6 курс / Клинические и лабораторные анализы / Флуоресцентные_методы_диагностики_в_медицине_Колтовой_Н_А_Краевой

1960 - Москва - МГУ - Факультет фундаментальной медицины - кафедра медицинскиой

биофизики - Владимиров Юрий Андреевич - академик РАМН, дбн.

1960 - Владимиров Ю.А. Бурштейн Э.А. Спектры люминесценции ароматических аминокислот и белков. Биофизика. I960. т.5. № 4. с.385-392.

1961 - Владимиров Ю.А. О люминесценции ароматических аминокислот в молекуле белка.

ДАН СССР, 1961. 136(4): p.960-963.

1962 - Владимиров Ю.А. Чиньго Л. Спектры люминесценции белков и ароматических аминокислот при различных рН. Биофизика, 1962. т.7. №3. с.270-280.

1965 - Владимиров Ю.А. Фотохимия и люминесценция белков. 1965. Москва. Наука. 232 с. 1965 - Владимиров Ю.А. Зимина Г.М. Люминесценция некоторых белков и триптофана при монохроматическом возбуждении в растворах с различными рН. Биохимия, 1965. т.30. №6.

с.1105-1114.

1969 - Vladimirov U.A. Photochemistry and luminescence of proteins. AEC-tr 1969, Jerusalem,: Israel Program for Scientific Translations available from the U.S. Dept. of Commerce, Clearinghouse for

Federal Scientific and Technical Information, Springfield, Va. iii, 207 p.

1972 - Клебанов Г.И. Сороковой В.И. Владимиров Ю.А. Исследования конформационных свойств биологических мембран методом измерения белковой люминесценции. Молекулярная биология. 1972. №6. с.705.

1964 - Пущино - ИТЭБ - Бурштейн Эдуард Аронович

1961 - Бурштейн Э.А. Люминесценция ароматических аминокислот и белков в растворах при возбуждении в коротковолновой ультрафиолетовой области. Биофизика. 1961. т.6. №6. с.753. 1964 - Бурштейн Эдуард Аронович. Применение спектральных методов в исследовании функциональных состояний белков Диссертаци Кандидата. 1964. 160c. Научные руководители: чл. корр. Франк Г.М. к.б.н. Владимиров Ю.А.

1966 - Бурштейн Э.А. Зимина Г.М. Владимиров Ю.А. Применение люминесцентного метода для определения состояния ароматических аминокислот (тирозина и триптофана) в белках и ферментных системах. Журнал прикладной спектроскопии, 1966. 4(2): p.142-146.

1968 - Бурштейн Э.А. Тушение-флуоресценции белков. I.Принципы метода. Растворы триптофана, тирозина и денатурированных белков. Биофизика, 1968, т.13, выл.3, с.433-442. 1970 - Веденкина Н.С. Бурштейн Э. А. Триптофановая флуоресценция белков в растворах. Положение максимума спектра флуоресценции. Молекулярная биология. 1970. № 4. с.743-748. 1971 - Пермяков Е.А. Бусел Е.П. Бурштейн Э.А. Люминесценция и состояние производных индола в замороженных водно-солевых растворах. Ж. структ. химии, 1971, т.12, № I, с.79-86. 1973 - Юмакова Е.М. Атанасов Б.П. Бурштейн Э.А. Пермяков Е.А. рН-индуцированные конформационные изменения нативного состояния производных миоглобина. Спектрофлуориметрическое исследование. В сборнике "Конформационные изменения биополимеров в растворе", Москва, Наука, 1973, с.113-120.

1973 - Бурштейн Э.А. Люминесценция белка. Природа и применение. Итоги науки и техники. Серия Молекулярная биология. т.3. М. ВИНИТИ. 1973. с.127.

1970 - Веденкина, Н.С. и Э.А. Бурштейн. Триптофановая флуоресценция белков в растворах. Положение максимума спектра флуоресценции. Молек. биол. 1970. 4:743-748.

