К настоящему времени уже многое известно о свойствах раковой стволовой клетки и их молекулярных причинах. На этой основе разработан ряд новых методов для ранней диагностики раковых клеток в организме пациента и их избирательной ликвидации. Часть этих методов уже внедрена в клиническую практику, в том числе индукция реверсии и апоптоза раковых клеток экстрактом из фетальных тканей человека.
Часть их лишь начинает «выходить» из лабораторий или «на выходе» в клиническую практику, например, метод «глушения» экспрессии генов свойств раковой клетки интерферирующей РНК: введенная в раковую клетку короткая молекула РНК связывается с иРНК гена и тогда синтез белка прекращается, а значит, раковая клетка утрачивает соответствующее белку свойство.
Желание приблизить время широкого внедрения новых методов ранней диагностики раковых стволовых клеток и методов их ликвидации в клиническую практику, а также в целях учебного процесса со студентами, явились для нас главными причинами написать это учебное пособие.
Из большого материала о раковой клетке, еѐ свойствах и их молекулярных причинах, мы сделали критический выбор того, что особенно необходимо для ранней диагностики раковых клеток и их ликвидации с целью излечения от рака.
В основу учебного пособия положены: 1) материалы литературы по молекулярной медицине и молекулярной онкологии; 2) наши лекции по онкологии для студентов стоматологического факультета, отдельные лекции для студентов лечебного факультета, а также семинары по онкологии для студентов на элективном курсе; 3) наш опыт как хирурга-онколога с 1971 г. и по настоящее время в отделении «Опухоли головы и шеи» Волгоградского областного клинического онкологического диспансера («ВОКОД» №1).
Без смены объекта для диагностики и лечения с уровня рака на уровень раковой стволовой клетки, без знаний молекулярных причин свойств раковой клетки, нам не удастся справиться с еѐ следствием, т.е. раком.
11
В книге каждый раздел написан как самостоятельная единица, но связь между разделами есть и ясна. Мы выражаем благодарность авторам и издатель-
ствам за использование в книге иллюстраций, заимствованных из журналов,
книг и публикаций и стремились привести эти источники в списке литературы.
Учебное пособие – «Азбука рака» идет навстречу нуждам студента, как в ранней диагностике рака, так и в излечении от него новыми методами. Оно мо-
жет быть полезным и для врачей-онкологов.
А.И. Рукавишников
12
Глава 1. Геном нормальной соматической клетки
1.1. ДНК – молекула жизни. Открытие структуры и функции, значе-
ние открытия
Из истории открытия структуры ДНК В 1910 г. стало ясно, что гены располагаются на хромосомах. Но не ясно
было, из какого материала состоят гены – из белка или из нуклеиновой кисло-
ты.
В 1928 г. Ф. Гриффит начал изучать роль нуклеиновой кислоты в жизни клетки в опытах на пневмококках.
Имеется два типа пневмококков. У одного пара бактериальных клеток окружена капсулой. Второй тип клеток – без капсулы. Капсула защищает мик-
робы от фагоцитоза. Если ввести такие мышам, то они погибают. Пневмококк без капсулы не заражает мышей и не вызывает пневмонию.
Опыт. Мышей заразил смесью клеток живых пневмококков без капсул и мертвых пневмококков с капсулами.
Ожидалось, что мыши останутся здоровыми. Но они погибли от пневмо-
нии. Живые бактерии, выделенные из мышей, имели капсулы. Это явление трансформации клетки.
Опыт. Микробиологи предположили, что какое-то вещество мертвых пневмококков способно заставить живые клетки образовывать капсулы. Они показали это в опытах.
Пневмококки с капсулами убили, растерли их и приготовили раствор из разрушенных этих клеток, – это экстракт. В культуральную среду внесли экс-
тракт из мертвых клеток с капсулами, затем в эту среду внесли живые пневмо-
кокки без капсул.
Результат: некоторые из клеток без капсул трансформировались в клетки с капсулами; их потомки также обладали капсулами и при введении их мышам вызывали пневмонию.
