Методы гистологической окраски

04-040903

Вартин-Старри

(набор для выявления спирохет)

Срок годности: 1 год Хранить при температуре 15-25°С, в темном месте

Реактивы

А. Концентрированный буферный раствор 1х50 мл

B.Концентрированный раствор нитрата серебра 1х12 мл

C.Проявляющий раствор: компонент 1°, 10х6 мл

D.Проявляющий раствор: компонент 2°, 10х6 мл

E.Проявляющий раствор: компонент 3°, 10х5 мл

Применение

Используется с целью выявления спирохет. Аргирофильная реакция основана на способности клеточной стенки бактерий связывать ионы серебра и, восстанавливая до металлического состояния, обеспечивать их визуализацию.

Внимание: Необходимо использование бидистиллированной воды Не использовать покрытые полилизином предметные стекла Избегать использования металлических инструментов

Описание метода

Поместить срезы в дистиллированную воду.

Приготовить импрегнирующий раствор: поместить контейнер для стекол в полистироловый штатив. Заполнить контейнер 13 мл дистиллированной воды, добавить 4.5 мл реактива А и 20 капель реактива В. Осторожно перемешать стеклянной палочкой, предварительно вымытой в дистиллированной воде.

Поместить образцы в контейнер и инкубировать при 50°С 40 мин

Параллельно приготовить «проявляющий раствор» (желательно приготовить раствор за 12 мин до окончания инкубации). Подогреть бутылочки с реагентами С и D в течение

10 мин при 50°С. Содержимое обеих бутылочек перелить во второй контейнер для стекол (обращайте внимание на температуру бутылочек – используйте защитные перчатки), осторожно перемешать стеклянной палочкой, предварительно вымытой в дистиллированной воде, добавить содержимое бутылочки с реагентом Е и вновь перемешать.

Поместить образцы в «проявляющий раствор» и инкубировать при 50°С 3-4 мин.

Промыть срезы в теплой проточной воде в течение 2 мин.

Дегидрировать в спиртах возрастающей концентрации, просветлить в ксилоле и заключить под покровное стекло.

Результаты

Спирохеты и другие микроорганизмы	черные
Фон	золотисто-коричневый

11

04-050802

Набор для окраски по Вейгерту

(для окраски эластических волокон)

Срок годности: 2 года Хранить при температуре 15-25°С

Реактивы

А. Раствор перманганата калия, 18 мл

	В.	Активирующий кислотный
		буфер, 18 мл
	C. Раствор щавелевой кислоты, 30 мл
	D.	Раствор резорцин-фуксина
		по Вейгерту, 80 мл
	E.	Дифференцирующий кислотный
		буфер, 30 мл
Кровеносный сосуд

Применение

Выявление эластических волокон в тканях. Метод основан на афинности комплекса резорцинфуксин к эластическим волокнам и реакции преципитации между резорцином, основным фуксином и хлоридом железа. В виду относительной специфичности метода возможно окрашивание и других структур: коллагена, базальных мембран. С целью селективного окрашивания эластических волокон необходимо проводить тщательное дифференцирование. Данная методика отличается от экспресс-метода как набором реактивов, так и спецификой процесса; она более селективна, так как используется менее концентрированная смесь красителей и более продолжительная инкубация.

Описание метода

Поместить срезы в дистиллированную воду.

Нанести на срез 5 капель реактива А и 5 капель реактива В, оставить на 5 мин.

Промыть срезы в дистиллированной воде.

Нанести на срез 10 капель реактива С., оставить на 10 мин.

Промыть срезы в дистиллированной воде.

Поместить срезы в реактив D, закрыть контейнер (предотвращение испарения этанола) и инкубировать ночь.

Промыть срезы в дистиллированной воде.

Нанести на срез 10 капель реактива Е, оставить на 10 мин.

Промыть срезы в дистиллированной воде.

Дегидрировать в спиртах возрастающей концентрации, просветлить в ксилоле и заключить под покровное стекло.

Результаты

Эластические волокна

от темно-синих до черных

12

04-052812

Набор для окраски по Вейгерту

(экспресс-метод)

Срок годности: 2 года Хранить при температуре 15-25°С

Реактивы

А. Раствор йодной кислоты, 30 мл В. Спиртовой раствор для влажной

камеры, 80 мл

C.Фуксин-резорцин Вейгерта, 30 мл

D.Дифференцирующий кислотный буфер, 30 мл

E.Кармалаун Майера, 30 мл

Артерия

Применение

Выявление эластических волокон в тканях; рекомендовано при исследовании патологии сосудов.

