Основы современных методов изучения нуклеиновых кислот. (110
.pdfФ Е Д Е РАЛ Ь Н О Е АГ Е Н Т С Т В О П О О БРАЗО В АН И Ю М И Н И С Т Е РС Т В О О БРАЗО В АН И Я И Н АУ КИ РО С С И ЙС КО Й
ФЕ Д Е РАЦИ И
Воронеж скийгосударственныйуниверситет
О С Н О В Ы С О В РЕ М Е Н Н Ы Х М Е Т О Д О В И ЗУ Ч Е Н И Я Н У КЛ Е И Н О В Ы Х КИ С Л О Т
Учебное п особи е
посп ец и а льност и 020201 (011600) –Би ологи я
ина п ра влени ю 020200 (510600) – Би ологи я для ст удент ов 3,4 курсов д/о
и1 курса ма ги ст ра т уры
В О РО Н Е Ж 2006
2
У тверж дено научно-м етодическим советом б иолого-почвенного ф акультета 18 января 2006 г, протокол № 1.
У чеб ное пособ ие подготовлено на каф едре ф изиологии и б иохим ии
растений б иолого-почвенного ф акультета В оронеж ского государственного ф акультета.
Рекомендовано для студентов1 курса магистратуры б иолого-почвенного ф акультетаи3 курсадневногооб учения б иолого-почвенногоф акультета.
П о спец иальности 020201 (011600) – Биология и направлению 020200 (510600) – Биология для студентов3,4 курсовд/ои1 курсамагистратуры
3
|
О главление |
|
П о лимер аз н ая ц епн ая р еакц ия |
4 |
|
1.1 |
М еханизм полимеразной ц епнойреакц ии |
4 |
1.2 |
Д етекц ия продуктовП ЦР |
10 |
1.3 |
П одготовкапроб б иологическогоматериала |
12 |
1.4 |
О птимизац ия П ЦР-реакц ии |
14 |
1.5 |
П роб лем ы контаминац ииприиспользованииП ЦР |
16 |
1.6 |
П ЦР вреальном врем ени(Real Time PCR |
17 |
1.7 |
Ам плиф икац ия РН К |
20 |
1.8 |
П рим енениеП ЦР |
20 |
К ло н ир о ван иеД Н К |
22 |
|
2.1 |
П лазм идныевекторы |
22 |
С еквен ир о ван иеД Н К |
29 |
|
3.1 |
М етод полимеразногокопирования (м етод С энгера) |
29 |
3.2 |
Химическоесеквенирование(поМ аксам у-Г илб ерту) |
31 |
3.3 |
Автоматическоесеквенирование |
34 |
Б ло т ин г н уклеин о вы х кисло т |
36 |
|
4.1 |
В иды м олекулярнойгиб ридизац ии |
36 |
4.2 |
М етоды проведения гиб ридизац ии |
41 |
4.3 |
Зонды, используемыепригиб ридизац ии |
42 |
4
П ОЛИ М Е РАЗН АЯ ЦЕ П Н АЯ РЕ АК ЦИ Я
Поли мера зна я ц еп на я |
реа кц и |
я |
(П ЦР) |
- это м етод ам плиф икац ии |
ф рагм ентов нуклеиновых |
кислот |
in |
vitro, |
с помощ ью которого мож но |
достаточно б ыстро (втечениенескольких часов) получить миллионы копий определенных нуклеотидных последовательностей. М етод б ыл предлож ен в 1983 г. К. М ю ллисом и получил ш ирокоераспространениес1985 г., когда Р. С айки ссоавторам и б ыла опуб ликована основополагаю щ ая раб ота по теории П ЦР и ееоптимизац ии. М етод П ЦР, названный «изоб ретением века» и очень скоро, в1993 г. отмеченныйН об елевскойпрем ией.
