Иммуноферментный анализ (ИФА) в клинической лабораторной диагностике. Общие принципы Учебно-методическое пособие

руемый образец и меченый реагент вводятся в систему на разных стадиях, что устраняет влияние различных эффекторов, содержащихся в образце, на каталитические свойства ферментной метки. Однако такая схема анализа усложняет его проведение из-за введения дополнительных стадий. Данный метод применяется для качественного и количественного выявления, например, опиатов (морфин, героин), каннабиноидов (марихуана, гашиш), амфетаминов и метамфетаминов, барбитуратов (рис. 6).

Рис. 6. Схема непрямого конкурентного ИФА

Основные типы тест-систем в зависимости от используемых антигенов

В зависимости от того, какие антигены используются, иммуноферментные тест-системы подразделяют на:

Лизатные — в которых используется смесь нативных антигенов (лизированный или обработанный ультразвуком возбудитель инфекции, полученный в культуре);

Рекомбинантные — в которых используются полученные генноинженерным способом белки-аналоги определённых белковых антигенов возбудителя;

Пептидные — использующие химически синтезированные фрагменты белков.

Общее направление развития ИФА-диагностикумов — это направление от лизатных тест-систем, которые принято называть тест-системами первого поколения, к рекомбинантным и пептидным.

Технология получения рекомбинантных белков позволяет получить в достаточно чистом виде аналог практически любого отдельного антигена. Для создания высококачественной рекомбинантной тест-системы необходимо из всего антигенного многообразия возбудителя выбрать антигены, которые были бы иммуногенными (то есть, в организме инфицированного человека должны вырабатываться антитела к этим антигенам) и высоко специфичными (то есть, характерными лишь для данного возбудителя и, по возможности, не дающими перекрёстных реакций с антителами к другим антигенам). Кроме того, большое значение имеет качество очистки рекомбинантных белков. В идеальном случае

10

возможно получение рекомбинантной тест-системы практически со 100% специфичностью при высокой чувствительности.

Ферментные метки в ИФА

К выбору ферментных меток в ИФА предъявляется ряд общих требований. Основными являются следующие:

высокая специфичность и удельная каталитическая активность, позволяющая обнаружить метку в низких концентрациях;

доступность фермента, возможность получения достаточно чистых ферментных препаратов, сохраняющих высокую активность после химической модификации при получении конъюгата с антигенами или антителами;

стабильность в оптимальных условиях взаимодействия антигена с антите-

лом;

простота и чувствительность метода определения концентрации фермента. Возможность применения ферментов в качестве меток в ИФА обусловлена

высокой чувствительностью регистрации ферментов в растворе.

Если обычными спектрофотометрическими или флуориметрическими методами можно зарегистрировать образование продукта в концентрации 10−7 моль/л, то концентрация фермента составит при этом 10−13 моль/л. Причём возможно значительное уменьшение пределов обнаружения ферментов как за счёт увеличения времени ферментативной реакции, так и увеличения чувствительности регистрации образовавшегося продукта.

Наибольшее распространение в гетерогенном ИФА (где используются реагенты, иммобилизированные на поверхности твёрдых носителей) получили

пероксидаза хрена,

щелочная фосфатаза

β-D-галактозидаза.

Все три фермента определяются на уровне пикомолярных концентраций. Наиболее доступной является пероксидаза хрена. Она содержит легко окисляемые перйодатом углеводные остатки, через которые может осуществляться связывание фермента с антителами или антигенами. В состав субстратной системы для измерения активности пероксидазы фотометрическим способом входят хромогены, дающие при окислении перекисью окрашенные соединения.

Каталитическую активность глюкозооксидазы регистрируют с теми же хромогенами, что и активность пероксидазы, однако чувствительность её определения по сравнению с пероксидазой несколько ниже. Основным достоинством фермента служит полное отсутствие его в плазме крови, что даёт возможность использования этого фермента в гомогенных методах ИФА (реагенты для всех стадий ИФА находятся в водном растворе).