Метод основан на афинности эластических волокон к красителю, являющейся следствием реакции между резорцином и основным фуксином в присутствии хлорида железа. В виду относительной специфичности метода возможно окрашивание и других структур: коллагена, базальных мембран. С целью селективного окрашивания эластических волокон необходимо проводить тщательное дифференцирование.

Описание метода

Поместить срезы в дистиллированную воду.

Нанести на срез 10 капель реактива А, оставить на 5 мин.

Промыть срезы в дистиллированной воде.

Приготовить влажную камеру: на дно контейнера налить 0.75 мл реактива В; поместить препарат во влажную камеру, предварительно нанеся на срез по 10 капель реактива С. Инкубировать 30 мин.

Промыть срезы в дистиллированной воде.

Нанести на срез 10 капель реактива D, оставить на 2 мин.

Промыть срезы под проточной водой в течение 5 мин.

Промыть срезы в дистиллированной воде.

Нанести на срез 10 капель реактива Е, оставить на 5 мин.

Промыть срезы в дистиллированной воде.

Дегидрировать в спиртах возрастающей концентрации, просветлить в ксилоле и заключить под покровное стекло.

Результаты

Эластические волокна	красно-коричневые
Ядра	красные

13

04-053812

Вейгерт - Ван-Гизон

(экспресс-метод)

Срок годности: 2 года Хранить при температуре 15-25°С

Реактивы

А. Раствор йодной кислоты, 30 мл В. Спиртовой раствор для

инкубационного контейнера, 80 мл C. Резорцин-фуксин Вейгерта, 30 мл D. Дифференцирующий кислотный

буфер, 30 мл

E. Железный гематоксилин Вейгерта, раствор В, 18 мл

F. Железный гематоксилин Вейгерта,

Соединительная ткань и эластические волокна раствор А, 18 мл

G. Пикрофуксин Ван-Гизона, 30 мл

Применение

Выявление эластических волокон, соединительной ткани и клеточных ядер. Рекомендовано при исследовании патологии сосудов. Метод основан на афинности эластических волокон к красителю, являющейся следствием реакции между резорцином и основным фуксином в присутствии хлорида железа. В виду относительной специфичности метода возможно окрашивание и других структур: коллагена, базальных мембран. С целью селективного окрашивания эластических волокон необходимо проводить тщательное дифференцирование. Подкрашивание по Ван-Гизону позволяет одновременно дифференцировать коллаген от матрикса и окрашивать ядра.

Описание метода

Поместить срезы в дистиллированную воду.

Нанести на срез 10 капель реактива А, оставить на 5 мин.

Промыть срезы в дистиллированной воде.

Приготовить инкубационный контейнер: на дно контейнера налить 0.75 мл реактива В; поместить образцы в контейнер, предварительно нанеся на срез по 10 капель реактива С. Закрыть контейнер и инкубировать в течение 30 мин.

Промыть срезы в дистиллированной воде.

Нанести на срез 10 капель реактива D, оставить на 2 мин.

Промыть срезы в проточной воде в течение 5 мин.

Промыть срезы в дистиллированной воде.

Нанести на срез 5 капель реактива Е и 5 капель реактива F, оставить на 10 мин.

Промыть срезы в дистиллированной воде.

Нанести на срез 10 капель реактива G, оставить на 10 мин. Дегидрировать в спиртах возрастающей концентрации, просветлить в ксилоле и заключить под покровное стекло.

Результаты

Эластические волокна	от пурпурно-красных до коричневых
Ядра	черные
Коллаген	различные оттенки красного
Матрикс, эритроциты	желтые

14

04-051802

Вейгерт - Ван-Гизон

Срок годности: 2 года Хранить при температуре 15-25°С

Реактивы

Реактивы:

А.	Раствор йодной кислоты 30 мл
B.	Раствор Вейгерта	80 мл

C.Дифференцирующий кислотный буфер, 30 мл

D.Железный гематоксилин Вейгерта, раствор В, 18мл

E.Железный гематоксилин Вейгерта, раствор A, 18 мл

F. Пикрофуксин по Ван-Гизону, 30 мл

Соединительная ткань и эластические волокна

Применение

Интегрированный метод выявления эластических волокон, соединительной ткани, коллагена и клеточных ядер. Окрашивание по Ван-Гизону наиболее часто ассоциировано с окрашиванием по Вейгерту.

Методоснованнаафинностиэластическихволоконккрасителю,являющейсяследствиемреакции между резорцином и основным фуксином в присутствии хлорида железа. В виду относительной специфичности метода возможно окрашивание и других структур-коллагена, базальных мембран. С целью селективного окрашивания эластических волокон необходимо проводить тщательное дифференцирование. Данная методика отличается от экспресс-метода как набором реактивов, так и спецификой процесса; она более селективна, так как используется менее концентрированная смесь красителей и более продолжительная инкубация. Подкрашивание по Ван-Гизону позволяет одновременно дифференцировать коллаген от матрикса и окрашивать ядра.

