Meditsinskaya_genetika_glava_4

уникальные. Все эти особенности участков генома являются их важной характеристикой, которую учитывают при их функциональном анализе.

Генная инженерия

Клонирование генов

Ген в составе двухцепочечной молекулы ДНК, в отличии от кодируемого им белка, не представляет собой дискретную единицу и его нельзя выделить методами очистки белковых молекул. Открытие рестрицирующих нуклеаз (рестриктаз), способных разрезать двойную спираль ДНК по специфической последовательности из 4-8 нуклеотидов на фрагменты строго определённого размера, решило задачу очистки гена из смеси ДНК. В настоящее время известны сотни рестриктаз, распознающие разные места разрыва ДНК (сайты рестрикции). Ещё одно полезное свойство рестриктаз для генной инженерии заключается в том, что ферменты вызывают ступенчатые разрывы, в результате чего на концах фрагментов ДНК образуются короткие одноцепочечные «липкие хвосты». Эти «липкие хвосты» способны комплементарно связываться с подобными «липкими хвостами», образовавшимися под действием того же фермента. Благодаря «липким хвостам» можно присоединить фрагмент ДНК, содержащий гены человека, к ДНК вируса. Если полученную рекомбинантную молекулу ДНК ввести в бактериальную клетку, то за счёт репликационной активности вируса за короткое время можно получить (клонировать) миллионы молекул вирусной ДНК, содержащей гены человека. Методы клонирования позволяют получать интересующую ДНК в достаточном количестве для последующего анализа.

В генной инженерии для клонирования генов широко применяются плазмиды — двухцепочечные кольцевые молекулы ДНК, сосуществующие вместе с микробной клеткой (рис. 4). Плазмидный геном обеспечивает устойчивость бактерий к тяжёлым металлам, антибиотикам, УФ-излучению, а также синтез гемолизинов, токсинов, белков, обеспечивающих адгезию бактерий к клеткам животных и человека.

Рис. 4. Бактериальная клетка. 1. Хромосомная ДНК. 2. Плазмидная ДНК [из http://ru.wikipedia.org].

Клонирование генов начинают с получения плазмидного вектора (рис. 5). Для этого плазмидную ДНК и хромосомную ДНК обрабатывают одной из рестриктаз. Далее в присутствии ДНК-лигазы «липкие хвосты» линейных фрагментов плазмидной и клеточной ДНК ковалентно сшиваются с образованием рекомбинантных кольцевых молекул ДНК. Полученные плазмидные вектора вводят (трансфицируют) в бактериальные клетки. Вместе с растущими бактериальными колониями реплицируется и плазмидная ДНК, в результате чего получается множество копий (клонов) рекомбинантной ДНК. Клоны бактерий с плазмидным вектором, созданным на основе плазмиды устойчивой к антибиотику, можно отделить от других колоний бактерий, если выращивать бактерии в

присутствии антибиотиков. Выживут и образуют колонии только те бактерии, в которых присутствует плазмидный вектор.

Рис. 5. Клонирование рекомбинантной ДНК. Объяснение в тексте [по www.accessexcellence.org/AB/GG/plasmid.html].

Методы генной инженерии, когда в бактериальную клетку с помощью плазмиды вводят кДНК человека, позволили с помощью микробного биосинтеза получать белки человека, в том числе гормоны (инсулин, гормон роста, глюкагон, паратиреоидный гормон, кальцитонин), факторы свертывания крови (фактор VIII, IX и тканевой активатор плазминогена), белки иммунной защиты (бета-интерферон, гамма-интерферон, альфаинтерферон, интерлейкин 2), эритропоэтин и др.

Библиотека комплементарной ДНК

Как уже говорилось, из-за огромных размеров генома и соответствующей массы невозможно работать молекулой ДНК напрямую. Один из подходов к «урощению» объекта это создание геномной библиотеки, когда геномную ДНК расщепляют с помощью рестриктаз, а затем клонируют в подходящий вектор. После трасформацаии бактерий

такой смеси клонов получаются милионы бактерий которые несут в себе плазмиду с фрагментом ДНК. Плазмиды одной колонии содержат один клон геномной ДНК, совокупность всех плазмидных клонов представляет собой библиотеку геномной ДНК.

Клоны могут содержать целые гены, части генов или некодирующую ДНК. Такой подход создания геномных библиотек назвали методом дробовика».