Щелочная фосфатаза и её конъюгаты имеют высокую стабильность и низкий предел обнаружения, однако имеет относительно высокую стоимость. Разработаны сверхчувствительные ферментативные системы, позволяющие детектировать в растворе до нескольких тысяч молекул щелочной фосфатазы, основанные на использовании в качестве субстрата молекулы НАДФ. Образующийся в

11

результате ферментативного гидролиза продукт НАД определяется в ферментативной системе регенерации кофактора.

β-D-Галактозидаза является также широко используемым ферментом как в гомогенном, так и в гетерогенном ИФА. Она катализирует гидролиз лактозы с образованием глюкозы и галактозы. Если вместо природного субстрата взять 4- метилумбеллиферил-β -D-галактозид, при гидролизе образуются галактоза и 4- метилумбеллиферон, регистрируемый флуориметрически.

Во всех коммерческих тест-системах используется пероксидаза хрена, выбор которой определяется её высокой удельной каталитической активностью, доступностью, стабильностью, простотой детекции. В качестве субстратного реагента наиболее часто применяется орто-фенилендиамин (ОФД) или тетраметилбензидин (ТМБ) с перекисью водорода, продукт окисления которых регистрируется фотометрически. Для остановки ферментативной реакции применяют «стоп реагент», который добавляют во все исследуемые и контрольные пробы в равных количествах. Наиболее часто в качестве «стоп реагента» применяют серную кислоту. Учет результатов проводят спектрофотометрически при длине волны 450–490 нм.

Методы определения ферментативной активности в ИФА

Фотометрический метод

В ИФА наибольшее распространение получил фотометрический метод регистрации активности ферментов. В качестве субстратов ферментов при этом используют такие вещества, продукты превращения которых являются окрашенными соединениями или, наоборот, окраска самих субстратов изменяется в процессе реакции. Окрашенные соединения поглощают видимый свет, т. е. электромагнитное излучение с длинами волн 400–700 нм. Поглощение света подчиняется закону Бугера-Ламберта-Бера, в соответствии с которым оптическая плотность раствора в определённом диапазоне прямо пропорциональна концентрации вещества. Для измерения оптической плотности используется спектрофотометр.

Флуориметрический метод

В последнее время в ИФА получили распространение субстраты, которые образуют продукты, регистрируемые флуориметрическим методом. Молекула при поглощении фотона переходит из основного электронного состояния в возбуждённое. Возбуждённая молекула может вернуться в основное состояние, при этом избыток энергии перейдёт в теплоту, но может произойти обратный процесс перехода электрона на основной уровень, сопровождающийся выделением кванта света, который носит название флуоресценции. Благодаря частичной потере энергии при переходе молекулы из возбуждённого состояния в основное длина волны испускаемого света всегда больше длины волны поглощаемого света. Долю молекул, перешедших из возбуждённого состояния в основное с испусканием света, определяет квантовый выход φ. Интенсивность флуоресценции пропорциональна количеству света, адсорбированного образ-

12

цом. Таким образом, она прямо пропорциональна концентрации растворённого вещества и абсолютному значению начальной интенсивности света, в то время как в фотометрии сравниваются относительные интенсивности, адсорбированные образцом. Этот факт позволяет на 1–2 порядка повысить чувствительность определения вещества в растворе флуориметрическим методом по сравнению с фотометрическим.

Биолюминесценция и хемилюминесценция

В качестве детектирующих систем в ИФА нашли применение ферментативные реакции, энергия которых реализуется в виде светового излучения — реакции био- и хемилюминесценции. За скоростью таких реакций следят по интенсивности свечения реакционной системы, регистрируемой с помощью люминометра. Реакции биолюминесценции катализируются люциферазами светляков и бактерий, а реакция окисления циклических гидразидов перекисью водорода (реакция хемилюминесценции) катализируется пероксидазой хрена.

Электрохимический метод

Известны также электрохимические способы определения активности ферментов, используемых в качестве меток в иммуноанализе. Такие датчики позволяют определить скорость ферментативных реакций в мутных средах и удобны для создания проточных иммуноферментных ячеек.