1972 - Веденкина, Н.С. М.Н. Ивкова, и Э.А. Бурштейн. Положения максимума спектра флуоресценции поверхностных остатков триптофана в белках. Молек. биол. 1972. №6. с.467-

470.

1975 - Пермяков Е.А. Люминесцентные исследования динамики структуры белка при низких температурах. Дисс. канд. ИБФ АН СССР, Пущино, 1975.

1976 - Бурштейн Э.А, Люминесценция белковых хромофоров (модельные исследования). В кн.: Биофизика, М. ВИНИТИ, 1976, т.7, 213 с. (Итоги науки и техники).

1976 - Бурштейн Э.А. Собственная люминесценция белков (Природаи применение). В кн.: Биофизика, М. ВИНИТИ, 1977, т.7, 190 с. (Итоги науки и техники).

1983 - Бурштейн Э.А. Собственная люминесценция белка как метод изучения быстрой структурной динамики. Молекулярная биология 1983, т.17, $ 3, с.455-467.

41

2000 - Решетняк Яна Константиновна. Взаимосвязь между параметрами флуоресценции триптофановых остатков и структурно-физическими особенностями микроокружения индольных колец в белках. Диссертация кандидата физико-метаематических наук. 2000. Пущино. 184с.

1998 - Емельяненко, В.И. и Э.А. Бурштейн. Аналитическое описание спектров флуоресценции ароматических аминокислот и белков. Ж. Прикл. Спектроск. 1998. т.65. с.360-365.

2000 - Емельяненко, В.И. Я.К. Решетняк, О.А. Андреев, и Э.А. Бурштейн. Анализ логнормальных компонент спектров флуоресценции связанных с белками продана и акрилодана. Биофизика. 2000. 45.

2007 - Емельяненко Виктор Иванович. Компонентный анализ спектров флуоресценции как метод исследования структурных и физико-химических переходов в белках. Диссертация кандидата физико-математических наук. Пущино. 2007. 109 с.

1966 - Санкт-Петербург - Институт Цитологии АН

Баренбойм Григорий Матвеевич - дбн, ген дир ГЦ водохозяйственного мониторинга МПС РФ 1966 - Баренбойм Г.М. Доманский А.И. Туроверов К.К. Люминесценция биополимеров и клеток. М. Л. Наука. 1966. 233 с.

1970 - Туроверов К.К. Щелчков Б.В. Исследование тепловой денатурации белков с помощью двухволнового метода регистрации изменений спектра их ультрафиолетовой флуоресценции.

Биофизика. 1970. т.15, №6. с.965-970.

1998 - Туроверов К.К. Кузнецова И.М. (Санкт-Петербург, Институт Цитологии) Собственная УФ-флуоресценция белков как инструмент для изучения их динамики. Цитология. 1998. т.40.

№8/9. с.735-746.+ 1998 - Туроверов К.К. Кузнецова И.М. (Санкт-Петербург, Институт Цитологии) Что определяет

характеристики собственной УФ-флуоресценции белков? Анализ свойств микроокружения и собственной локализации их триптофановых остатков. 1998. т.40. №8/9. с.747-753.+ 1999 - Туроверов Константин Константинович, Собственная флуоресценция белков: Структура

и динамика макромолекул. Диссертация доктора физико-математических наук. СанктПетербург. 1999. 209с.

----------------------------------------------------------------------------------------------------------

1967 - Зеленин А.В. Люминесцентная цитохимия нуклеиновых кислот. М. Наука. 1967.

1973 - Бусел Е.П. Люминесцентные свойства основных хромофоров белка. Итоги науки и техники. Серия Молекулярная биология. М. ВИНИТИ. 1973. т.3. с.85-126.

1980 - Марков И. Б. Цымбал Л. Н. Немцева Г. Е. (Рига) Изучение возможности флуориметрического количественного определения белков в плазме крови. В сб. Люминесцентный анализ в медико-биологических исследованиях. Рига. 1980. с.23.