Более удобной для работы считается библиотека комплементарной ДНК, которую получают на основе выделенной из клетки мРНК. С помощью обратной транскриптазы с матрицы мРНК получают комплементарные ДНК (кДНК). Далее одноцепочечные молекулы кДНК под действием ДНК-полимеразы превращают в двухцепочечные молекулы, которые включают в плазмиды и образуют клоны. Каждый клон рекомбинантной ДНК соответствует отдельной мРНК, а все вместе представляют библиотеку комплементарной ДНК. В отличии от геномной ДНК библиотеки, представляющей выборку всех нуклеотидных последовательностей генома данного организма, кДНК библиотека содержит лишь те участки генома, с которых синтезируются мРНК. Поскольку в разных клетках к экспрессии разрешены определённые гены, то и кДНК библиотека этих клеток будут отличаться.

Генетически модифицированные организмы

Генетически модифицированный организм (ГМО) — живой организм, генотип которого изменён в научных, медицинских или хозяйственных целях. В отличие от естественной изменчивости, возникающей в ходе эволюции, искусственная генетическая модификация отличается целенаправленным изменением генотипа организма.

Растения

С помощью генной инженерии создаются новые сорта растений, обладающие лучшими ростовыми и вкусовыми качествами, устойчивые к неблагоприятным условиям среды (мороз, засуха), вредителям, гербецидам. В России по состоянию на 2008 год для использования в пищу одобрены следующие генетически модифицированные растения:

•Соя . Линия 40-3-2, Линия А 2704-12, Линия А 5547-127.

•Картофель. Сорт Russet Burbank Newleaf, Сорт Superior Newleaf, «Елизавета 2904/1 kgs» «Луговской 1210 amk».

•Кукуруза. Линия GA 21, Линия Т-25, Линия NK-603, Линия MON 863, Линия MON 88017, Линия MIR 604, Линия Bt 11.

•Рис. Линия LL 62.

•Сахарная свекла. Линия H7-1.

Животные Модели болезней человека

Мышь относится к наиболее изученному млекопитающему. Поэтому мыши, полученные с помощью генной инженерии, являются удобной биологической моделью для изучения механизмов патогенеза заболеваний, связанных с мутацией известного гена, а также разработки методов лечения заболевания, вызванного мутацией данного гена.

•Болезнь Альцгеймера. Мыши Psen1tm1Tak экспрессируют мутантный белок пресенилин 1 (PS1). Мыши APPSWE (2576) экспрессируют трансген, кодирующий предшественник бета-амилоидного белка человека.

•Болезнь Хантингтона. Мыши R6/2; мутированный HD содержит >150 повторов CAG кодонов, характеризуются гибелью нервных клеток в базальных ганглиях, особенно в хвостатом ядре и скорлупе.

•Спиномозжечковая атаксия. У SCA1 мышей избыточная экспрессия мутированного гена ATX1 (атаксин 1) вызывает дегенерацию клеток Пуркинье и нейронов ствола мозга.

•Боковой амиотрофический склероз. Трансгенные мыши G93A, экспрессирующие мутантный SOD1 (Gly93→Ala; глицин замещён на аланин в позиции 93), характеризуются прогрессирующей дегенерацией мотонейронов, как при боковом амиотрофическом склерозе человека.

Биореакторы

В 2010 году «ТРАНСГЕНФАРМ» (российско-белорусский проект «Рогатый биореактор» по созданию генетически модифицированных коз) начал выпуск лактоферрина. В США из молока трансгенных коз получен лекарственный препарат антитромбин-3.

Практические навыки 1. Виртуальная лаборатория. Определение первичной

нуклеотидной последовательности ДНК (секвенирование)

Введение

К настоящему времени предложен целый спектр методов и технологических подходов, направленных на определение нуклеотидной последовательности ДНК (пиросеквенирование, полупроводниковое секвенироване, секвенирование на основе лигирования и др.). Исторически первыми, они же классическими, являются методы, разработанные Максам-Гилбертом (метод химической деградации) и Сэнгером (ферментативного секвенирования – плюс-минус метод и метод терминирующих аналогов трифосфатов) (рис. 6). В обычной рутинной практике до сих пор (однако, все реже и реже) применяется модифицированный метод терминирующих аналогов трифосфатов, его также часто обозначают как метод "терминаторов". В основе данного метода лежал процесс ферментативного копирования комплементарной цепи ДНК по существующей матрице.