13
Оказалось, что клетки без капсул претерпели изменение - они стали обла-
дать капсулами и вызывали пневмонию. Важно, что и их потомки также обра-
зовывали капсулы и вызывали пневмонию.
Вывод: 1) признаки пневмококков изменились, 2) это вызвано скорее тем,
что какой-то компонент экстракта или он стал частью пневмококка.
Опыты Ф. Гриффита продолжили американские учѐные – микробиолог О.Т. Эвери (1877-1955) и его сотрудники.
Они задались вопросом: какое вещество вызывает трансформацию одного штамма пневмококка в другой? Для этого они повторили опыты Ф. Гриффита,
используя вместо микробов экстракт из них.
Экстракт в опытах с пневмококками сохранял свою трансформирующую активность при разрушении в нем белков и РНК, но терял ее при разрушении ДНК.
Вывод: трансформирующим веществом является ДНК. Отсюда гены по-
строены из ДНК.
Трансформация состоит в передаче генов от умерших пневмококков в живые и внедрении их в хромосому-хозяина, т.е. в бескапсульные пневмококки.
Эти данные об открытии учѐные опубликовали в 1944 г. Так впервые бы-
ло доказано, что признак от одной клетки передается другой веществом ДНК.
Но как?
Роль ДНК в клетке была дополнена из жизни вирусов, содержащих ДНК.
Они заражают клетки бактерий для того, чтобы осуществить в них цикл ра-
змножения.
При этом обнаружилась способность ДНК вируса синтезировать свои ко-
пии и белки.
Из всего следует, что ДНК контролирует жизнь содержащих ее клеток и способна синтезировать копии своих молекул. Этот процесс называется «само-
удвоением» или размножением. ДНК – единственная в природе молекула, спо-
собная копироваться.
Вклад акад. Н.К. Кольцова
14
В 1927 г. наш ученый – акад. Н.К. Кольцов (1872-1940) писал, что «в од-
ной хромосоме укладывается одна невероятно длинная молекула, а вдоль неѐ располагаются отдельные группировки атомов – гены».
Он также впервые сказал, что «при делении клеток такие молекулы не создаются заново из отдельных кусков, а сначала достраивают на себе точные копии, а затем исходная молекула и копия разойдутся вместе с дочерними хро-
мосомами в образующиеся заново клетки». Это матричный принцип реплика-
ции генов и затем хромосом перед делением клетки на две.
Как происходит удвоение ДНК перед делением клетки было тайной для биологов в течение многих десятилетий. Учѐные догадывались, что для по-
нимания этого необходимо знать: 1) строение ДНК и 2) способы расположения нуклеотидов в молекуле.
К 1950 г. было известно, что ДНК молекула, которая состоит из тысяч со-
единенных между собой в линию молекул четырех разных типов – ну-
клеотидов.
Э. Чаргафф (1950) показал, что в любой ДНК количество аденина равно количеству тимина (А=Т), а количество гуанина – количеству цитозина (Г=Ц).
Это указывало на то, что в молекуле ДНК они находятся парами: А-Т; Г-Ц.
Р. Фраклин (1920-1958) в лаборатории М. Уилкинса методом рентгенов-
ской кристаллографии получила «знаменитое ныне изображение картины структуры ДНК».
Однако из этих знаний не ясно было: как работает эта молекула или как она выглядит? Никто не знал, как выстраиваются химические единицы – А, Т,
Г, Ц, чтобы нести в себе информацию о плане строения и воспроизводства жи-
вого.
Модель молекулы ДНК Д. Уотсон и Ф. Крик занялись созданием модели молекулы ДНК, как Л.
Полинг – для изучения пространственной структуры белка. Она помогла бы по-
нять детали структуры и возможные функции ДНК.
15
Проведя расчѐты, они в течение 18 месяцев были заняты созданием мо-
дели и создали модель ДНК. Но они не были уверены в правильности этой мо-
дели.
Руководитель Р. Франклин – М. Уилкинс разрешил Д. Уотсону ознакоми-
ться с рентгеновским изображением молекулы ДНК, не сказав об этом ничего Р. Франклин. Когда Д. Уотсон увидел полученное Р. Франклин изображение, он понял: «они с Ф. Криком не ошиблись». На этом снимке они четко видели при-
знаки спирали и пошли сразу в лабораторию, чтобы проверить «всѐ на объем-
ной модели».