Описание метода

Поместить срезы в дистиллированную воду.

Нанести на срез 10 капель реактива А, оставить на 5 мин.

Промыть срезы в дистиллированной воде.

Поместить срезы в реактив D, закрыть контейнер (предотвращение испарения этанола) и инкубировать ночь.

Промыть срезы в дистиллированной воде.

Нанести на срез 10 капель реактива С, оставить на 10 мин.

Промыть срезы в дистиллированной воде.

Нанести на срез 10 капель реактива B и добавить 5 капель реактива Е, оставить на 10 мин.

Подсинить образцы в проточной воде в течение 10 мин.

Нанести на срез 10 капель реактива F, оставить на 7 мин.

Быстро (2-3 сек) промыть срезы в дистиллированной воде.

Дегидрировать в спиртах возрастающей концентрации с одноминутной задержкой в последнем – абсолютном этаноле, просветлить в ксилоле и заключить под покровное стекло.

Результаты

Эластические волокна	от темно-синих до черных
Ядра	черные
Коллаген	различные оттенки красного
Матрикс, эритроциты	желтые

15

04-182807

Набор для диагностики болезни Вильсона

(выявление скоплений меди)

Срок годности: 2 года Хранить при температуре 15-25°С

Реактивы

А. Раствор натрия ацетата, 30 мл В. Раствор формалина (v/v), 30 мл С. Концентрированный спиртовой раствор роданина, 30 мл

D. Раствор гематоксилина Майера, 30 мл

Печень

Применение

Для визуализации скоплений меди в препаратах ткани печени.

Принцип метода

Ряд заболеваний печени связан с избыточным накоплением меди в печеночной ткани, присутствующей в ней и в физиологичном состоянии. При болезни Вильсона уменьшение экскреции меди с желчью приводит к ее накоплению в гепатоцитах. Метод окрашивания основан на предположительном связывании роданина с некоторым количеством ионов меди, находящихся в лизосомах.

Поместить срезы в дистиллированную воду

Приготовить буферный раствор:

Вмензурку объемом 50 мл налить 40 мл дистиллированной воды, добавить 10 капель реактива А и 10 капель реактива В. Перемешать стеклянной палочкой.

Вдальнейшем полученный раствор использовать для промывки.

Приготовить раствор роданина:

В колбу объемом 50 мл налить 40 мл дистиллированной воды, добавить 20 капель реактива С. Поместить образцы в полученный раствор и инкубировать при 37°С в течение 20 часов. Промыть образцы в полученном буферном растворе (см. выше) трижды, каждый раз меняя раствор.

На образец нанести 10 капель реактива D, оставить на 5 минут. Промыть образцы в полученном буферном растворе (см. выше) трижды, каждый раз меняя раствор.

Дегидратировать образцы в спиртах восходящей концентрации; просветлить в ксилоле и заключить под покровное стекло.

Результаты

Скопления меди	оранжево-красные
Ядра клеток	синие

16

04-100802

Окраска по Граму

(для срезов)

Срок годности: 2 года Хранить при температуре 15-25°С

Реактивы

А. Раствор флоксина В, 100 мл В. Раствор кристаллического

фиолетового, 30 мл

C.Раствор Люголя, 30 мл

D.Ацетон-Лимонен, 100 мл Е. Ацетон-Лимонен, 100 мл

Бедренная артерия

Применение

Дифференциация грамположительных и грамотрицательных бактерий в тканевых образцах и мазках.

Окрашивание по Граму представляет собой один из важнейших методов дифференцировки различных видов бактерий. В данном случае последовательно используются два красителя: кристаллический фиолетовый и фуксин. Кристаллический фиолетовый преципитирует при взаимодействии с раствором йода (реакция восстановления). Полученный комплекс взаимодействует с бактериальной стенкой с образованием связей. Под воздействием дифференцирующего раствора происходит разрушение этих связей у одних (грамположительные) и сохранение у других (грамотрицательные). Последние, впоследствии окрашиваются в красный цвет. Способность грамположительных бактерий удерживать краситель объясняется наличием в их стенке молекулы рибонуклеата магния, образующей связь с кристаллическим фиолетовым

Описание метода

Поместить срезы в дистиллированную воду.

Вылить в колбу реактив А, поместить туда препарат и инкубировать при 56-58°С на 15 мин; использованный реактив перелить в исходную упаковку через фильтровальную бумагу

Промыть срезы в дистиллированной воде.

Нанести на срез 10 капель реактива В, оставить на 3 мин.