В иммуноферментных методах анализа в качестве метки антигенов и антител могут использоваться как ферменты, так и их субстраты. Если меткой служит молекула фермента, то выбранный способ детекции должен обеспечивать регистрацию сигнала, пропорционально зависимого от концентрации фермента, а в случае применения в качестве метки субстрата — от концентрации субстрата. В первом случае фермент выполняет роль маркёра (он ковалентно связан с молекулой антигена или антитела), во втором — детектора (свободный фермент). После проведения всех иммунохимических стадий любого метода ИФА необходимо установить концентрацию меченного ферментом компонента иммунохимической реакции, т. е. определить каталитическую активность фермента в пробе. По наблюдаемой скорости реакции судят о концентрации фермента-маркёра в системе. Следует отметить, что ИФА всегда строится на сравнительном определении в идентичных условиях стандартного и измеряемого образца, в связи с чем требование пропорциональности скорости и концентрации является скорее желательным, чем обязательным. Достаточным является существование взаимно однозначного соответствия между количеством образовавшегося продукта ферментативной реакции и количеством фермента в системе. Однако выполнение условия пропорциональности в определённом диапазоне концентраций обеспечивает б ольшую точность эксперимента и позволяет построить теоретическую модель с описанием метода для его оптимизации.

13

Ошибки при постановке ИФА. Внутрилабораторный контроль качества

Требования к лабораторным помещениям изложены в ведомственных инструкциях. Во избежание ошибок ИФА должен проводится в приспособленных для этого помещениях лаборатории. Площадь рабочего стола также играет важную роль при проведении ИФА. При недостаточной площади рабочей поверхности возможность перепутать или пролить растворы возрастает. Также во многих инструкциях к тест-системам рекомендуется использование масок, респираторов и защитных очков, что при плохой вентиляции затрудняет дыхание и увеличивает риск ошибки.

Большое значение для ИФА имеет оборудование. Современные тестсистемы рассчитаны на микрообъемы растворов и использование для анализа автоматических пипеток. Погрешность пипеток не должна превышать 5%. Неправильное дозирование растворов на любой стадии анализа может привести как к росту оптической плотности, так и к снижению, при измерении результата анализа.

Наиболее часто ошибки при постановке ИФА случаются при промывке. Недостаточная промывка приводит к повышению оптической плотности результата. Источником погрешностей является также и автоматический промыватель при засорении каналов. Ручные и автоматические промыватели в конце рабочего дня нуждаются в тщательной промывке и замачивании дистиллированной водой.

ИФА – высокочувствительный метод, и методика предполагает использование одноразовой посуды для разведения растворов, планшетов для разведения сывороток и наконечников.

Современные спектрофотометры являются сложными приборами. Они нуждаются в установке и дальнейшем обслуживании специалистом. Мощная лампа, установленная в спектрофотометре, нуждается в некотором времени перед работой для прогревания лампы, также на работу лампы может влиять колебания напряжения. Обычно спектрофотометры имеют допустимую погрешность 10%.

Эти факторы могут повлиять на результат анализа. Во многих тест-системах рекомендуется вести инкубацию планшетов при комнатной температуре. Под комнатной температурой подразумевается температура 18-25°С, однако на практике температура в помещениях может варьировать от 12º до 30°С. Это может привести к ошибкам при тестировании. В некоторых случаях пытались уменьшить влияние температуры окружающего воздуха с помощью изменения времени инкубации, однако общих формул соотношения влияния температуры и времени на оптическую плотность не существует. Для корректировки влияния этого фактора рекомендуется использование термостата, настроенного на параметры комнатной температуры.

В состав тест-систем входят концентраты растворов, которые перед постановкой необходимо развести дистиллированной водой. Качество дистиллированной воды оказывает большое влияние на результат реакции. Не следует добавлять в дистиллированную воду в качестве консерванта азид натрия, так как

14

он является ингибитором пероксидазы и может повлиять на активность конъюгата при разведении. В инструкции по применению тест-систем температура воды не указывается, но подразумевается, что используемая вода комнатной температуры. Если используемая вода слишком холодная, особенно для разведения сывороток и конъюгатов, возможность получить ложный результат будет высока, несмотря на температуру, при которой проводилась реакция. Вероятность будет еще увеличиваться, если время инкубации менее 30 минут.