1989 - Драган А.И. Храпунов С.Н. (Киев, КГУ) Адсорбционные и люминесцентные исследования межмолекулярных взаимодействий тирозинового хромофора. I. Анализ спектров поглощения и флуоресценции. Биофизика. 1989.

1989 - Драган А.И. Храпунов С.Н. (Киев, КГУ) Адсорбционные и люминесцентные исследования межмолекулярных взаимодействий тирозинового хромофора. II. Влияние полярности растворителя на спектры флуоресценции хромофора. Биофизика. 1989. т.34, №2.

с.187-194.+

1993 - Шепотиновская И.В. Назарова И.Н. Уманская Н.Я. (Ростов-на Дону, РГУ) Флюорометрический метод определения амидных групп белков. Лабораторное дело. 1993. с.18. 1993 - Аборнев, С.М. 1993. Разложение составных спектров триптофановой флуоресценции.

1996 - Векшин Н.Л. Разделение тирозиновой и триптофановой компонент флуоресценции методом синхронного сканирования. Биофизика. 1996. т.41, №6. с.1176-1179.

42

1.3 Флуоресценция порфиринов.

Порфирины (Porphyrin)- природные макрогетероциклические пигменты, в основе которых лежит порфирин, макроцикл из четырех колец пиррола.

Рис. 1-40. Структура порфирина.

Повышенное содержание порфирина в крови (порфирия) наблюдается при недостатке железа (при интоксикации (свинец, сульфазол, барбитураты)), авитаминозах (пеллагра), перниционной анемии, некоторых заболеваниях печени.

Гемоглобин - это железопорфирины, связанные с белком глобином. Однако гемоглобин не флуоресцирует.

Всю группу можно разделить на собственно порфирины, дигидропорфирины (хлорины) и тетрагидропорфирины (бактериохлорины), отличающиеся степенью гидратации двойных связей. Изучение свойств хлоринов и бактериохлоринов привлекательно с точки зрения их использования в качестве экзогенных фотосенсибилизаторов при фотодинамической терапии.

Определить количество порфирина в крови можно с помощью флуоресцентного микроскопа. Необходимо просчитать количество флуоресцирующих эритроцитов в поле зрения.

Собственная флуоресценция клеток крови и костного мозга незначительна. Цитоплазма лейкоцитов крови и ядерных элементов костного мозга обладает тусклым, едва заметным зеленоватым свечением. Ядра клеток почти не флуоресцируют.

Вэритроцитах содержится – протопропорфирин (ПП), копропорфирин (КП) и уропорфирин

(УП),

ПП-Э - протопорфирин в эритроцитах, КП-Э - копропорфирин в эритроцитах, УП-Э - уропорфирин в эритроцитах,

Всыворотке крови содержится копропорфирин.

ПП-С - протопорфирин в сыворотке, КП-С - копропорфирин в сыворотке, УП-С - уропорфирин в сыворотке,

Эндогенные свободные порфирины образуются в результате распада гемов и миоглобинов. Все порфирины появляются за счет химического изменения этилпорфирина в организме. Порфирин IX, являясь одним из основных порфиринов в организме, соединяясь с железом, образует гем. В костном мозге за сутки синтезируется 250-300 мг порфирина, и он используется в синтезе гема. Наибольшее количество свободных порфиринов (50 мг) проникает в эритроциты. В патологическом состоянии количество порфиринов внутри эритроцитов увеличивается в 10-15 раз.

Протопорфирины.

Протопорфирины - часть молекулы гемоглобина, найдены в свободной форме в эритроцитах, что придает им красную флуоресценцию низкой интенсивности. При отравлении

43

свинцом содержание протопорфиринов в эритроцитах возрастает в 40 раз, при недостатке железа - в 20 раз. Протопорфирин IX имеет максимумы поглощения 405 и 621 нм, максимумы флуоресценции - 623, 675, 705 и 800 нм. Максимум 675 нм соответствует димерам протопорфирина IX. Раствор протопорфирина IX в эфире обнаруживает полосы поглощения с максимумами при 403 (полоса Соре), 504 (I), 535 (II), 575 (III) и 633 нм (IV).

