новая папка 2 / 123563

			Таблица 3
	Соотношение компонентов буферной смеси
№ пробирки	рН	Na2HPO4	Лимонная кислота, 0,1М, мл
1	2,2	0,2	9,8
2	3,0	2,0	8,0
3	3,6	3,2	6,8
4	5,0	5,2	4,8
5	5,4	5,6	4,4
6	6,0	6,3	3,7
7	7,0	8,2	1,8
8	8,0	9,7	0,3

Впробирку налить указанное количество Na2НРО4 и долить до 10 мл раствором лимонной кислоты. Далее каждый студент работает самостоятельно.

С корешка гороха (или другого растения) на расстоянии 0,5 см от кончика сделать бритвой строго поперечные, как можно более тонкие срезы (не менее 24), и поместить их

в70% спирт на 5 мин. Спирт слить, срезы залить сначала раствором эозина на 10 мин, затем раствором метиленовой сини на 5 мин. Промывать срезы после спирта и эозина необязательно. Окрашенные срезы перенести в буферные растворы, налитые в бюксы в порядке возрастания рН. В каждой концентрации буферного раствора должно быть 3 среза. Время обработки 1 ч. После окончания обработки приготовить препараты. Под одно покровное стекло следует поместить все три среза из одной буферной смеси. На одном предметном стекле, под разными покровными стеклами, можно сделать препараты из двух-трех концентраций.

Начиная с самого малого значения рН, препараты рассматривать под микроскопом при малом увеличении. Для каждой ткани среза найти значение рН, при котором красный цвет ее переходит в синий.

Врастворах с рН ниже ИЭТ ткани удерживают эозин, а в растворах с рН выше ИЭТ – метиленовый синий. Если при одном значении рН ткань окрашена в красный цвет, а при соседнем – в синий, то величину ИЭТ можно принять средней из этих двух показателей.

Оформление результатов опыта

1) Заполнить таблицу 4.

				Таблица 4
Окраска ткани при одновременном действии эозина и метиленовой синей
	при разных рН (в среднем по трем срезам)
№ препарата	рН буферного	Окраска
	раствора	коровой части		сосудистых пучков
1	2,2
2	3,0
3	3,6
4	5,0
5	5,4
6	6,0
7	7,0
8	8,0

11

2) Какое значение рН соответствует ИЭТ а) коровой части______________________________________

б) сосудистых пучков __________________________________

3) Сделать рисунок одного из срезов, где отчетливо проявляется неодинаковая окраска разных тканей.

Рис. 9. Окраска тканей при одновременном окрашивании эозином и метиленовой синей при рН буферного раствора_______

Работа 2.7. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ИЗОЭЛЕКТРИЧЕСКОЙ ТОЧКИ БЕЛКОВ

Метод основан на неустойчивости растворов белка при рН близкой ИЭТ, что обнаруживается по появлению мути и выпадающего в осадок белка.

Методика выполнения. В восьми пробирках приготовить растворы с разным значением рН, согласно таблице 5.

Таблица 5

Соотношение компонентов для приготовления растворов (в мл) и рН раствора

Компоненты				№ пробирок
	1	2	3	4	5	6	7	8
Вода дистиллированная	8,40	7,75	8,75	8,50	8,00	7,00	5,00	1,00
0,01 Н уксусная кислота	0,60	1,25	–	–	–	–	–	–
0,1 Н уксусная кислота	–	–	0,25	0,50	1,00	2,00	4,00	8,00
рН раствора	5,9	5,6	5,3	5,0	4,7	4,4	4,1	3,8

В каждую пробирку добавить по 1 мл раствора казеина. Содержимое пробирок осторожно взболтать. Определить значение рН ИЭТ белка по появлению небольшой мути в соответствующей пробирке.

Оформление результатов опыта

1) Для казеина рН ИЭТ равна ______________________________________________

Задание для самостоятельной работы

1) Дайте объяснение понятиям:

Денатурация – это _________________________________________________________

Высаливание – это _________________________________________________________

ИЭТ – это _________________________________________________________________

Глобулин – это _____________________________________________________________

12

Лабораторная работа 3 ФЕРМЕНТЫ КЛАССА 1. ОКСИДОРЕДУКТАЗЫ

Цель занятия. Изучить ферменты, участвующие в дыхании.

