razdel_3

71

микроскопе используются флуоресцирующие экраны (как в электронной

микроскопии) или изображение регистрируется на фотоматериалы. В более сложных конструкциях для наблюдения изображений в ультрафиолетовом

микроскопе используются электронно-оптические преобразователи, а для

регистрации величины				поглощения		ультрафиолетового	света
микрообъектами		-	фотоумножители. В			связи с этим количественные
методы	анализа,		основанные		на	микроспектрофотометрии	и
микроденситометрии, в ультрафиолетовой области спектра широко развиты.
Конструкция		и	принципиальная		оптическая схема ультрафиолетового

микроскопа практически ничем не отличаются от обычного микроскопа.

Однако, в качестве источника света обычно используются ртутные или ксеноновые лампы, обладающие мощным излучением в ультрафиолетовой области спектра, и специальные объективы, окуляры и другие преломляющие элементы, изготовленные, как указывалось выше, из оптических материалов, хорошо пропускающих ультрафиолетовый свет.

3.5.6. Флуоресцентная микроскопия

Флуоресцентная микроскопия широко используется в цито- и

гистохимии и имеет ряд особенностей, отличающих ее от рассмотренных выше обычных типов микроскопии- в видимой и ультрафиолетовой областях спектра. Принципиальная оптическая схема современного флуоресцентного (люминесцентного) микроскопа с освещением препарата

"падающим светом" приведена на рис.73 а. Свет от источника света(1)

(ртутная лампа) через систему коллекторных линз осветителя(2) и водяной фильтр (3), поглощающего тепловое (инфракрасное) излучение, попадает на специальную спектральную светоделительную пластинку(4), устроенную таким образом, что она сильно отражает коротковолновую часть видимой области спектра и пропускает видимую часть спектра. Для возбуждения флуоресценции имеется специальный фильтр (5).

Возбуждающий свет через объектив (6) попадает на препарат (7) сверху

("падающий свет"). Свет флуоресценции проходит также через объектив

	72
(6), светоделительную пластинку (4), "запирающий" фильтр	(8),
отсекающий

Рис.73.

Принципиальная

схема

флуоресцентного

микроскопа

возбуждающий			свет	и	через	окуляр (9)	наблюдается		исследователем.
На рис.73	б	видно		распределение интенсивности				света, пропущенного
фильтром	(5)	-	возбуждающий свет (св); фильтром					(8) - "запирающий"
фильтр и	свет флуоресценции объекта (сф). Из этого							рисунка видна роль
"запирающего"			фильтра		-	предотвратить	попадание		возбуждающего

света (за счет отражения от препарата) в канал визуального наблюдения флуоресценции микрообъекта. В описанном варианте флуоресцентного микроскопа реализована схема микроскопов в "падающем" (отраженном)

свете, но имеются конструкции флуоресцентных микроскопов, которые работают в проходящем ("просвечивающем") свете.

Но первая схема для флуоресцентных микроскопов является наиболее оптимальной по нескольким причинам.

1). Конденсором является сам объектив и поэтому достигается полное соответствие апертур конденсора и объектива, что очень важно, так как интенсивность света флуоресценции не очень высокая.

2). При освещении "падающим" светом, флуоресценция микроструктур возбуждается в поверхностных слоях препарата и свет флуоресценции объекта не проходит через всю массу препарата, где возможно его

73

поглощение и, таким образом, искажение изображения флуоресцирующего

объекта и уменьшение разрешения микроскопа.
3). Использование специальной спектральной	светоделительной

пластинки значительно улучшает спектральные качества описанной схемы флуоресцентного микроскопа, особенно для разделения возбуждающего света и света флуоресценции объекта.

Флуоресцентная микроскопия широко используется в гистохимии с

использованием нескольких главных методических технологий.

1) Изучение собственной флуоресценции внутриклеточных эндогенных

химических соединений.

Выше было рассмотрено изучение флуоресценции

нескольких таких соединений в области ультрафиолетовой части спектра.

В

видимой области спектра флуоресценцией обладают некоторые витамины,

ряд коферментов ферментов дыхательной цепи в митохондриях и др.

2).