Ключевыми компонентами данного процесса являются:

праймеры (затравки) короткие синтетические олигонуклеотиды строго комплементарные определенному участку ДНК матрицы;

фрагмент Кленова ДНК полимеразы I, фермент, выделенный из E.coli, осуществлял синтез олигонуклеотидной цепи ДНК;

2',3'-дидезоксинуклеозидтрифосфаты (ddATP, ddTTP, ddCTP, ddGTP - ddNTP),

способны включаться в растущую цепь ДНК, но не способны обеспечивать дальнейшее копирование полинуклеотидной цепи из-за отсутствия 3'-ОН группы, что приводит к специфической терминации синтеза комплементраной цепи;

2'-дезоксинуклеотид-5'-трифосфаты, (dATP, dTTP, dCTP, dGTP - dNTP) способны включаться в растущую цепь ДНК, и тем самым обеспечивать дальнейшее копирование (синтез) полинуклеотидной цепи. Соотношение концентраций dNTP/ddNTP подбирается эмпирически, для того чтобы получить набор копий ДНК различной длины. При этом один dNTP был радиоактивно мечен по альфа положению фосфата;

Реакционный буфер содержащий ионы Mg2+ необходим для протекания ферментативной реакции в процессе присоединения нуклеотидов к полинуклеотидной молекуле ДНК.

Для определения первичной структуры исследуемого фрагмента ДНК выполняют четыре независимые реакции копирования с добавлением определенного типа терминатора (ddATP, ddTTP, ddCTP или ddGTP). Образуемые фрагменты содержат константный 5'- конец и гетерогенный (отличающийся по длине) 3'-конец. После этого полученные

продукты реакции подвергают денатурации с образованием одноцепочечных радиоактивно меченых фрагментов. Фрагменты разгоняют по длине под действием высоковольтного электрического поля в полиакриламидном геле высокого разрешения (позволяет разделить фрагменты ДНК, отличающиеся всего на один нуклеотид) на соседних дорожках. После завершения этапа разделения гель экспонируют на рентгеновскую пленку, с которой и проводят считывание снизу вверх последовательности нуклеотидов в исследуемой молекуле ДНК.

В настоящее время процесс определения нуклеотидной последовательности полностью автоматизирован. Первый автоматический, коммерчески доступный, ДНК-секвенатор создан фирмой Applied Biosystems (США) в 1987 г. В основе его работы лежит принцип, предложенный Сэнгером (метод "терминаторов"). Данный подход предполагает капиллярное гель-электрофоретическое разделение фрагментов ДНК в составе линейного полиакриламида. Применение конъюгированных с флуоресцентной меткой 2',3'- дидезоксинуклеозидтрифосфатов, специфически терминирующих реакцию секвенирования позволяет проводить анализ в одной пробирке. Последующую детекцию флуоресценции осуществляют в режиме реального времени путем возбуждения молекул красителя лазерным лучом на ДНК-секвенаторе. Управление, сбор и анализ полученной информации проводиться специально разработанными компьютерными программами. Результатом секвенирования является хроматограмма в которой последовательности разноцветных пиков, соответствуют четырём нуклеотидам. Применение систем автоматического секвенирования значительно ускорило процесс определения нуклеотидной последовательности, что привело к расшифровки геномов многих организмов, включая и геном человека.

Рис.

6.

Схема

процесса

секвенирования

по

Сэнгеру

[из

http://molbiol.ru/protocol/13_03.html].

Протокол автоматичекого секвенирования

Забор и подготовка материала для исследования, направлен на максимальное сохранение целостности ДНК. На практике в качестве источника образца используют клеточный (кровь) и тканевой материал, различные микроорганизмы, вирусы искусственные генетические системы (плазмидные вектора). Отобранный материал хранится до анализа в холодильниках при температуре от -20 до -80оС, либо криозаморозка (жидкий азот −195,75оС), при этом стоит избегать повторных циклов оттаивания-замораживания для исключения возможности деградации молекул ДНК.

Выделение ДНК, заключается в разрушение клеточной стенки, ядра, удаления клеточных ингибиторов, инактивации ДНКаз (ферменты разрушающие молекулу ДНК). Разрушение молекул РНК (РНКаза А), очистка от белковых (протеиназа К) и липидных (липаза) компонентов клетки.

Постановка ассиметричной ПЦР-амплификации в присутствии флуоресцентно меченых терминирующих нуклеотидов. Компоненты реакционной смеси для ПЦР-

стадии реакции секвенирования состоят из одного специфического праймера, буфера для ПЦР амплификации, флуоресцентно меченых терминирующих нуклеотидов, ДНКматрицы и полимеразы. Реакцию амплификации проводят с использованием термоциклера (ПЦР-амплификатора).

Очистка фрагментов ПЦР-амплификации. После этапа амплификации реакционную смесь осаждают центрифугированием, ампликоны отмывают, растворяют в Hi-Di формамиде и проводят этап крактковременного нагревания смеси до 95°С.