1.1 М ехан из мпо лимер аз н о й ц епн о й р еакц ии
Копирование Д Н К при П ЦР осущ ествляется спец иальным ф ерм ентом - ДНК -п оли мера зой, каки вклетках ж ивых организмов. Д Н К-полим ераза двигаясь по одиночной ц епи Д Н К (м атриц е), синтезирует ком плементарную ей последовательность Д Н К. В аж но, что Д Н К-полимераза не мож ет начать синтез ц епи Д Н К «с нуля» , ей необ ходим а короткая затравочная ц епь РН К или Д Н Кк3'-конц укоторой она мож етначать присоединять нуклеотиды. Е е преим ущ еством является терм остаб ильность, а недостатком - отсутствие3'-5' экзонуклеазной активности, что приводит к появлению ош иб ок в синтезированнойД Н К, около0.25 % вконечном продукте.
Т ермо ст а б ильны е Д Н К п о лимера зы |
|
Т ермостаб ильные Д Н К-полим еразы |
м огут б ыть разделены на две |
группы: с3′-5′ эндонуклеазнойактивностью |
(Pfu Д Н К-полимераза), иб ез этой |
ф ункц ии (Taq Д Н К-полимераза). Э ти две группы имею т важ ные различия. Корректирую щ ие Д Н К-полимеразы б олее точны, чем полим еразы б ез 3′-5′
экзонуклеазной активности, |
которые не |
могут |
удалить неправильный |
нуклеотид в синтезируем ой |
ц епи Д Н К. |
Когда |
продукт ам плиф икац ии |
необ ходим о клонировать илииспользовать ванализем утац ий, использование Pfu Д Н К-полим еразы намного удоб нее. О днако для об ычной П ЦР, когда необ ходим о простое об наруж ение нуклеотидной последоваткльности или ее увеличение, наиб олеечастоиспользуется Taq полимераза.
Амплиф икац ия с использованием некорректирую щ их Д Н К-полимераз оканчивается дополнением отдельного нуклеотида к3′-конц уП ЦР-продукта, тогда как использование корректирую щ их полимераз окончивется тупозаконченным П ЦР-продуктам и. Е динственный дополнительный нуклеотид м ож етупростить проц ессклонирования.
В настоящ ееврем я для приведения П ЦР используется множ ествовидов полимераз.
Taq ДНК -Поли мера за
Taq Д Н К-полимераза выделена из б актерий Thermus aquaticus и катализирует удлинениенуклеотиднойц епивприсутствиипрайм еровв5′-3′-направлениив
5
присутствии Mg2+. Ф ерм ент не об ладает 3′-5′ экзонуклеазной активностью . Taq Д Н К-полимераза является подходящ им для б ольш инства П ЦР, которые
не треб ую т ф ермента высокой спец иф ичности. Н орма ош иб ки Taq |
Д Н К- |
||||||
полим еразы |
- |
приб лизительно 10-5 ош иб ок/основание. |
С пец иф ичность |
||||
повыш ается |
при низких pH, б олее низких |
конц ентрац иях |
магния |
и при |
|||
относительно низкой конц ентрац ии |
дН Т Ф . |
С корость раб оты Taq |
Д Н К- |
||||
полим еразы |
60 |
нуклеотидов/секунд |
при 70°C. Ф ермент имеет период |
||||
полуинактивац ииравный 40 м инутам при 95°C, при этом онтеряетполовину |
|||||||
своейактивности. |
|
|
|
|
|
||
Tfl ДНК -п оли мера за |
|
|
|
|
|
||
Tfl Д Н К-полимераза катализирует амплиф икац ию |
Д Н К вприсутствии |
||||||
праймерови Mg2+. В присутствии Mn2+, Tfl |
Д Н К-полимераза катализирует |
||||||
полим еризац ию |
нуклеотидоввД Н К, |
используя РКН |
какш аб лон. Tfl Д Н К |
полим ераза не 3′-5′ экзонуклеазной активностью . Э тот ф ермент об ычно используется воб ычнойП ЦР и приП ЦР вреальном времени.