Относительная влажность также может влиять на результаты анализа. При низкой относительной влажности и длительной инкубации, может происходить подсыхание раствора в лунках и образование концентрированного «ободка» на боковой поверхности лунок, что может повлиять на результат анализа.

Правильная подготовка сыворотки при проведении ИФА, существенно влияет на результат анализа. Важно отстаивать кровь в течение 0,5–1 часов при 37ºС для формирования фибринового сгустка. Не превратившийся в фибрин фибриноген является источником ложноположительных реакций. Затем провести центрифугирование в течение 10 минут при 3000 об/мин или 20 минут при 1500 об/мин для формирования и удаления сгустка. При приготовлении образцов сыворотки должны быть приняты все меры для исключения возможности контаминации.

Строгое следование инструкции даже при использовании знакомой методики, залог успешной постановки реакции. Производитель часто совершенствует тест-системы и вносит изменения в методики подготовки реактивов.

Многие требования к хранению реагентов, подготовке и проведению реакции подразумеваются, но иногда не указаны в инструкции. Ниже приведены некоторые из таких требований.

1.Если в тест-системе используются компоненты, полученные из крови человека, то к таким компонентам следует относиться как к потенциально инфекционным материалам.

2.При работе с компонентами набора и исследуемыми образцами работать только в перчатках. По окончании работы обязательно тщательно вымыть руки.

3.Все исследуемые образцы следует считать потенциально инфекционно опасными.

4.При работе с таблетками ОФД следует использовать только пластиковые пинцеты или пинцеты с пластиковым покрытием, так как ОФД может реагировать с металлами, что может привести к неправильным результатам.

5.Попадание ОФД в глаза, на кожу или одежду может привести к раздражению или аллергической реакции. В случае попадания ОФД на кожу следует промыть место контакта большим количеством воды.

6.ОФД является свето- и влагочувствительным. Флакон с ОФД следует хранить плотно закрытым. Перед тем, как открыть флакон с ОФД, следует довести его до комнатной температуры во избежание конденсации влаги внутри флакона. Не следует использовать сломанные таблетки ОФД.

7.Для приготовления реагентов следует использовать дистиллированную или деионизированную воду. Эту воду следует хранить в неметаллических емкостях.

15

8.Не следует использовать реагенты из разных серий тест-системы.

9.Все реагенты и компоненты тест-системы должны быть доведены перед использованием до комнатной температуры, а после работы должны храниться при температуре от 2 до 8°С. При дробном использовании набора следует сократить до минимума нахождение растворов при комнатной температуре и особенно в открытой посуде.

10.Если производитель использует осушитель, меняющий цвет при насыщении влагой (наиболее распространена смена цвета с синего на розовый), запрещается использовать планшет в случае достижения осушителем «неправильного» цвета.

11.Не следует использовать реагенты позднее указанного срока годности.

12.Следует предпринять все меры для предотвращения возможного перепутывания или перемешивания реагентов (например, использовать только специально предназначенные и подписанные емкости для приготовления реагентов).

13.Перед использованием убедитесь, что растворы и реагенты гомогенны.

14.Планшеты (стрипы) можно использовать для постановки ИФА только один раз.

15.Перед вскрытием пакета с планшетом его следует выдержать при комнатной температуре примерно 30 минут для предотвращения конденсации влаги на планшете. Если планшет разборный, и используются не все стрипы сразу, то после вскрытия оставшиеся стрипы следует поместить в пакет, который необходимо закрыть. Распространенный способ – край пакета сворачивается вдвое и зажимается скрепками. Зарубежные фирмы вкладывают в наборы специальные зажимы для этих целей, эти зажимы можно использовать и для укупорки пакетов с планшетами отечественных производителей. Не следует удалять пакетик с влагопоглотителем.

16.При постановке реакции следует убедиться в том, что исследуемый образец или реагент внесен в лунку.

