – за певних концентрацій солі та спиртів у розчині, при зниженні вологості у фібрилах. Але це не означає, що А-форма не є фізіологічною. По-перше, через те, що рибоза не може набувати С2'-ендо конформації,

77

Сиволоб А.В. Молекулярна біологія

усі подвійні спіралі РНК існують в А-формі за фізіологічних умов.

З тієї ж причини набувають А-форми гібридні подвійні спіралі РНКДНК, які виникають тимчасово, наприклад, під час транскрипції. Крім того, ДНК може переходити в А-форму або наближену до неї в комплексах із білками.

Ще одна регулярна форма подвійної спіралі реалізується тільки для альтернуючих послідовностей poly(GC) (коли G і C чергуються по ланцюгу). Це так звана Z-форма (рис. 3.11). Її назва пов'язана з тим, що лінія, яка з'єднує фосфатні залишки у складі Z-форми нагадує зиґзаґ. Найбільш вражаюча особливість цієї форми ДНК полягає в тому, що це – ліва спіраль із приблизно 12 парами основ на виток. Альтернуючі послідовності G та C є в природних ДНК, але перехід у Z-форму відбувається in vitro за умов, які є дуже далекими від фізіологічних – при концентрації NaCl 2,5 моль/л. Біологічне значення Z-форми залишається не зовсім зрозумілим, хоча знайдені білки, які мають високу спорідненість саме до неї, тобто можуть індукувати В→Z перехід in vivo.

В-форма Z-форма

Рис. 3.11. В- (гексамерний фрагмент структури з рис. 3.6) і Z- (гексамер CGCGCG, 1DCG) форми ДНК.

Чорним кольором на структурі праворуч позначені атоми фосфору

Конформація В-ДНК

Структура В-форми ДНК не є абсолютно регулярною. Конформаційні особливості та особливості стекінгу в різних контактах між парами основ призводять до суттєвої залежності локальної конформації подвійної спіралі від послідовності – можна сказати, що послідовність несе інформацію про структурні особливості ДНК (подібно до того, як амінокислотна послідовність зумовлює просторову структуру білка).

78

Розділ 3. ДНК

Щоб проілюструвати залежність конформації ДНК від послідовності, у табл. 3.2 наведені значення кута твіста (див. рис. 3.9) для 10 типів контактів між парами основ у кристалах вільної ДНК і білко- во-нуклеїнових комплексів.

Таблиця 3.2.Твіст ДНК для 10 типів контактів

між парами основ (за даними Олсон та ін.)

	Середній кут твіста ± стандартне
Тип	відхилення (°)
контакту	Кристали ві-	Білково-
		нуклеїнові ком-
	льної ДНК
		плекси
AA/TT	35,5 ± 3,6	35,1 ± 3,9
AG/CT	30,6 ± 4,7	31,9 ± 4,5
GA/TC	39,6 ± 3,0	36,3 ± 4,4
GG/CC	35,3 ± 4,9	32,9 ± 5,2
AC/GT	33,1 ± 4,6	31,5 ± 4,2
AT	31,6 ± 3,4	29,3 ± 4,5
GC	38,4 ± 3,0	33,6 ± 4,7
CA/TG	37,7 ± 9,3	37,3 ± 6,5
CG	31,3 ± 4,7	36,1 ± 5,5
TA	43,2 ± 5,5	37,8 ± 5,5
Середнє	35,6	34,2
по всіх
контактах

79

Сиволоб А.В. Молекулярна біологія

Твіст у комплексах є дуже близьким до значення твіста вільної ДНК у розчині за фізіологічних умов – середнє значення для всіх контактів відповідає 10,1 парам основ на виток спіралі у кристалах і 10,5 парам основ у комплексах з білком. Як видно з таблиці, твіст варіює в досить широких межах – ступінь локальної спіральної закрутки ДНК суттєво змінюється залежно від послідовності пар основ. Крім того, варіюють також і стандартні відхилення від середнього значення твіста. Останній параметр показує, наскільки легко значення твіста може відхилятися від переважного середнього значення, тобто характеризує конформаційну рухливість контакту даного типу.

Інші конформаційні параметри подвійної спіралі (як середні значення, так і ширина розподілу) також залежать від послідовності пар основ. Для прикладу на рис. 3.12 показано співвідношення між роллом і слайдом (доступний сегмент конформаційного простору) для 10 контактів. Загалом конформаційна рухливість негативно корелює з ефективністю стекінгу: вона є вищою для піримідин-пуринових і АТ-збагачених контактів. При цьому 6 конформаційних параметрів, наведених на рис. 3.9, не є незалежними один від одного – їхні зміни є заємно пов'язаними.

ролл (°)
20				CA	GG
		CG
10	AC
	AT	AG	TA
					GA

0

AA

GC

–10

–20

–2	0	2	–2	0	2
			слайд (Å)

Рис. 3.12. Усередині зафарбованих зон – доступні для кожного з 10 контактів значення двох конформаційних параметрів для кристалів ДНК (за даними Олсон та ін.)

Характер залежності конформації ДНК від послідовності є насправді ще складнішим: конформаційні особливості визначаються не тільки найближчими сусідами – типом контакту між парами основ, але й контекстом послідовності, де даний контакт знаходиться.

80