Tth ДНК -п оли мера за |
|
|
Tth |
Д Н К-полим ераза катализирует полимеризац ию |
нуклеотидов в |
двойную |
Д Н К в5′-3′ направлении вприсутствии MgCl2. |
Ф ермент такж е |
способ ен катализировать полим еризац ии Д Н К, используя вкачествеш аб лона РКН . Tth Д Н К-полимераза об ладает 5′-3′ экзонуклеазной активностью . Tth Д Н К-полим ераза об ычно используется для об ычной П ЦР и П ЦР вреальном
времени. |
Д ля |
П ЦР |
в реальном времени и синтеза кД Н К, |
использую тся |
матриц а |
РКН |
со |
слож ной вторичной структурой, высокая тем пература |
|
реакц ии |
Tth |
полим еразы Д Н К является преим ущ еством |
перед об ычно |
|
используемым иоб ратным итранскриптазам и, типаAMV иМ -MLV. |
||||
Tli ДНК -п оли мера за |
|
|||
Tli Д Н К-полим ераза копируетамплиф икац ию Д Н К5′-3′ |
направлении в |
присутствииMg2+. Д анныйф ерментоб разуетб олее95 % продуктовступым и конц ам и. Tli Д Н К-полим ераза используется для об ычного П ЦР и П ЦР в реальном времени.
Pfu ДНК -п оли мера за
Pfu Д Н К-полимераза им еетоднуиз самых низких проц ентовош иб окиз
всех известных Д Н К-полимераз. |
Pfu |
Д Н К-полим ераза |
используется |
для |
|||||
получения П ЦР продуктов, |
используем ых вдальнейш ем для клонирования. |
||||||||
Pfu Д Н К-полимеразам ож етсинтезировать продукты Д Н Кдо5 КБ. |
|
|
|||||||
Klenow fragment |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Cуб ъединиц а Д Н К-полим еразы |
I, |
размером |
68 |
кД а. |
О б ладает |
||||
полим еразной |
активностью |
и |
3'-5' |
экзонуклеазной |
активностью , |
5'-3' |
|||
экзонуклеазная |
активность |
отсутствует. |
И спользуется |
для |
достройки |
выступаю щ их 5'-конц овс радиоактивно меченными или простыми дН Т Ф ;
6
секвенирования; получения одноц епочечной кД Н К; получения "тупых" 3'- конц ов.
О сновной принц ип П ЦР состоит в том , что реакц ия полимеризац ии (синтеза полим ерной ц епи Д Н Киз мономерных нуклеотидных звеньев) ини-
ц иируется спец иф ическим и |
п ра ймера ми |
в каж дом |
из множ ества |
повторяю щ ихся ц иклов. П |
раймеры - |
искусственно |
синтезированные |
олигонуклеотиды, им ею щ ие, какправило, разм ер от15 до30 п.н., идентичные соответствую щ им участкам Д Н К-м атриц ы.
С пец иф ичность П ЦР определяется способ ностью праймеров"узнавать" строго определенный участокД Н К и связываться сним согласно принц ипу м олекулярной ком плементарности. В реакц ии П ЦР используется пара прайм еров, которыеограничиваю там плиф иц ируем ый участоксдвух сторон, связываясь спротивополож ным иц епям иД Н К-м атриц ы.
П ри создании П ЦР-тест-систем ы одной из основных задач является правильныйподб ор прайм еров, которыедолж ны отвечать рядукритериев:
1.Д линапраймера долж наб ыть 15 - 30 нуклеотидов. У м еньш ениедлины
мож етпривестиксниж ению спец иф ичностисвязывания прайм ераиматриц ы. Д линные праймеры увеличиваю т спец иф ичность систем ы, но вних сильно возрастаетвероятность об разования вторичных структур.