17.При использовании одноканальной пипетки для внесения испытуемых образцов необходимо использовать новый наконечник для каждого образца. При использовании многоканальной пипетки следует использовать новые наконечники для каждого используемого реагента.

18.Реакция связывания антител с антигенами начинается сразу после внесения сыворотки в лунку, поэтому желательно уменьшить период между внесением первой и последней сывороток на планшет. В случае длительного времени внесения образцов (например, постановка цельного планшета) рекомендуется перестановка сывороток, дающих оптическую плотность в ближайшем к серой зоне районе оптических плотностей.

19.Если допущена ошибка при внесении анализируемых образцов (например, 2 сыворотки внесены в одну лунку), нельзя, опорожнив эту лунку, вносить

внее новый образец. Такая лунка бракуется.

20.Не следует допускать подсыхания лунок в период между инкубациями или промывками – возможно образование плохорастворимой пленки на их поверхности.

16

21.Не следует касаться дна лунок – отпечатки пальцев или перчаток могут привести к неправильной регистрации оптической плотности.

22.При использовании стрипов следует работать с обязательной фиксацией стрипов в рамке. Следует осторожно протереть донышки лунок с помощью мягкой, не оставляющей волокон салфетки (при наличии на донышках капель влаги, пылинок и других загрязнений) до регистрации оптической плотности.

23.В случае получения оптической плотности от контрольных образцов, не попадающей в интервал, описанный в соответствующем разделе инструкции, следует считать, что имеются ошибки при подготовке или постановке реакции, либо тест-система непригодна к применению.

24.Если используется ридер без калибровочного фильтра на 620–630 нм, следует учитывать возможность того, что мутные или загрязненные области планшета могут быть зарегистрированы с завышенным значением реальной оптической плотности.

25.Необходимо сличать полученную распечатку оптической плотности лунок с визуальной оценкой. Возможны искажения реальной оптической плотности в результате попаданий соринок в лунку или загрязнений донышка лунки.

Особенности работы с конъюгатом

Необходимо выделить отдельную посуду и наконечники для работы с раствором конъюгата. Идеальный вариант – использование посуды и наконечников однократного применения. В реальной жизни часто не имеется такой возможности. Если посуда и наконечники используются многократно, то при подборе схемы мойки должно быть учтено сильное влияние даже следовых количеств таких веществ, как перекись водорода, хлорамин, азид натрия или добавки в синтетические моющие средства, на активность конъюгата.

Рабочий раствор конъюгата желательно готовить непосредственно перед применением.

Промывки

Равномерность заполнения и опорожнения всех лунок планшета контролируют, как правило, визуально в процессе промывки.

В идеале – перед промывкой содержимое лунок отсасывается пипеткой или вошером, затем при промывке лунки заполняются до самого верха. При таком способе промывки резко падает вероятность появления неправильных результатов, связанных с загрязнением боковых поверхностей лунок растворами сывороток или конъюгата.

Особенно тщательно следует промывать планшет после инкубации конъюга-

та.

Разведение сывороток

Следует учитывать, что сыворотки и типичные разводящие растворы для сывороток могут различаться по плотности и вязкости. Поэтому при приготовлении разведений их следует тщательно перемешать пипетированием.

17

Раствор ОФД

Основные требования к подготовке раствора ОФД обычно изложены в инструкциях по применению.

Для работы с раствором ОФД рекомендуется выделить отдельную посуду, которую нужно каждый раз ополаскивать 50%-ным раствором спирта и затем дистиллированной водой. Запрещается мыть посуду для ОФД растворами синтетических моющих средств.

Также желательно выделить отдельные наконечники для пипеток, которые будут применяться только для работы с раствором ОФД. Сразу после использования рекомендуется промывать такие наконечники спиртом и дистиллированной водой.

Раствор ТМБ

В основном требования к работе с ТМБ такие же, как и при работе с ОФД, в той части, которая касается светочувствительности, использования отдельной посуды и ее подготовки, использования отдельных наконечников для дозирования растворов ТМБ в цитратно-фосфатном растворе (ЦФР).