Ферменты класса 1. Оксидоредуктазы катализируют окислительно-восстановительные превращения дыхательных субстратов. По характеру действия их можно разделить на четыре группы: 1) активаторы водорода (дегидрогеназы); 2) активаторы кислорода (оксидазы); 3) ферменты, выполняющие роль промежуточных переносчиков электрона; 4) вспомогательные ферменты.

Дегидрогеназы активируют атомы водорода, сообщая этим атомам способность переходить с метаболита на соответствующие акцепторы. Каталитический процесс, в ре-

зультате которого водород активируется и отделяется от метаболита, называется де-

гидрированием. Все дегидрогеназы являются двухкомпонентными ферментами. По природе простетических групп они делятся на пиридиновые и флавиновые.

Коферментом пиридиновых дегидрогеназ является никотинамид-аденин-

динуклеотид (НАД) или никотинамид-аденин-динуклеотид-фосфат (НАДФ). Про-

стетической группой флавинпротеидов служат флавин-мононуклеотид (ФМН) или фла-

вин-аденин-динуклеотид (ФАД).

В ходе биологического окисления пиридиновые дегидрогеназы являются первыми акцепторами водорода. При этом субстрат окисляется, а НАД или НАДФ восстанавливается. Пиридиновые дегидрогеназы относятся к анаэробным дегидрогеназам. Они не могут передавать водород непосредственно на кислород. Окисление восстановленного НАД (или НАДФ) осуществляется либо через цитохром «с», либо с помощью аэробных флавиновых дегидрогеназ:

	НАД(Н2) + ФАД				НАД + ФАД(Н2).
Окисление ФАД(Н2) может осуществляться либо путем прямой передачи водорода
на кислород с образованием перекиси водорода:
		ФАД(Н2) + О2			ФАД + Н2О2,
либо чаще путем транспорта электронов через систему цитохромов:
	2e	2e	2e		2e
ФАД(Н2)	цит b	цит c		цит a	цитохромкосидаза
	2Н+	Н2О		1/2О2–

При переносе богатого энергией электрона через систему цитохромов происходит

окислительное фосфорилирование – образование богатых энергией макроэргических связей АТФ.

Оксидазы. К этой группе биологических катализаторов относятся ферменты, функция которых состоит в активации молекулярного кислорода. Следовательно, оксидазы ката-

лизируют заключительные этапы окисления.	Водород субстрата соединяется с кислородом.
Типовая реакция заключительных оксидаз:
RН2 + О2	2R + 2Н2 О.
Примером может служить работа широко распространенного в природе фермента –
дифенолоксидазы:
дифенолоксидаза
+ 1/2 О2	Н2О
дифенол (бесцветный)	хинон (коричневый)

13

При работе оксидаз вместо свободного кислорода может образовываться перекись водорода:

RН2 + О2 R+ Н2О2.

Образовавшаяся перекись водорода может служить донором кислорода при работе пероксидаз.

	пероксидаза
+ Н2О2	2Н2О.

Избыток перекиси водорода разлагается вспомогательным ферментом – каталазой. 2Н2О2 2Н2О + О2.

Терминальные оксидазы являются металлопротеидами. Пероксидазы и каталазы содержат геминовое железо. Они участвуют в образовании промежуточных перекисных соединений, не изменяя при этом своей валентности. Фенолоксидаза – медьпротеид.

Терминальные оксидазы являются металлопротеидами. Пероксидазы и каталазы содержат геминовое железо. Они участвуют в образовании промежуточных перекисных соединений, не изменяя при этом своей валентности. Фенолоксидаза медьпротеид.

Работа 3.1. ОБНАРУЖЕНИЕ ДЕГИДРОГЕНАЗ В СЕМЕНАХ ГОРОХА

Опыт основан на изменении окраски метиленовой синьки при ее восстановлении путем присоединения водорода. Восстановленный препарат – лейкосинька – бесцветна. Донорами водорода могут быть дегидрогеназы, находящиеся в семенах гороха.

