4 курс / Акушерство и гинекология / Кадырова_Л_В_Дифференцировка_Т_лимфоцитов_в_динамике_беременности

71

крови достоверно возрастало сывороточное содержание IL-15 (p<0,05) по сравнению с аналогичным параметром группы небеременных доноров.

Таблица 4.2. Содержание IL-15 в сыворотке периферической крови в динамике неосложненной

беременности

Группы обследуемых женщин		IL-15 пг/мл
Небеременные доноры		1,75±0,60	(n=9)
1 триместр беременности		9,06±3,09*	(n=35)
2 триместр беременности		15,55±6,11*	(n=29)
3 триместр беременности		14,82±4,45*** (n=20)
В скобках дано число проведенных исследований.

* - коэффициент достоверности разности результатов по сравнению с группой небеременных доноров (*- p<0,05;***- p<0,01).

Во 2 триместре беременности нами также отмечался достоверный рост уровня исследуемого цитокина в сыворотке периферической крови по сравнению с показателями небеременных доноров (p<0,05). Сывороточный уровень IL-15 в 3 триместре в группе женщин с неосложненным течением беременности оставался таким же высоким как во 2 триместре гестации (p>0,05) и был достоверно выше, чем в группе небеременных доноров (p<0,01). Показатели содержания IL-15 в 1, 2 и 3 триместрах гестации у женщин с неосложненным течением беременности достоверно не различались (p>0,05 во всех случаях).

Данные по сывороточному уровню IL-2 и IL-15 женщин с неосложненным на момент обследования течением беременности 1 триместра гестации и развившимся впоследствии самопроизвольным выкидышем представлены в таблице 4.3.

Оценка содержания IL-2 в сыворотке периферической крови в зависимости от характера течения беременности показала, что в группе женщин с развившимся впоследствии самопроизвольным выкидышем уровень исследуемого цитокина был несколько выше аналогичного показателя группы женщин с неосложненным

72

течением беременности 1 триместра гестации, однако статистически значимых изменений этого фактора нами выявлено не было (p>0,05).

				Таблица 4.3.
	Содержание IL-2 и IL-15 в сыворотке периферической крови женщин с
	развившимся впоследствии самопроизвольным выкидышем
	Группы обследуемых	IL-2 пг/мл		IL-15 пг/мл
	женщин
	Неосложненное течение	0,89±0,44	(n=41)	9,06±3,09	(n=35)
	беременности
	Развившийся выкидыш	1,27±1,05	(n=13)	88,90±36,85*	(n=14)

В скобках дано число проведенных исследований.

* - коэффициент достоверности разности результатов по сравнению с группой женщин с неосложненным течением беременности 1 триместра гестации (*- p<0,05).

Результаты исследования особенностей продукции IL-15 в сыворотке периферической крови показали, что для женщин с развившимся впоследствии самопроизвольным выкидышем характерно достоверное увеличение уровня исследуемого цитокина по сравнению с аналогичным показателем женщин с неосложненным течением беременности в 1 триместре гестации (p<0,05).

Таким образом, при неосложненной беременности в сыворотке периферической крови отмечалось увеличение уровня IL-2 и IL-15 относительно группы контроля, сохранявшееся на протяжении всего гестационного процесса. Развитие самопроизвольного выкидыша в 1 триместре гестации было ассоциировано с более высокими значениями сывороточного уровня IL-2 и IL-15 по сравнению с аналогичными цитокинами при неосложненной беременности.

73

ГЛАВА 5. ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ

Беременность является уникальным состоянием, при котором в единой системе существуют два организма (мать и плод) не являющиеся генетически идентичными друг другу. Плод имеет половину генов отцовского происхождения, следовательно, организм матери должен воспринимать его как «чужое» и реагировать реакцией отторжения, аналогичной той, которая возникает при пересадке органов и тканей [9]. Однако при нормальном развитии беременности этого не происходит.

Исследование основ «толерантности» материнской иммунной системы к фетальным антигенам является одним из наиболее изучаемых аспектов иммунологии репродукции. Формирование плодово-плацентарного комплекса определяет физиологическую ситуацию, при которой иммунная система матери сталкивается с тканеспецифическими антигенами плода отцовского генома. Иммунные механизмы при беременности включаются уже на стадии имплантации оплодотворенной яйцеклетки и в дальнейшем в значительной мере обуславливают ее физиологическое течение [9].

Физиологическое течение беременности ассоциировано с формированием иммунологической толерантности к аллоантигенам плода. Предполагается, что стимуляция иммунной системы матери антигенами плода является необходимым фактором нормального развития беременности, а избыточное поступление АГ при нарушении барьерной функции плаценты приводит к формированию акушерской патологии [9, 167, 152]. Это позволило нам предположить, что при беременности могут формироваться специфические клоны лимфоцитов, реагирующие на антигены плода, с последующим формированием пулов клеток памяти. Однако характер дифференцировки наивных Т-клеток и Т-клеток памяти при неосложненной беременности в динамике гестационного процесса остается мало изученным.