2.П раймеры долж ны б ыть спец иф ичны. О соб ое вним ание уделяю т 3'- конц ам праймеров, т.к. им енно с них Taq-полим ераза начинает достраивать
ком плементарную ц епь Д Н К. Е сли их спец иф ичность недостаточна, то, вероятно, что впроб ирке с реакц ионной смесью б удут происходить синтез неспец иф ическойД Н К(коротких илидлинных ф рагм ентов). Э тозначительно услож няетоц енкурезультатовреакц ии, т.к. легко перепутать спец иф ический
продукт ам плиф икац ии с синтезированной |
посторонней Д Н К. Ч асть |
прайм еров и дН Т Ф расходуется на синтез |
неспец иф ической Д Н К, что |
приводиткзначительнойпотеречувствительности;
3.П райм еры не долж ны об разовывать дим еры и петли, т.е. не долж но об разовываться устойчивых двойных ц епей врезультате отж ига прайм еров сам их насеб я илидругсдругом ;
4.О б ласть отж ига праймеров долж на находиться вне зон м утац ий, делец ий или инсерц ий впределах видовой или иной, взятой вкачестве критерия при выб оре праймеров, спец иф ичности. П ри попадании на такую
зону, отж ига праймеров происходить не б удет, и как следствие - лож ноотриц ательныйрезультат.
5. С одерж анииГ Ц-пар впраймередолж ноб ыть около50 %. Ч ем ниж есодерж аниеГ Ц-пар впрайм ере, тем длиннееондолж енб ыть.
Эт а п ы П Ц Р
Д ля многократного увеличения количества копий исходной Д Н К нуж на ц икличность реакц ии. Как правило, каж дый из последовательно повторяю щ ихся ц икловП ЦР состоитиз трех этапов:
7
1)дена т ура ц и и , или"плавления" Д Н К, когда двух ц еп очечная Д Н Кпод действием высокойтемпературы переходитводноц епочечноесостояние;
2)связывания (от ж и га ) праймеровсм атричнойД Н К;
3)элонга ц и и , илиудлинения ц епи.
Н а стадии терм ической денатурац ии (расщ епления) двуц епочечной молекулы Д Н К при 93 – 95оС , происходит разделение комплем ентарных ц епей. Затем проб ы охлаж даю тдо 45 - 60оС , что даетвозмож ность связаться праймерам и одноц епочечным дезоксиолигонуклеотидам . П осле отж ига праймеровTaq-полим ераза начинает достраивание второй ц епи Д Н К с 3'- конц а праймера, при этом тем пература реакц ионнойсм есивновь повыш ается до 70 - 72оС , что необ ходим о для раб оты Taq-полимеразы. С м ена этапов каж дого ц икла осущ ествляется путем изм енения температуры реакц ионной смеси.
С начала |
праймеры |
м огут связаться только с |
определенной |
|
последовательностью исходной |
Д Н К, но в последую щ их |
ц иклах они |
||
связываю тся |
с копиям и |
этой |
последовательности, синтезированным и в |
предыдущ их ц иклах. П ри этом количество основного продукта П ЦР (копии
последовательности Д Н К, ограниченной |
праймерам |
и) теоретически |
|
удваивается в каж дом |
ц икле, то есть |
растет с |
числом ц иклов |
экспоненц иально. |
|
|
|
С ледует зам етить, |
что проц есс накопления спец иф ических продуктов |
амплиф икац иипогеометрическойпрогрессииидетлиш ь ограниченноеврем я, а затем его эф ф ективность критически падает. Э то связано стакназываемым «эф ф ектом плато» . Т ерм ин «эф ф ект плато» использую т для описания проц есса накопления продуктовП ЦР на последних ц иклах ам плиф икац ии, когдаколичествоампликоновдостигает0.3 - 1 пмолей.