Загрузка образцов в генетический анализатор (секвенатор), например ABI 310 PRISM DNA Sequencer, где происходит капиллярный гель-электрофорез фрагментов ПЦРамплификации и многоцветное детектирование флуоресценции. Итогом данного процесса является хроматограмма отображающая последовательность нуклеотидов в анализируемом образце. Сбор данных обеспечивается программным пакетом Data Collection Software (Applied Biosystems).

Интерпретация результатов. Результаты хроматограмм секвенирования обрабатываются с применением специализированного программного пакета, например Applied Biosystems Sequence Scanner Software v1.0 SequenceTrace Viewer and Editor (Applied Biosystems), используется для работы с базами данных при сравнительном секвенировании и анализе различных мутаций, Variant Reporter Software используется для анализа мутаций, GeneMapper ID-X Software используется для криминалистических и судебно-медицинских исследований.

Идентификация новой мутации гена рецептора рианодина RyR2.

Проведено определение нуклеотидной последовательности участка гена рецептора рианодина RyR2 с использованием технологии автоматического секвенирования (рис. 7). В результате анализа установлено замена нуклеотида цитозин на тимин в 46 экзоне, результатом чего является изменение аминокислотного состава синтезируемого белка, замена аминокислоты фенилаланин (2331) на серин. Замена нуклеотида гуанин на тимин в экзоне 47 приводит к замене аминокислоты аргинин (2401) на лейцин. Замена нуклеотида тимин на цитозин в 14 экзоне приводит к замене аминокислоты аргинин (414) на цистеин. Все изменения являются миссенс–мутациями в гене RyR2 и часто встречаются при адренергической полиморфной желудочковой тахикардии.

С

Т

T

G

C

T

Рис. 7. Хромотограммы секвенирования гена рецептора рианодина RyR2. Изменение

в нуклеотидной последовательности гена рецептора рианодина RyR2. A- цитозин заменен на тимин (Ц→Т), как результат точковая мутация синтезируемого белкового продукта замена аминокислоты фенилаланин на серин (Фен→Сер). В - гуанин заменен на тимин (Г→Т) точковая мутация замена аминокислоты аргинин на лейцин (Арг-Лей). С - тимин заменен на цитозин (Т→Ц), точечная мутация замена аминокислоты аргинин на цистеин (Арг→Цис) [Wendy Creighton и др., 2006].

2. Биоинформатический анализ фрагмента ДНК с помощью базы данных NCBI. Установление функциональной значимости и гомологичности целевой ДНК.

1. Данную нуклеотидную последовательность загрузить в окно для анализа программы BLAST

(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK _LOC=blasthome)

2.Выбрать базу данных «Human genomic + transcript»

3.Проанализировать полученные данные.

4.Выбрать базу данных «Expressed sequence tags (est)»

5.Проанализировать полученные данные.

6.Определить организм, ген, дать характеристику данной последовательности. Рассказать о функциях гена (Gene), его исследованиях (PubMed).

Нуклеотидная последовательность 1.

CCCCACCCCCTTCCTAAAGCCACCCCCGGCAGCAGCCCGCCCCGAGCGCG CCGCCTGTTTATTCAGCCGGGAGTCCGGCACGCGCCAGGCGCACGCACTG CAACAACAAACCCAGCTGAATGGAGAGTTTGCAAGGAGCGGGAGAAAGGA ACGGGAGGGGGGGAGAGGAGAGGAGGAGGGGGAGTTTAGGGAGTGGGTGG GAGGAAGAGGTAAGAGGAGGGGGGGGAGTGGGGGCTGCAGCCGCTCGCTG CAGCAGCGGGGAGTGGGGGGCGAGGCGGGGCCAGGGCTGCGCGTGGGGCT GGGTGTCCCATTGAAAAGGCGGACGCACTCCGGCAGCCCAGCACTCTCTC ACTTCTGGCCAGGGAACGTGGAAGGCGCACCGACAGGGATCCGGCCAGGG AGGGCGAGTGAAAGAAGGAAATCAGAAAGGAAGGGAGTTAACAAAATAAT AAAAACAGCCTGAGCCACGGCTGGAGAGACCGAGACCCGGCGCAAGAGAG CGCAGCCTTAGTAGGAGAGGAACGCGAGACGCGGCAGAGCGCGTTCAGCA CTGACTTTTGCTGCTGCTTCTGCTTTTTTTTTTCTTAGAAACAAGAAGGC GCCAGCGGCAGCCTCACACGCGAGCGCCACGCGAGGCTCCCGAAGCCAAC CCGCGAAGGGAGGAGGG

Нуклеотидная последовательность 2.