Копропорфирины.

Экзогенные порфирины вместе с мясными и растительными продуктами попадают в организм, всасываясь через кровь, проникают в печень и превращаются в копропорфирины. Основная часть копропорфиринов вместе с желчью выделяется в кишечник, а остальная часть попадает в кровь и через почки вместе с мочой выделяется наружу.

Основным порфирином, присутствующим в норме в моче и кале, является копропорфирин. Примерно половина корпропорфирина в свежей моче находится в не флуоресцирующей форме. При довольно мягких условиях окисления не флуоресцирующая форма переходит во флуоресцирующую. В результате распада порфиринов, проходящего в несколько этапов, образуется уробилиноген, часть которого из производных желчного сока вновь всасывается через стенки кишечника и удаляется из кровотока с кровью, но при некоторых патологических процессах выводится с мочой. На воздухе уробилиноген окисляется до уробилина, который флуоресцирует. Копропорфирин III ( растворитель - эфир) - при 392 (полоса Соре), 495 (I) 528 (II), 568 (III) и 623 нм (IV).

Считается, что полоса Соре и полосы I и III обусловлены электронными переходами. Полосы II и IV имеют колебательное происхождение.

Для большинства порфиринов характерно наличие четырех полос поглощения в видимой области спектра и более интенсивной полосы Соре с максимумом около 400нм.

Максимумы спектра поглощения протопорфиринов составляют 337, 370, 405, 532, 632

нм.

Металлопорфирины.

В организме человека биологически-активными являются металлопорфирины. они, как правило, флуоресцируют слабо. При образовании комплексов с белками (гемоглобин) они даже гасят флуоресценцию. При отрыве атома железа от простетической группы внутриклеточные гемопорфирины начинают флуоресцировать. В тканях и препаратах ферментов, способных к осуществлению начальных этапов синтеза порфиринов, наблюдается усиление интенсивности флуоресценции.

44

Рис. 1-41. Спектр поглощения различных металлопорфиринов в THF. Максимум поглощения (полоса Соре) для различных металлопорфиринов:

H2P - 412,5 / ZnP - 422,3 / PdP - 415,9 / CuP - 410,3 / NiP - 413,4.

Таблица 1-5. Спектральные характеристики некоторых порфиринов.
	Возбуждение	Флуоресценция		Поглощение
Копропорфирин III	401,531,498,573	625,690	392,568,495,623,528
Протопорфирин IX	408,538,506,580	635,700	403,575,504,633,535
Копропорфирин III-д	400,548	596,651	400,547,590
Протопорфирин IX-д	410,560	606,662	407,554,600
Znкопропорфирин III	409,542	578,628	407,540,576
Zn-протопорфирин IX	418,550	588,638	417,548,585

Порфирин-д обозначает дикатион (димер).

Рис. 1-42. Типичный спектр поглощения порфиринов.

Рис. 1-43. 1-спектр пропускания отсекающего светофильтра, 2-спектр возбуждения порфиринов, 3-спектр флуоресценции порфиринов.

45

2005 - Al-Daghri. A, "Spectral characterization of cancer patients' blood". Thesis of Master of Science in Physics, 2005. В работе исследуется спектр флуоресценции порфиринов.

Рис. 1-44. Спектр флуоресценции порфирина при возбуждении светом 400 нм.

Рис. 1-45. Синхронный спектр флуоресценции порфирина. Сдвиг между длиной волны возбуждения и регистрации 10 (сплошная линия) и 70 нм (пунктирная линия).

46

Рис. 1-46. Двумерный спектр флуоресценции протопорфирина и копропорфирина.

Усиление флуоресценции порфиринов.

Интенсивность флуоресценции порфиринов существенным образом зависит от рН раствора. При увеличении рН интенсивность флуоресценции растет. Увеличивая рН можно увеличить интенсивность флуоресценции.