74

В связи с этим целью проведенного исследования было установить особенности содержания наивных клеток (Tn), центральных (Tcm), претерминально-дифференцированных (Tem) и терминальнодифференцированных (Temra) клеток памяти в популяциях периферических Т- хелперов (CD4+) и цитотоксических Т-лимфоцитов (CD8+) у беременных женщин с неосложненным течением беременности в динамике гестационного процесса, а также у женщин с неосложненным на момент обследования течением беременности и развившимся впоследствии самопроизвольным выкидышем в 1 триместре гестации, с параллельным исследованием функциональной активности данных пулов клеток на основании изучения внутриклеточной продукции IFNи IL-4 в п опуляции CD4+ лимфоцитов и Granzyme B и Perforin в популяции CD8+ лимфоцитов.

Было проведено обследование 36 здоровых небеременных женщин с реализованной репродуктивной способностью (контрольная группа), 85 женщин с неосложненным течением беременности в динамике гестационного процесса в 1 (5-8 недель), 2 (16-20 недель) и 3 (28-32 недели) триместрах (основная группа). При ретроспективном анализе в зависимости от последующего характера течения гестационного процесса среди женщин основной группы была выделена подгруппа женщин с развившимся впоследствии ранним самопроизвольным выкидышем. Женщины, у которых развились другие осложнения беременности в разработку не вошли.

В ходе нашего исследования было установлено, что в периферической крови женщин с неосложненным течением беременности в динамике гестационного процесса значительно изменялись показатели, характеризующие процесс дифференцировки Т-хелперов и цитотоксических Т-лимфоцитов, причем как наивных Т-лимфоцитов, так и Т-клеток памяти.

По данным литературы известно, что основным источником наивных Т- клеток является тимус, который играет исключительно важную роль в установлении и поддержании Т-клеточного пула на периферии [161]. Показано, что у взрослых людей наивные Т-лимфоциты пролиферируют с небольшой

75

интенсивностью и делению на периферии подвергается приблизительно 1% CD4+ и CD8+ клеток [199].

Ранее проводились исследования по содержанию наивных клеток, определяемых фенотипом CD4+CD45RA+ и CD8+CD45RA+, только при развитии различной акушерско-гинекологической патологии [9, 45, 139]. Однако использование только маркера CD45RA не позволяет точно оценить эту популяцию клеток, поскольку маркер CD45RA определяется и на терминальнодифференцированных Т-клетках [47, 204, 31]. В настоящее время предлагается использовать более широкий спектр маркеров наивных клеток. Такие работы при беременности являются единичными [9], следует также отметить, что эти исследования проводились срезами, а не лонгитудинальным методом.

Многочисленными исследованиями было показано, что беременность сопровождается транзиторной инволюцией тимуса, выраженной в снижении его массы и клеточности, главным образом за счет атрофии коркового слоя и истощения популяции кортикальных тимоцитов [210, 43, 84]. Однако проведенное нами исследование показало, что на всем протяжении неосложненной беременности, как в популяции Т-хелперов, так и популяции цитотоксических Т-лимфоцитов, в периферической крови возрастало содержание наивных клеток с фенотипом CD45RA+CD62L+ по сравнению с аналогичными показателями небеременных доноров. При этом рост уровня наивных лимфоцитов в этот период был связан, видимо, не с усилением лимфопоэза, так как численного увеличения общих популяций CD4+ и CD8+ лимфоцитов у беременных женщин мы не наблюдали. Учитывая этот факт, закономерно возникает вопрос о механизмах увеличения фракции наивных Т-лимфоцитов во время беременности.

Одним из показателей, позволяющих оценить характер дифференцировки наивных клеток, является определение колец реаранжировки генов -цепи антигенраспознающего рецептора или TREC [65, 186]. По литературным данным TREC образуется в тимоцитах при перестройке генов Т-клеточного рецептора, при этом образуется последовательность нехромосомной кольцевой ДНК, которая

76

присутствует только в наивных Т-лимфоцитах и в дальнейшем не реплицируется при их митозе и в процессе деления клетки переходит лишь к одной из дочерних клеток [65, 186]. В случае внетимусного созревания Т-лимфоцитов, TREC в клетках не определяется. Следовательно, измерение количества TREC позволяет выявить клетки, являющиеся недавними эмигрантами из тимуса и, таким образом, оценить функциональную активность тимуса [65, 186].