В зависим остиотусловийиколичества ц икловреакц ииам плиф икац ии,
на м ом ент достиж ения «эф ф екта плато» влияю т: |
утилизац ия суб стратов |
(дН Т Ф ипраймеров); стаб ильность реагентов(дН Т Ф |
иф ерм ента); количество |
ингиб иторов, вклю чая пироф осф аты и Д Н К-дуплексы; неспец иф ические продукты или прайм ер-димеры, конкурирую щ ие за праймеры, дН Т Ф и полим еразу; конц ентрац ия спец иф ического продукта и неполная денатурац ия при высокой конц ентрац иипродуктовам плиф икац ии. Ч ем меньш еначальная конц ентрац ия Д Н К-м иш ени, тем выш е рисквыхода реакц ии на плато. Э тот моментмож етнаступить до того, какколичество спец иф ических продуктов амплиф икац ии б удет достаточно, чтоб ы их мож но б ыло проанализировать. И зб еж ать этогопозволяю тлиш ь хорош ооптимизированныетест-системы.
Ч тоб ы уменьш ить риск об разования неспец иф ических продуктов реакц ии амплиф икац ии, использую тподход, получивш ий название«горячий старт» (отангл. «hotstart » ). С уть его состоитвпредотвращ ениивозмож ности началареакц иидомоментадостиж ения впроб иркеусловий, об еспечиваю щ их спец иф ическийотж игпраймеров.
8
Д еловтом , чтовзависим остиотГ Ц-составаиразмерапраймеры имею т определенную температуру плавления (Tm), при которой об разование водородных связей нестаб ильно. Е сли тем пература систем ы превыш аетТ m, прайм ер не всостоянии удерж иваться на ц епи Д Н К и денатурирует. П ри соб лю дении оптимальных условий, т.е. температуры отж ига, б лизкой к тем пературеплавления, праймер об разуетдвухц епочечную м олекулу только
при условии его полной ком плем ентарности и, таким об разом , |
об еспечивает |
спец иф ичность реакц ии. С ущ ествую т различные варианты |
реализац ии |
«горячегостарта» :
1. внесение вреакц ионную см есь Taq-полимеразы во врем я первого
циклапослепрогревапроб иркидотемпературы денатурац ии;
2.разделениеингредиентовреакц ионной смеси прослойкой, наприм ер, параф ина или воска на части (в ниж ней - прайм еры, в верхней - Taq-
полимераза и Д Н К-миш ени), которые смеш иваю тся при достиж ении тем пературы плавления материалапрослойки(~45 - 85ºС );
3. использованиемоноклональных антител кTaq-полим еразе. Ф ермент, связанный моноклональным и антителами, становится активным лиш ь после стадии первой денатурац ии, когда моноклональные антитела необ ратим о денатурирую тиосвоб ож даю тактивныец ентры Taq-полим еразы.
В о всех |
перечисленных случаях, даж е если неспец иф ический отж иг |
||||||||||
произош ел |
|
до |
начала |
температурного |
ц иклирования, |
элонгац ии |
не |
||||
происходит, |
а при нагревании комплексы прайм ер-Д Н К денатурирую т, |
||||||||||
поэтом у неспец иф ические продукты |
не |
об разую тся. |
В |
дальнейш ем |
|||||||
тем пература впроб ирке не опускается |
ниж е температуры плавления, |
что |
|||||||||
об еспечиваетоб разованиеспец иф ическогопродуктаам плиф икац ии. |
|
||||||||||
Амп лифика ция |
|
|
|
|
|
|
|
|
|||
С тандартная |
П ЦР |
осущ ествляется |
автом атически в термоц иклере в |
||||||||
одной проб ирке, |
содерж ащ ей около 1 |
м кг Д Н К, 20 пиком олей каж дого |
|||||||||
прайм ера, |
по 50 |
мкмолей каж дого дезоксинуклеозидтриф осф ата и |
две |
||||||||
единиц ы терм остаб ильнойTaq Д Н К-полимеразы. |
|
|
|
||||||||
П роб а со м есью |
пом ещ аю тся |
в металлический б лок, температура |
|||||||||
которого |
изм еняется |
с |
помощ ью |
элемента П ельтье. |
Э лемент П ельтье |
||||||
позволяетизм енять тем пературу б лока сб ольш ой скоростью , |
что сокращ ает |
||||||||||
продолж ительность каж догоц иклаП ЦР. |
|
|
|
|
|
9
Рисунок1. С хем аполимеразнойц епнойреакц ии(П ЦР).