Из-за отсутствия пластин Д. Уотсон вырезал из картона четыре типа ма-
кетов нуклеотидов: аденина (А), Тимина (Т), гуанина (Г) и цитозина (Ц) и стал раскладывать их на столе.
Он тут же обнаружил, что аденин соединяется с тимином, а гуанин с ци-
тозином по принципу «ключ-замок», образуя пары. Именно таким образом удерживаются между собой две цепи молекулы ДНК.
Последовательность этих пар в молекуле может бесконечно варьировать.
Это и служит шифром или кодом, при помощи которого зашифрована инфор-
мация, определяющая тип белка, синтезируемого данной клеткой (Рис. 1).
Рис. 1. Молекула ДНК и двух цепей. Основания соединены водородными связями.
Молекула ДНК имеет две функции: 1) передавать информацию потомст-
ву, т.е. дочерним клеткам и 2) реализовывать информацию внутри клетки.
Из структуры двойной спирали сразу видно прямое следствие – реплика-
цию, т.е. размножение ДНК. Способ: расхождение двух комплементарных це-
пей и построение по каждой из них новой – дополняющей цепи. Так из одной молекулы ДНК образуется две, что требуется для деления клетки на две.
Ошибки при репликации, т.е. мутации – причина превращения нормальной клетки в дефектную (Рис. 2 и 3).
16
Рис. 2. Расхождение цепей ДНК.
Pиc. 3. Достраивание по каждой из цепей новой, – дополняющей цепи.
Итак, был доказан матричный принцип репликации ДНК перед делением клетки, предсказанный великим учѐным, акад. Н.К. Кольцовым. Две части мо-
лекулы отделяются друг от друга, по каждой из них синтезируется новая поло-
вина молекулы. Порядок же оснований – в роли матрицы или образца для дост-
раивания молекул.
ДНК – хранилище генетической информации Информация о синтезе каждого типа белка заложена в ДНК в виде некой
линейной последовательности оснований.
В 1961 г. Ф. Крик доказал, что каждая группа из трех оснований образует кодон. Один кодон кодирует одну аминокислоту из 20 главных аминокислот.
Для переноса информации о структуре белка из ядра клетки имеется иРНК. Она – копия с фрагмента кодирующей матричной цепи ДНК. В ней вме-
сто тимина содержится урацил.
По иРНК в рибосоме с помощью транспортной РНК будет синтезирован белок – конечное звено реализации генетической информации. Так как ДНК служит хранилищем генетической информации, ее называют молекулой жизни.
До начала работы Д. Уотсона и Ф. Крика над структурой ДНК, уже мно-
гое было известно.
17
Р. Франклин в 1951 г. впервые получила первую уникальную рентгено-
грамму молекулы ДНК, где видно, что эта молекула имеет форму двойной спи-
рали, очень похожую на винтовую лестницу. Еѐ снимки сыграли решающую роль в открытии Д. Уотсона и Ф. Крика. В знак этого, Р. Франклин называют
«пионером» молекулярной биологии.
За открытие структуры ДНК и еѐ функций Д. Уотсон, Ф. Крик и М. Уил-
кинс в 1962 г. удостоены Нобелевской премии. Р. Франклин не дожила. Она скончалась от рака в 1958 г.
Революция в мире науки Открытие пространственной структуры ДНК – стало основанием для ряда
новых открытий.
В 60-х гг. ХХ в. механизм репликации ДНК подтвердился, обнаружен фермент – ДНК-полимераза, катализирующий этот процесс.
Открыт генетический код, т.е. шифр, по которому в клетке синтезируются белки.
В 70-х гг. XX в. ещѐ два метода были созданы: секвенирование и получе-
ние рекомбинантной ДНК.
Секвенирование дает возможность «читать» последовательность нуклео-
тидов в ДНК. С помощью этого метода расшифровывался «геном человека».
Получение рекомбинантной ДНК или метод молекулярного клонирова-
ния. Суть этого метода – в молекулу ДНК встраивают фрагмент, содержащий определенный ген.