Гистохимические

реакции,

основанные

на

изучении

флуоресцирующих

соединений,

образующихся

в

ходе

таких

реакций

(например, реакция формальдегида с биогенными моноаминами, приводящая

к образованию флуоресцирующих тетраизохинолинов и карболинов).

3).

Но наиболее

многочисленные исследования

проводятся при

использовании

окраски

внутриклеточных

соединений

при помощи

специальных красителей - флуорохромов, обладающих высоким сродством к

разным эндогенным соединениям и высоким квантовым

выходом

флуоресценции.

Некоторые

примеры

гистохимических реакций

с

использованием

методов флуоресцентной микроскопии будут рассмотрены ниже, но одно

из

принципиальных

достоинств

флуоресцентной

микроскопии

и

микроспектрального флуоресцентного анализа клеток необходимо отметить

- возможность прижизненных исследований.

Это

связано

с

высокой

чувствительностью

флуоресцентного

анализа,

что

допускает

использование низких концентраций флуорохромов. В связи с этим,

интересные

возможности

открываются

перед

интрав

флуоресцентной

микроскопией,

в

частности,

с

использованием

			74
потенциалчувствительных	флуорохромов	и	флуоресцирующих
мембранных зондов. Флуоресцентные красители			широко используются в

различных методах иммуноцитохимии и гибридизации мРНКin situ (см.

раздел 4).

Контрольные вопросы

1.Основные элементы светооптического микроскопа. Основы геометрической оптики (линза, плоскость объекта, плоскость изображения, фокус и др.).

2.Хроматическая аберрация. Сферическая аберрация. Астигматизм, кома.

3.Что такое ахроматы, апланхроматы, анастигматы. Оптическое разрешение микроскопа.

4.Апертура объектива. Связь увеличения, апертуры, рабочего расстояния и диаметра поля зрения объективов микроскопов.

5.Оптическая система светооптического микроскопа. Освещение объектов в микроскопах. Увеличение микроскопа (связь с оптическим разрешением).

6.Масляная иммерсия.

7.Оптические свойства биологических мкроскопических объектов (клеток и

тканей).

8.Общая характеристика методов микроскопии.

9.Метод темного поля. Фазово-контрастная микроскопия. Интерференционная микроскопия. Использование интерференционной микроскопии в гистохимии.

10.Поляризационная микроскопия.

11.Ультрафиолетовая микроскопия (применение в гистохимии).

12.Флуоресцентный микроскоп, устройство, особенности. Использование флуоресцентной микроскопии в гистохимии.

РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА ( Раздел 3, Глава 3)

1.Михель К. Основы теории микроскопа, пер. с нем., М., 1955.

2.Скворцов Г.Е., Панов В.А., Поляков Н.И., Федин Л.А. Микроскопы, Машиностроение, Ленинград, 1969.

75

3.Франсон М. Фазово-контрастный и интерференционный микроскопы. Изд. Физ-мат. лит. М., 1960.

4.Панов В.А., Андреев Л.Н. Оптика микроскопов, Машиностроение,

Л., 1976.

5.Карнаухов В.Н. Люминесцентный спектральный анализ клетки.

Наука, М., 1978.

6.Черногрядская Н.А. и др. Ультрафиолетовая флуоресценция клетки.

Л., Наука, 1978.

7.Агроскин Л.С., Папаян Г.В. Цитофотометрия. Наука, Л., 1977.

8.Методы цитологического анализа. Ред. Меллорс Р., ИИЛ, М.,

1957.

9.Введение в количественную цитохимию. Ред. Г.Вейд, Мир, М., 1969.

10.Федин Л.А., Барский И.Я. Микрофотография, Наука, Ленинград, 1971.

11.Бергнер Д., Гельбке, Мелисс. Практическая микрофотография, Мир, Москва, пер. с нем., 1977.

12.Брэдбери С.Дж. и др. Световая микроскопия в биологии. Методы.

М., Мир, 1992.

13.Суворов А.Л. Микроскопия в науке и технике, Наука, Москва, 1981.

14.Шишловский А.А. Прикладная физическая оптика. Физматгиз, М., 1961.

15.Физические методы органической химии. Ред. Вайсберг А., ИИЛ,

М., 1957, гл. ХХХIII, стр. 95-139.