С оврем енные терм оц иклеры приспособ лены для использования спец иальных тонкостенных пластиковых проб ирокдля реакц ионной см еси, что позволяет ускорить теплооб м ен меж ду б локом приб ора и реакц ионной
|
10 |
см есью и в конечном итоге дополнительно сократить врем я проведения |
|
реакц ии. |
|
Т аким об разом , стандартная П ЦР мож ет б ыть осущ ествлена за 1 - 3 ч. |
|
М ногие приб оры позволяю т програм м ировать спец иальные услож ненные |
|
тем пературные проф или, необ ходим ые для спец иф ических модиф икац ии |
|
проц ессаП ЦР. |
|
Каквидно из рисунка 1, |
П ЦР имеетц иклический характер. В первом и |
частично во втором ц иклах |
об разую щ иеся копии (а мп ли коны) Д Н К не |
соответствую т границ ам |
амплиф иц ируем ого гена (все ампликоны впервом |
||||||||||
ц иклеичасть ампликоноввовтором ц иклеI получаю тся б олеепротяж енным и |
|||||||||||
в тех |
участках, |
где |
ещ е не |
произош ло |
связывание |
второго — |
|||||
«антисм ыслового» |
праймера). |
О днако, начиная уж е с третьего ц икла длина |
|||||||||
ам пликонов становится |
стандартной, |
т.е. |
соответствует |
числу |
пар |
||||||
нуклеотидов ф рагм ентов Д Н К-матриц ы |
м еж ду |
3'-конц ам и |
прайм еров. |
||||||||
Ам пликоны накапливаю тся |
в геометрической прогрессии |
и начинаю т |
|||||||||
дом инировать среди продуктов ам плиф икац ии. |
П роц есс имеет ц епной |
||||||||||
характер, |
так как синтезированные ф рагм енты |
Д Н К в дальнейш ем |
сам и |
||||||||
служ ат матриц ей, |
на которой идет синтез. П ри многократном |
повторении |
|||||||||
ц иклов |
синтеза |
число |
копий |
спец иф ических |
ф рагм ентов |
Д Н К |
|||||
экспоненц иально |
увеличивается, что позволяет |
из |
неб ольш ого |
числа |
имею щ ихся ф рагментовполучить б ольш оеколичествокопии, которыемож но идентиф иц ировать м етодом электроф ореза.
1.2 Д ет екц ия пр о дукт о в амплификац ии
Для правильной оц енки результатовП ЦР важ но понимать, что данный
метод не является количественным . Т еоретически продукты ам плиф икац ии
единичных молекул Д Н К-миш ени могут б ыть об наруж ены с пом ощ ью электроф ореза уж епосле30 - 35 ц иклов. О днаконапрактикеэтовыполняется лиш ь вслучаях, когда реакц ия проходитвусловиях, б лизких кидеальным .
О соб енно б ольш ое влияние на |
эф ф ективность ам плиф икац ии оказывает |
степень чистоты препарата Д Н К, |
т.е. наличиевреакц ионной см еси тех или |
иных ингиб иторов, откоторых изб авиться внекоторых случаях б ываеткрайне слож но. И ногда из-за их присутствия не удается ам плиф иц ировать даж е десятки тысяч молекул Д Н К-миш ени. Т аким об разом , прям ая связь меж ду исходным количеством Д Н К-м иш ени и конечным количеством продуктов ам плиф икац иичастоотсутствует.
Мет одгори зонт а льногоэлект рофореза
Д ля визуализац ии результатовам плиф икац ии использую т различные м етоды. Н аиб олее распространенным на сегодняш ний день является метод электроф ореза, основанный на разделении молекул Д Н К по разм еру. Д ля этого готовятпластину агарозного геля, представляю щ его соб ой застывш ую послерасплавления вэлектроф орезном б уф ереагарозувконц ентрац ии0.8 – 2 % с доб авлением спец иального красителя Д Н К, - наприм ер, б ромистого