Например, вводят его в бактерию, и она синтезирует его продукт – белок,
который необходим человеку.
В 80-х гг. XX в. разработана полимеразная цепная реакция (ПЦР). Эта технология необходима для быстрого «размножения» нужного фрагмента ДНК.
С помощью ПЦР можно осуществлять раннюю диагностику бактериаль-
ных и вирусных инфекций, а также первые раковые клетки в организме пациен-
та по их генам-маркерам.
18
Например, в плазме крови пациента можно обнаружить фрагменты генов-
маркеров раковой клетки. Если фрагмент в малом количестве или единствен-
ный, с помощью ПЦР его размножают и после этого легко идентифицируют.
Открытие структуры ДНК дало возможность учѐным расшифровать ге-
ном человека и многих других организмов. Это открытие позволило перейти к генной терапии любой болезни, в том числе рака.
Раковая клетка «плохо распознается иммунной системой пациента, т.к.
она возникает из нормальной клетки организма-хозяина».
Поэтому для уничтожения раковых клеток с помощью генной терапии,
надо прежде сделать раковые клетки «чужими» для иммунной системы.
Есть много способов, как это сделать. Можно из материала биопсии рака выделить раковые клетки, ввести в них «чужой» ген, а затем эти раковые клет-
ки ввести обратно в организм пациента. В таком случае иммунная система по белку этого гена будет распознавать раковые клетки как «чужие» и уничтожать их.
В опытах на животных такой метод воздействия на ДНК раковых клеток дал обнадеживающие положительные результаты. Но для лечения же пациен-
тов от рака, подобный метод находится пока на этапе клинических испытаний
(Е.Д. Свердлов, 2003).
Кэре «живых технологий»
Исовсем необычно – начало новой эры «живых технологий». Учѐные ря-
да стран заявляют, что они почти готовы к созданию «искусственной жизни»,
т.е. абиогенезу.
Пока нет единого определения живого, для него характерны три приз-
нака; 1) наличие контейнера, т.е. мембраны, вмещающего содержимое клетки; 2) метаболизм – способность преобразовывать базовые питательные вещества в рабочие механизмы клетки; 3) наличие генов – химических конструкций, нео-
бходимых для построения клетки, которые могут передаваться потомству и из-
меняться вместе с изменениями окружающей среды.
19
Каждый из этих трѐх элементов уже воспроизведѐн в лабораториях, учѐ-
ные готовы приступить к попыткам соединить всѐ это «в одну рабочую едини-
цу», т.е. клетку.
В случае успеха, это будет «мир сверхмалых живых машин: специальные клетки будут лечить организм человека и бороться с загрязняющими окру-
жающую среду веществами».
Ближайшей задачей науки учѐные считают создание «искусственной клетки», способной к самовоспроизводству и вырабатывающей уникальные химические вещества, в том числе лекарства, которые пока не удаѐтся синтези-
ровать.
«Искусственное живое» будет находиться под полным контролем челове-
ка, например, «подпитывая» его элементами, не встречающимися в природе в чистом виде.
Синтез вирусов и начало синтеза клетки
1. Проф. Э. Уиммер (E. Wimmer) и его группа из Нью-Йорка в 2002 г.
впервые со времѐн зарождения «живого» на Земле, создали вирус полиомиели-
та из неживой материи.
Ученые спорят: вирусы – это живые существа или неживые объекты?
У.М. Стэнли – лауреат Нобелевской премии – считает, что «в клетке ви-
рус ведѐт себя как живое существо, а вне клетки он мертв, как камень».
Г. Надсон – наш микробиолог, говорит так: «Вирус – это то ли вещество,
обладающее свойствами существа, то ли существо со свойствами вещества».
Акад. В.А. Энгельгардт – наш учѐный, писал: «Многие вирусы состоят всего лишь из белка и нуклеиновой кислоты. Они могут быть отнесены к хими-
ческим соединениям – нуклеопротеидам».
Геном вируса полиомиелита полностью расшифрован. На этом основании учѐные собрали точную последовательность нуклеотидов, соответствующую естественному образцу.
20