Методика выполнения. Набухшие семена гороха очистить от оболочки и поместить по 3 шт в две пробирки. В одну из пробирок налить воду и кипятить 5-10 мин. Воду слить и дать остыть.

Семена в обеих пробирках залить раствором метиленовой синьки на 5-10 мин. Окрашенные семена тщательно промыть водой. Для создания анаэробных условий налить в пробирки воду и закрыть пробками. Пробирки поставить в термостат при температуре 26-30оС. Через 40-60 мин пробирки вынуть и отметить окраску семян в каждой пробирке. Затем воду вылить, семена вытряхнуть на отдельные листочки бумаги. Следить за изменением окраски при доступе кислорода.

Оформление результатов опыта

1)Как изменилась окраска семян после нахождения их в термостате в анаэробных условиях? Объясните наблюдаемые явления.

2)Как изменилась окраска семян при переводе их в аэробные условия? Объясните,

почему?

14

3) Роль дегидрогеназ в наблюдаемых явлениях.

Работа 3.2. ОБНАРУЖЕНИЕ ПОЛИФЕНОЛОКСИДАЗЫ КАРТОФЕЛЯ ДЕЙСТВИЕМ НА ГВАЯКОВУЮ СМОЛУ

Опыт основан на способности гваяковой смолы (НО—ГС—ОН) окислять дегидрированием по типу полифенолов под действием органических окислителей, с образованием окрашенных соединений (О=ГС=О).

Методика выполнения. Неочищенный картофель натереть на терке. Мезгу через марлю отжать в колбу. Сок отстоять для осаждения крахмала 5-10 мин. (Обратите внимание на постепенное побурение сока). В три пробирки налить примерно по 5 мл сока. В одной из пробирок сок прокипятить. Заложить опыт согласно схеме (табл. 6). Отметить окраску смеси в пробирках через одну и пять минут. Через 5 мин пробирки встряхнуть. Наблюдать за изменением окраски.

Для наблюдения распределения ферментов в тканях разрезать клубень. Нанести на срез несколько капель гваяковой смолы. Обратить внимание на неодинаковое посинение отдельных участков клубня.

Оформление результатов опыта

1) Заполнить таблицу 6.

						Таблица 6
	Окраска смеси сока картофеля и гваяковой смолы
№		Состав смеси, в мл			Окраска смеси через
	гваяковая		сок картофеля
пробирки		вода			1 мин	5 мин
	смола		сырой	кипяченый
1	1,5	—	5	—
2	1,5	—	—	5
3	—	1,5	5	—

2) Почему побурел сок или срез картофеля на воздухе? Свяжите этот процесс с окислением полифенолов в хиноны. Напишите схематическую реакцию.

2) Зарисуйте срез клубня картофеля после нанесения гваяковой смолы.

Рис. 10. Клубень картофеля после нанесения гваяковой смолы

15

4)На каких участках среза клубня картофеля наблюдается более интенсивная окраска,

почему?

5)Объясните изменение окраски сырого сока картофеля и гваяковой смолы. Напишите схематическую реакцию. Почему не изменилась окраска смеси в других пробирках?

6) Зарисуйте пробирки после проведения реакции.

Рис. 11. Окраска смеси в пробирках	Рис. 12. Окраска смеси в пробирке №1
через 1 минуту	через 5 минут

7) Как объяснить осветление сока в пробирке №1? Почему остается окрашенным только верхний слой? В чем причина посинения смеси после взбалтывания?

Работа 3.3. ОБНАРУЖЕНИЕ ПЕРОКСИДАЗЫ

Метод основан на изменении окраски гваяковой смолы при окислении ее пероксидазой. Однако, пероксидаза может использовать только кислород перекисей. Для прохождения реакции следует добавить перекись водорода. В клетке пероксидаза использует также органические перекиси.