Кроме этого, следует соблюдать следующие правила:

1.Отбор концентрата ТМБ проводить только новыми наконечниками.

2.Не использовать посуду и наконечники для отбора раствора ТМБ в ЦФР, если они ранее применялись для растворов ОФД, так как даже следовые количества ОФД приводят к неправильным результатам.

3.Составы ЦФР для ТМБ и ОФД различны, поэтому нельзя использовать для разведения ТМБ ЦФР из наборов с комплектацией таблетками ОФД и наоборот.

4.В тест-системах с комплектацией ТМБ нельзя использовать комплект ЦФР-ОФД из других наборов, это может привести к неправильным результатам, поскольку все компоненты набора подобраны для системы ТМБ-ЦФР.

5.В тест-системах с ОФД и ТМБ обычно используются стоп-реагенты, отличающиеся количеством серной кислоты, поэтому нельзя использовать стопреагент из тест-системы с комплектацией ОФД для работы с тест-системой, укомплектованной ТМБ.

6.Следует учитывать, что система ТМБ-ЦФР обеспечивает примерно в 10 раз более высокую чувствительность выявления пероксидазы, чем система ОФД-ЦФР, поэтому необходима более тщательная и аккуратная работа во избежание попадания в лунки капель растворов, содержащих входящую в состав конъюгатов пероксидазу, с рабочих поверхностей оборудования, перчаток и спецодежды. Признаком такого нарушения правил работы является спорадическое появление на планшете лунок с более высокой оптической плотностью.

Учет результатов

Следует учитывать, что реакция окисления ОФД при добавлении серной кислоты до конца не останавливается. Поэтому нежелательно измерять оптическую плотность лунок позже, чем через 30 минут после добавления серной кислоты в качестве стоп-реагента.

18

Если в инструкции по применению не введено понятие «серой зоны», то желательно учитывать возможное влияние ошибок дозирования пипеткой (5%) и измерения оптической плотности спектрофотометром (10%). Таким образом, сыворотки, оптическая плотность которых после постановки ИФА отличается не более, чем на 15% от ОПкрит, следует признавать сомнительными.

На скорость ферментативной реакции оказывают влияние различные факторы, среди которых основными являются:

температура,

природа и pH буфера,

субстраты,

коферменты,

эффекторы,

количество белка в системе.

Проблемы ИФА, не связанные с техническими ошибками

Как любые иммунохимические методы анализа, ИФА может давать ложноположительные и ложноотрицательные результаты. Например, ложноположительные результаты при определении антител к различным инфекциям могут возникнут за счёт ревматоидного фактора, представляющего собой иммуноглобулин M против собственных иммуноглобулинов G человека; за счёт антител, образующихся при различных системных заболеваниях, нарушениях обмена или приёме лекарственных препаратов; у новорождённых такие ложноположительные реакции могут возникать за счёт образования в организме ребёнка M- антител к иммуноглобулину G матери. Помимо этого, причиной ложнопололожительных результатов может быть синдром поликлональной активации. При этом, особые вещества — суперантигены — неспецифически стимулируют выработку B-лимфоцитами антител к различным инфекциям. Практически это выражается в неспецифическом нарастании титра антител сразу ко многим возбудителям. Ложноотрицательные результаты при определении антител могут быть обусловлены состояниями иммунодефицита.

Перспективы развития метода

Одна из важных задач — поиск подходов, позволяющих значительно сократить время проведения анализа при сохранении высокой чувствительности. Один из таких подходов — перевод анализа в кинетический режим, что реализуется созданием автоматических устройств, основанных на проведении реакции в проточных системах.

Широкие возможности открывает использование моноклональных антител, специфичных строго к определённому антигенному участку анализируемого соединения. Путём подбора соответствующих антител можно создавать довольно сложные иммунохимические системы, позволяющие идентифицировать соединения самого разнообразного круга.

Метод ИФА находится в постоянном развитии. С одной стороны, расширяется число объектов исследования, с другой — углубляются и совершенствуются методы самого анализа. Это приводит к тому, что упрощается схема ана-

19