Рис. 1-47. Зависимость интенсивности флуоресценции порфиринов от рН для различных порфиринов. 1-гематопорфирин, 2-изоуропорфирин, 3-уропорфирин.

47

Fink H. разработал метод инентификации порфиринов на основе анализа зависимости флуоресценции от рН.

1930 - Fink H. Weber K. Флуоресценция порфиринов и концентрация Н-ионов. Naturwiss. 18. 16

(1930).

1937 - Fink H. Выделение порфиринов и их идентифокация по кривым рН интенсивности флуоресценции. Ber. Dt. Chem. Ges. 70. 1477 (1937).

1938 - Theil F. Метод определения порфиринов в моче, удобный в клинических условиях. Biochem. Zs. 298. 436 (1938).

Литература по порфиринам.

1972 - Москва - ВНИИ биосинтеза белковых веществ.

1972 - Манешин С.К. Аревшатян А.А. Люминесценция порфиринов в дрожжах р. Candida, выращенных на углеводородах. Биофизика, 1972, т.17, 352-354.

1973 - Манешин С.К. Денисова т.С. Аревшатян А.А. Исследование особенностей и природы порфирииов, синтезируемых дрожжами. Биофизика живой клетки, т.4. Пущино, 1973, с.59-66. 1973 - Манешин С.К. Аревшатян А.А. Способ определения соотношения живых и мертвых клеток микроорганизмов. Патент 351892, 1973.+ Клетки облучают светом с длиной волны 400420 нм. Затем регистрируют собственную флуоресценцию окисленной и восстановленной форм порфиринов на длине волны 580 и 630 нм.

1971 - Кубатиев А.А. Рак и порфирины Вопросы онкологии. 1971. т.17. №7. с.86.

1973 - Кубатиев А.А. Порфирины, витамин В12 и рак. Тула. Приокское книжное издательство. 1973. 224с.

1974 - Добротина Н.А. Кривошеев Б.Н. Содержание и функциональная активность протеинов сыворотки крови и некоторые вопросы патогенеза дерматозов с нарушением порфиринового обмена. Вестн. дерматол. 1974. № З. с.42-48.

1985 - Соловьев К.Н. Гладков Л.Л. Старухин А.С. Шкирман С.Ф. Спектроскопия порфиринов. Колебательные состояния. Минск. Наука и техника. 1985. 415 с.

1985 - Порфирины: структура, свойства, синтез. М. Наука. 1985. 333 с.

1987 - Ениколопян Н.С. Порфирины: спектроскопия, электрохимия, применение. М. Наука. 1987. 384с.

1995 - Химическая энциклопедия. Порфирины. Наука. М. 1995. 4. с.44-149.

1999 - Решетников А.В. Швец В.И. Пономарев Г.В. Успехи химии порфиринов. т.2. СПб.: Издво НИИ Химии СПбГУ. 1999. Гл.4. Водорастворимые тетрапиррольные фотосенсибилизаторы для фотодинамической терапии рака. с.70-114.

2001 - Хелевина О.Г. Чижова H.B. Успехи химии порфиринов. т.З. СПб.: Изд-во НИИ Химии СПбГУ, 2001. Гл.4: Реакции замещения тетразапорфиринов. с.72-86.

2004 – Кривошеев Александр Борисович (Новосибирск, НГМУ) Заболевания внутренних органов и нарушения порфиринового обмена. Диссертация доктора медицинских наук. Новосибирск. 2004.

2006 - Рогаткин Д.А. Любченко П.Н. Карпов В.Н. Горенков Р.В. (Москва, МОНИКИ) Способ диагностики свинцовой интоксикации организма. Патент 2283036. 2006.+

48

2007 - Савенкова Наталья Сергеевна, (Томск, ТГУ) Спектрально-люминесцентные свойства тетрапиррольных соединений. Диссертация кандидата химических наук. Томск. 2007. 163с.