Проведенное нами исследование показало, что с наступлением беременности и на всем ее течении усиление экспрессии ДНК TREC в общей фракции периферических Т-лимфоцитов не наблюдалось. Более того, во втором триместре беременности этот показатель был достоверно снижен по сравнению с аналогичным показателем небеременных доноров. В 3 триместре беременности экспрессия ДНК TREC вновь достигала значений, характерных для небеременных женщин. Результаты наших исследований совпадают с результатами работы швейцарских ученых, которые также отмечали снижение уровня ДНК TREC у женщин с неосложненным течением беременности 2 триместра гестации в популяции Т-хелперов [100].

Поскольку TREC являются маркером тимической дифференцировки Т- лимфоцитов, по-видимому, рост уровня наивных Т-хелперов и цитотоксических Т-лимфоцитов в периферической крови при неосложненной беременности не мог определяться данным процессом. Установленное нами уменьшение уровня ДНК TREC в периферических лимфоцитах на всем протяжении гестации свидетельствуют о том, что повышение содержания наивных клеток в популяциях CD4+ и CD8+ лимфоцитов при беременности не определялось усилением выхода клеток из тимуса.

Известно, что в качестве еще одного маркера недавно мигрировавших из тимуса клеток рассматривают молекулу PECAM-1 или CD31. Молекула CD31 (PECAM-1) относится к адгезионным молекулам межклеточного взаимодействия семейства Ig-подобных белков [34]. CD31 экспрессируется на поверхности наивных Т-лимфоцитов, недавних эмигрантов из тимуса, а внетимическое созревание наивных Т-лимфоцитов совпадает с прогрессирующим уменьшением

77

экспрессии CD31 [202]. На основании этих данных в настоящее время выделяют две фракции, получившие название тимических и центральных наивных Т- лимфоцитов – CD31+ thymic и CD31- central [121]. По нашим данным при беременности рост содержания наивных CD4+ и CD8+ клеток в периферической крови сочетался с увеличением на всем протяжении гестации пула CD31- central клеток и снижением ранних эмигрантов из тимуса CD31+ thymic клеток.

Таким образом, проведенные исследования показали, что при беременности рост уровня наивных Т-лимфоцитов на системном уровне не связан с функциональной активностью тимуса, но мог быть обусловлен усилением экстратимической дифференцировки Т-лимфоцитов или пролиферацией клонов наивных лимфоцитов на периферии в результате воздействия факторов ранней беременности. Так, в отдельных работах имеются данные о стимулирующем влиянии при беременности гормонов роста на повышение уровня наивных лимфоцитов [96]. Относительно недавно было установлено, что во время беременности развитие Т-клеток может осуществляться в результате экстратимической дифференцировки лимфоцитов Т-ряда в лимфатических узлах, дренирующих матку, в децидуальной оболочке матки и в печени [35, 42]. Вероятно, этот механизм позволяет компенсировать частичное подавление тимического пути развития Т-клеток во время беременности в результате транзиторной атрофии тимуса. Аналогичный процесс происходит при возрастной инволюции тимуса, когда по мере старения организма отмечается повышение содержания Т-клеток экстратимического происхождения [43].

Ряд исследователей считают, что экстратимическая дифференцировка во время неосложненной беременности может индуцироваться эстрогенами плаценты и активацией симпатических нервов [81, 88, 143]. Кроме того, на процесс внетимической дифференцировки Т-лимфоцитов могут оказывать влияние цитокины плаценты и децидуальной оболочки беременной матки, в частности OSM (онкостатин М), концентрация которого в сыворотке беременных женщин значительно выше аналогичных показателей небеременных женщин [36, 37].

78

Механизм экстратимической дифференцировки Т-лимфоцитов в настоящее время изучен недостаточно. По мнению одних авторов реаранжировке цепей Т- клеточного рецептора подвергаются зрелые лимфоциты в результате его «ревизии» и появления нового репертуара антигенраспознающего центра [15]. Другие авторы рассматривают экстратимическую дифференцировку как процесс реаранжировки -цепей T-клеточного рецептора в незрелых лимфоцитах, эмигрировавших из тимуса [118]. В этом случае формирование -цепей Т- клеточного рецептора должно было бы сопровождаться образованием TREC, однако, как показали наши исследования, при беременности этого не происходит.

Следует подчеркнуть, что по нашим данным, образующийся при беременности пул наивных Т-хелперов обладал способностью к продукции цитокинов и Th1, и Th2 типов иммунного ответа. В нашей работе получалось, что пролиферирующие наивные клетки в больших количествах продуцируют IFN– маркер Th1 типа иммунного ответа, так и IL-4 – маркер Th2 типа иммунного ответа.