Методика выполнения. Луковицу репчатого лука разрезать через верхушку и донце пополам. Нанести и равномерно распределить по срезу сначала несколько капель раствора гваяковой смолы. Отметить, изменилась ли окраска среза. Затем смочить срез перекисью водорода и следить за изменением окраски тканей. На предметном стекле смешайте несколько капель гваяковой смолы и перекиси водорода. Проследите, будет ли изменяться окраска?

16

Оформление результатов опыта

1) Зарисуйте срез луковицы после нанесения гваяковой смолы и перекиси водорода.

Рис. 13. Срез луковицы после нанесения смолы и перекиси водорода

2) Напишите схематическую реакцию процесса.

3)Объясните неодинаковую окраску отдельных участков среза.

4)Почему не окрасилась ткань лука только при нанесении гваяковой смолы?

5) Почему не появилась окраска при смешении гваяковой смолы и перекиси водорода на предметном стекле? Какой компонент реакции отсутствует?__________________

Работа 3.4. ГИСТОХИМИЧЕСКАЯ РЕАКЦИЯ НА ЦИТОХРОМОКСИДАЗУ

Реакция основана на том, что в присутствии цитохрома «с» цитохромоксидаза может окислять смесь диметилпарафенилендиамина и нафтола (реактив «нади») с образованием окрашенного соединения – индофенолового синего.

Методика выполнения. Набухшую зерновку кукурузы разрезать вдоль через зародыш. Поместить срез на предметное стекло в каплю реактива «нади». Проследить за изменением окраски тканей.

17

Оформление результатов опыта

1) Зарисуйте срез зерновки кукурузы после нанесения реактива «нади».

Рис. 14. Зерновка кукурузы после обработки реактивом «Нади»

2) На каких участках зерновки наблюдается более интенсивная окраска? Как это объяснить?

Работа 3.5. ОТКРЫТИЕ ФЕРМЕНТА КАТАЛАЗЫ В СЕМЕНАХ ГОРОХА

Опыт основан на наблюдении за выделением пузырьков кислорода при разложении перекиси водорода ферментом каталазой.

Методика выполнения. В три пробирки налейте по 5 мл 3% перекиси водорода. В одну из пробирок поместить набухшие семена гороха. Во вторую такое же семя, но предварительно прокипяченное в отдельной пробирке с небольшим количеством воды. В третью пробирку бросить сухое семя гороха. Наблюдать и послушать, что происходит в каждой из пробирок.

Оформление результатов опыта

1)Напишите реакцию разложения перекиси водорода каталазой.

_______________________________________________________________________________

2)Почему отсутствует реакция в пробирке с прокипяченным семенем гороха?

_______________________________________________________________________________

3)Чем объяснить первоначальное отсутствие реакции и ее усиление со временем в пробирке с сухим семенем гороха?

4)Какую роль играет каталаза в жизни клетки?

Задание для самостоятельной работы Работа 3.6. ОБОБЩЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ОПЫТОВ

Используя методические указания и результаты проведенных опытов, заполните таблицу 7.

18

						Таблица 7
	Характеристика работы окислительно-восстановительных ферментов
		Химическая	Биологический	Доноры	Акцептор	Продукты
				водорода	водорода (вос-
	Название	природа	материал,			реакции
				(окисляю-	станавливаю-
	ферментов	протетичес-	содержащий			и их
				щиеся	щиеся
		кой группы	фермент			окраска
				вещества)	вещества)
	Анаэробная
	дегидрогеназа
	Аэробная
	дегидрогеназа
	Полифенол-
	оксидаза
	Пероксидаза
	Цитохром-
	оксидаза
	Каталаза

Лабораторная работа 4. ПИГМЕHТЫ ХЛОРОПЛАСТОВ И ИХ СВОЙСТВА

Цель занятия. Научиться извлекать и разделять пигменты хлоропластов. Ознакомиться с их физическими, химическими и оптическими свойствами.

Фотосинтез является самым характерным процессом жизнедеятельности растений, основным источником накопления органического вещества и энергии на Земле. В этом процессе из углекислого газа и воды за счет энергии света происходит образование органического вещества.