Слить избыток реагента и нанести на срез 10 капель реактива С, оставить на 3 мин.

Промыть срезы в дистиллированной воде и просушить фильтровальной бумагой, затем просушить на воздухе в течение 10 мин.

Слить избыток реагента, вылить в сосуд Коплина реактив D, поместить туда препарат на 1 мин, периодически перемешивая, перелить раствор обратно в сосуд, предварительно профильтровав.

Повторить предыдущий шаг с реактивом Е.

Просветлить в ксилоле и заключить под покровное стекло.

Результаты

Грамположительные бактерии	синий
Грамотрицательные бактерии	красный
Ядра	красный

17

04-100803

Окраска по Граму

(для мазков)

Срок годности: 2 года Хранить при температуре 15-25°С

Реактивы

А. Раствор кристаллического фиолетового по Хакеру 500 мл

В. Раствор Люголя 500 мл

C.Обесцвечивающий раствор 2х500 мл

D.Раствор сафранина 500 мл

Применение

Дифференциация грамположительных и грамотрицательных бактерий в фиксированных мазках. Метод основан на способности грамположительных бактерий и дрожжевых клеток удерживать кристаллический фиолетовый и окрашиваться в синий цвет. Грамотрицательные бактерии теряют окрашивание при обесцвечивании и окрашиваются в розовый цвет сафранином.

Описание метода

Фиксировать просушенные на воздухе мазки с использованием следующих методов:

-2 -3 раза провести предметное стекло через слабое пламя, затем остудить при комнатной температуре,

-погрузить образцы в абсолютный метанол на 1-2 мин, затем промыть дистиллированной водой.

Нанести на мазки реактив А., оставить на 1 мин. Просушить мазки и быстро провести через реактив В. Поместить мазки в реактив В, оставить на 1 мин. Промыть в дистиллированной воде.

Поместить мазки в реактив С, оставить на 1 мин. Промыть в дистиллированной воде.

Поместить мазки в реактив D, оставить на 1 мин. Промыть в дистиллированной воде.

Просушить препараты на воздухе.

Результаты

Грамположительные бактерии и дрожжевые клетки	сине-фиолетовый
Грамотрицательные бактерии	красно-оранжевый

18

04-090803

Гимза для определения Helicobacter Pylori

Срок годности: 2 года Хранить при температуре 20-25°С

Реактивы

А. Модифицированный раствор Гимза, 150 мл

В. Ацетатный буфер, 150 мл С. Дифференцирующий реактив, 150 мл

D.Дегидратирующий реактив, 150 мл

E.Дегидратирующий реактив, 150 мл

Слизистая оболочка желудка

Применение

Выявление Helicobacter Pylori в образцах биопсии слизистой желудка. Для идентификации бактерий необходимы доскональное соблюдение методики окрашивания и тщательная дифференциация

Описание метода

Депарафинизировать срезы и поместить в дистиллированную воду.

Приготовление буферного раствора:

Растворить реактив В в дистиллированной воде 1:10; Использовать полученный раствор для приготовления рабочего раствора Гимза.

Приготовление рабочего раствора Гимза:

Смешать 10 мл реактива А и 30 мл приготовленного ранее буферного раствора.

Поместить препараты в рабочий раствор на 30 мин

Просушить мазки (не промывать) и поместить на 15 сек в реактив С. Повторить предыдущий пункт, используя реактивы D и Е. Просветлить в ксилоле и заключить под покровное стекло.

Результаты

Helicobacter Pylori	синие в форме крыльев чайки
Ядра	синие
Цитоплазма	розовая

19

04-150805

Гиалуронидаза из бычьего семенника

Срок годности: 3 месяца Хранить при температуре 4°С

Реактивы

А. Фосфатный буфер, 100мл В. Гиалуронидаза, 0,05 мг С. Фосфатный буфер, 100 мл

Применение

Применяется для удаления из тканевых срезов гиалуроновой кислоты и хондроитин сульфата А и В

Описание метода

Поместить 2 серийных среза в дистиллированную воду ( исследуемый и контрольный).

Приготовить раствор гиалуронидазы: пересыпать содержимое из флакона В во флакон А (мы советуем оставить часть фосфатного буфера из флакона A, чтобы промыть флакон B и соб рать остатки его содержимого).

Перелить раствор в колбу и поместить исследуемый образец.

Перелить раствор из флакона C в колбу и поместить туда контрольный срез.

Инкубировать оба препарата в течение 1 часа при температуре 37°С.

Промыть оба препарата в проточной воде в течение 5 минут. Окрасить Альциановым синим.

Результаты

В случае присутствия гиалуроновой кислоты или хондроитин сульфата окраска альциановым синим отсутствует.

20