Данные литературы о характере дифференцировки Th1 и Th2 клеток при беременности не однозначны [56, 68, 164], и практически полностью отсутствуют сведения о дифференцировки наивных Т-хелперов. Ранее считалось, что преимущественное развитие иммунного ответа по гуморальному типу менее опасно для плода, в то время как Th1 тип иммунного ответа определяет потенциально враждебный для плода клеточно-опосредованный иммунный ответ [56]. Однако в ряде работ были получены данные, не укладывающиеся в рамки этой теории [68, 164]. Оказалось, что увеличение в крови содержания комплекса цитокинов Th1 типа иммунного ответа не всегда коррелирует с неблагоприятным течением и исходом беременности и, наоборот, при акушерско-гинекологической патологии может быть высокий уровень цитокинов Th2 типа иммунного ответа

[68, 164].

Наши данные свидетельствуют о повышении способности иммунной системы матери к индукции как клеточного, так и гуморального иммунного ответа. Усиление дифференцировочного потенциала Т-хелперов при

79

беременности, вероятно, определяется необходимостью быстрого развития иммунного ответа матери на патологическое воздействие факторов внешней среды и изменения внутреннего гомеостаза.

Результаты исследований показали, что отличительной чертой пула наивных ЦТЛ являлось усиление их способности к продукции цитотоксических молекул (Granzyme B) в ранние сроки гестации, и последующее снижение цитотоксической и цитолитической активности клеток во 2 триместре беременности. По данным литературы известно, что многие исследователи рассматривают инфекционный фактор как ведущую причину невынашивания беременности [5, 29, 2, 23]. Весомая роль в патогенезе невынашивания принадлежит вирусной инфекции [28, 14, 2]. Показано, что активная вирусная инфекция может вызывать нарушение плацентации [28].

Вероятно, в 1 триместре беременности при отсутствии мощного плацентарного барьера, повышение уровня наивных ЦТЛ, продуцирующих Granzyme B, позволяет ограничить распространение клеток, пораженных вирусом, путем их апоптоза и цитолиза. Во 2 триместре беременности, процесс формирования плацентарных барьеров завершается, и плацента берет на себя функцию ограничения поступления различных патогенов к плоду, что, вероятно, делает этот механизм менее актуальным. Снижение уровня наивных цитотоксических Т-лимфоцитов, продуцирующих Granzyme B и Perforin, в этом случае может свидетельствовать о наличии особых механизмов, ограничивающих цитотоксический потенциал в отношении клеток плодового происхождения.

Наряду с процессом экстратимической дифференцировки наивных Т- лимфоцитов при беременности увеличение данного пула клеток могло определяться гомеостатической пролиферацией клеток на системном уровне. По данным литературы гомеостатическая пролиферация наивных клеток поддерживается рядом цитокинов, таких как IL-7 и IL-2 [110, 153]. Кроме того, IL-2 является основным ростовым фактором Т-лимфоцитов [39, 11]. Количество IL-2, продуцируемого активированными Т-хелперами, определяет величину Т- клеточного иммунного ответа [39].

80

Всвязи с этим на следующем этапе нашей работы мы оценили сывороточный уровень IL-2 и попытались выявить возможное влияние этого цитокина на процесс дифференцировки Т-хелперов и цитотоксических Т- лимфоцитов при неосложненной беременности в динамике гестационного процесса в 1, 2 и 3 триместрах гестации.

Влияние IL-2 на процесс дифференцировки Т-лимфоцитов при беременности остается мало изученным. Однако Лазаревой Ю. Ю. (2013г.) в эксперименте in vitro было показано, что воздействие IL-2 вызывает рост содержания наивных клеток в популяции периферических CD8+ лимфоцитов у беременных женщин 3 триместра гестации [16].

Внашей работе с наступлением беременности отмечалось значительное увеличение сывороточного уровня IL-2, сохранявшееся и во 2 триместре гестации, со снижением к концу гестационного процесса.

Как известно, основными продуцентами IL-2 являются CD4+ лимфоциты [39, 11]. Причем, активация гена IL-2 в лимфоцитах происходит только после взаимодействия антигена с Т-клеточным рецептором [39]. Полученные нами данные позволяют предположить, что, начиная уже с ранних сроков беременности, на системном уровне происходит активация Т-хелперов под действием факторов, специфичных для гестационного процесса. К таковыми могут относиться и АГ плодового происхождения. Так как многочисленными исследованиями было показано, что в периферический кровоток матери во время беременности проникают фрагменты синцитиотрофобласта, ДНК и лимфоциты плода [18, 27, 66, 92, 113, 183, 184, 149, 167]. Регуляция IL-2 зависимой пролиферации лимфоцитов прямо связана с присутствием специфического антигена и при его элиминации быстро затухает [39].

Как известно, при акушерской патологии проницаемость плацентарного барьера усиливается, что приводит к большему поступлению антигенов плодового происхождения в кровоток матери [9, 184]. Возможно, именно это обусловило выявленную нами тенденцию к повышению содержания IL-2 в периферической крови женщин с неосложненным на момент обследования