Главная роль в процессе фотосинтеза принадлежит пигментам листа: зеленым – хлорофиллам «а» и «б», желтым – каротинам и ксантофиллам (каротиноидам). Установлено, что донором энергии для фотосинтетических реакций служит хлорофилл «а». Остальные пигменты передают ему поглощенную энергию.

По химической природе хлорофиллы «а» и «б» – сложные эфиры дикарбоновой кислоты – хлорофиллина (1) и двух спиртов: метила (2) и, встречающегося только в растениях, спирта фитола (3):

Хлорофилл «а»

Хлорофилл «б»

COOC20H39 (3)

COOC20H39 (3)

MgN4OH30C32

MgN4O2H28C32

(1)

COOCH3 (2)

(1)

COOCH3 (2)

Каротиноиды – это непредельные углеводороды с эмпирической формулой С40 Н56. Они обладают ярко выраженными гидрофобными свойствами, сродством к липофильным растворителям.

Ксантофиллы – кислородсодержащие производные каротина. Они имеют от одной до шести гидроксильных групп (–ОH). Основной представитель – лютеин имеет формулу

19

С40H56О2. Имея гидроксильные группы, ксантофиллы обладают гидрофильными свойствами, легко растворяются в спирте и хуже, чем каротиноиды, в липофильных растворителях.

Работа 4.1. ПОЛУЧЕHИЕ СПИРТОВОЙ ВЫТЯЖКИ СМЕСИ

ПИГМЕHТОВ ЛИСТА

Методика выполнения. Живой или высушенный лист растения мелко нарезать в ступку, прибавить немного кварцевого песка и растереть с 3 мл этилового спирта. Продолжая растирать, постепенно добавить еще 5-7 мл спирта. Сильно разбавлять вытяжку не следует, необходимо получить раствор темно-зеленого цвета. Через фильтр, предварительно смоченный этиловым спиртом, отфильтровать полученную вытяжку в пробирку. Полученный фильтрат использовать для последующих опытов.

Оформление результатов опыта

1) Перечислите, какие пигменты листа перешли в спиртовую вытяжку.

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

Работа 4.2. РАЗДЕЛЕHИЕ ПИГМЕHТОВ МЕТОДОМ БУМАЖHОЙ ХРОМАТОГРАФИИ (МОДИФИКАЦИЯ МЕТОДА М. С. ЦВЕТА)

Принципы хроматографии впервые были	разработаны русским	физиологом
М. С. Цветом в начале ХХ века. Метод основан на	различной адсорбции	пигментов на

бумаге и разной растворимости в подвижном растворителе, в данном случае бензине. Бензин, поднимаясь по бумаге, увлекает за собой нанесенные пигменты. Скорость перемещения, а значит, и высота подъема каждого пигмента зависит от сродства его к целлюлозе и растворимости в бензине (липофильный растворитель). Чем лучше растворяется пигмент в растворителе и меньше его адсорбционное сродство к целлюлозе, тем быстрее он передвигается и выше располагается от места нанесения вытяжки.

Методика выполнения. Взять полоску хроматографической бумаги (не руками, за петельку) и нанести на нее вдоль стартовой линии, в виде полосы, спиртовую вытяжку пигментов. После высыхания вытяжку наносят еще 3-5 раз, пока не образуется ярко-зеленое пятно. Держа бумажную полоску за петельку, опустить ее строго вертикально в цилиндр, чтобы кончик (3-4 мл) касался бензина. Цилиндр закрыть пробкой и поставить для разгонки пигментов в темное место (на свету пигменты разрушаются).

Оформление результатов опыта

1)Зарисовать установку для разделения пигментов. Объяснить, какой из пигментов

ипочему расположен на хроматограмме выше?

_________________________________

__________________________________

__________________________________

__________________________________

__________________________________

__________________________________

__________________________________

__________________________________

__________________________________

Рис. 15. Установка для разделения пигментов

2) Зарисовать хроматограмму, обозначить места расположения отдельных пигментов.

20