2007 - Вдовин Ю.А. Марколия А.А. Гончуков С.А. Курочкин В.И. (Москва, МИФИ) Спектры флуоресценции порфиринов при возбуждении источником света с перестраиваемой длиной волны. Научная сессия МИФИ. 2007. с.29.+

2007 - Юдина Марина Владимировна (Екатеринбург, УГМА) Клинико-лабораторная характеристика и показатели порфиринового обмена у детей с анемиями, лечение. Диссертация кандидата медицинских наук. Екатеринбург. 2007. 124 с.

Зарубежная литература по порфиринам.

1961 - Lipson R.A. Baldes E.J. Olsen A.M. The use of a derivative of hematoporphyrin in tumor detection / J. Nat. Cancer Inst. 1961. Vol. 26. p.1-11.

1975 - Porphyrins and metalloporphyrins. Ed. by K.M. Smith. Elsevier: Oxford, 1975. 890 p.

1978 - Gouterman M. Optical spectra and electronic structure of porphyrins and related rings. In: The porphyrins. Ed. by D. Dolphin. Acad. Press: London, 1978. V. 3. p.1-165.

1983 - Aizava R. Endoscjpic detection of Hematoporphirin derivative fluorescein tumors. Lasers and Hematoporphirin derivative in Cancer.Tokio. 1983. P.21-24.

1988 - Profio, A. E. 1988. Review of fluorescence using porphyrins. Proc. SPIE 905:150–156.

1999 - J.W. Meng, X.J. Wang, H.P. Ma, X.G. Ren, X.R. Xu, W.M. Ren, Protoporphyrin IX fuorescence from the plasma of tumor-implanted mouse, J. Luminsc. 83–84. (1999) 251–254.

2000 - The porphyrin handbook. Ed. by Kadish K.M. Smith K.M. Guilard R. Academic Press: New York, 2000-2003. Vol. I-XX.

49

1.4Различные эндогенные флуорофоры.

А- Общие таблицы флуорофоров

Б - Общие двумерные спектры флуорофоров

В - Коферменты никотинамидадениндинуклеатид - НАД (NAD) Г - Коферменты флавины Д - Витамин В2 (рибофлавин)

Д1 – Витамин В9 - Фолиевая кислота (folic acid). Пик (360,450).

Д2 – Билирубин (460,515)

Е - Скатол Ж - Индол З - Серотонин

И - Адреналин К - Хинидин Л - Меланин

Л1 – фибрин (280,344)

М - Коллаген I и II Н - Эластин О - Кератин П - Каротин

Р - Липофусцин С - Нуклеиновые кислоты - ДНК, РНК

Т - Продукты окислительно-восстановительных реакций. У- ионы железа.

А - Общие таблицы флуорофоров.

Таблица 1-6. Длины волн возбуждение/флуоресценция для различных флуорофоров.

---------------------------------------------------------------------------------------------------------

250 / 282 -аминокислота - фенилаланин Phe

-------------------------------------------300 -фиолетовый----------------------------------------

280 / 303 - аминокислота - тирозин -Tyr-(tyrosine)

/310 - нейтральный возбужденный радикал гидроксила (ОН*)

230 / 335 - индол (Indole) (1)

(274, 280) / (330)348 - аминокислотатриптофан - Trp - (tryptophan)

231 / 350 - аминокислота - триптофан - Trp - (tryptophan)

290 / 360 - возникает при окислении свободными радикалами остатка гистидина

230 / 370 - скатол (Skatole)

337 / 397 -белок коллаген I, II (collagen)

--------------------------------------------400 синий-----------------------------------------------

325/400 - коллаген

360 / 410 - белок эластин (elastin)

325/416 – битирозин – продукты окисления белков 250-310 / 360-420 - флуоресценция активных форм кислорода в чистой воде ?/415 - битирозин - продукт окисления тирозина

280 / 420 - кофермент NAD - окисленная форма

340 / 440 - кератин (keratin)

280 и 350 / 460 - кофермент NADH - восстановленная форма

340 / 450 (465, 480) - коферменты NADPH (НАДФ) 360/450 – фолиевая кислота – витамин В9, 335/480 - витамин К 390/480 - витамин Д

50