CCCCCCTGGCTCCTTCCCAGCCTGGGCATCCTTGAGTTCCAAGGCCTCAT TCAGCTCTCGGAACATCTCGAAGCGCTCACGCCCACGGATCTGCAGCAAC AGAGGAGGGGGAGAAGTAAGTATATACACAGTACCTGAGTTAAAAGATGG TTCAAGTTACAATTGTTTGACTTTATGACGGTACAAAAGCAACATGCATT TAGTAGAAACTGCACTTCAAGTACCTATACAGCTGACTTTTAAAAATAT

Нуклеотидная последовательность 3.

GCTCAACTTGCAGTTGTCCTAGTCCTGAGTCTTGTCTTAGCCAAAGACTG TTGTTGGAAAGCCCACACAAAGGCCTTGTGTATAGGATGCCCTACTATTA AAGGAGCATGTTCTAGTCTCAGTGGATTAAATTTGCTTTGGTGTGCATTC CCTTACCAAATTTCTCACTACTTTGTTTGGCTGGTTATTTCAGTGAAAAA TCATTTTAACGTGAAGGCAGATTTCTTCTAATTATTACATAGTCCTAGTG GTGACGGTTATTGGAGTAAAATAATTTTTTTTTTTTCTGGTAGGATGTGA TGGAGCTGCTTGAAGAAGATCTCACATGCCCTATTTGTTGTAGTCTGTTT GATGATCCACGGGTTTTGCCTTGCTCCCACAACTTCTGCAAAAAATGCTT AGAAGGTATCTTAGAAGGGAGTGTGCGGAATTCCTTGTGGAGACCAGCTC CATTCAAGTGTCCTACATGCCGTAAGGAAACTTCAGCTACTGGAATTAAT AGCCTGCAGGTTAATTACTCCCTGAAGGGTATTGTGGAAA

Нуклеотидная последовательность 4.

TCCAGCCTAGGCAGCAGGGTGGCTCACACAGCACTTTCACATCCTGCCCC CTGCCTCCACGAGGCTACACTGCTATGCTGGTCAAAGGAAAAACAGGTTA CCAAATACATGCACGTCGGAGTCTGATTTTTCAGTTTTTCAGATTACCTG GATTCAGGGTATTTGGTGAGGGTGGCCAGGCTGCTGGTGTACATGTGGCC GCCCACATCAATGTGGACAGGCGCATTGGATTTTGTGAGTTGTGCTGGAG TAGGGATGCCTTGGTTGTTCAGTGGAGATGCAGGGGATCTAGTGATCAGA GGTCTTGACATATTGGGCCGACTGTCCTACAGAGAGATAAGCAAGTTTAG ATACTTTTTCTCTTTACAGTAGAAAGATAGGAAATACATATAGCATAAAG AATAAACGAGTGATTAACGATACTCATTCAGTAATAAAACCTGAAAAACC GGCAAGCTCTTGCTTTTGTTATAATGAATATCAGAAAAACCAATTCTGTA GCAAAGAAAAGGAAATCTTCACATGCTCAGAAATAAGG

Нуклеотидная последовательность 5.

TTTTAAAAAAAAGATCATTATTAATTTCCTTGGAAATTAAGCATACCAGC TCCTTCCAGAATAATCAAGGAGCATCCACCAACCAGCAGGACTGACCTGT TTTGGGAGGGTTTCTTTTGACTTTCATCCAGTCAAAAGTCTGCGCTGGAG AAGATGTCTCCGATGCGGGGGAGCGACAGGCTTCTTGGTGGCTGGCGTGG AGAGGGGACAAGGAGTTATTATACGTAGCCAGGGCCAGGCTCTGGTGCTC

Нуклеотидная последовательность 6.

TGGGATTGGCAGTCGCCTGCCCCACACGGAAGCAGAGGTGGACGCAACGG CCCTGCAGCAGCACCTGCCCCAGCCGGGCACAGGCTCCACTTCCGGCCAG GTGCGCTCACCTGGAGTAGTCGCTCTGCACCTCCAGGGTCCGGGTATCCA GCAGCAGGCCGCACCAGGGGAATAGGCCGTGGGCCGGCATCTGAACAAAA GCCGTGCCACCCAGGGCCTCGTCTTCTACAGGGAAGTTCACCACTGTCTT CCGCAAGTTCACCACGCAGCCATACTCAGGGACACCTCGGACCAGGGTCC TAAGGCAGAGGGGCAATGTCAGCCCCAGGATGCGGGGCCGTCACCCAGGA GGTAACCTGACACCCTTGTTAAATGCTTTGGAAAACCCCAGAGAAG

Нуклеотидная последовательность 7.

TCCAGAAGGCTGGAGTGCTGTGGCAGGGATGACGTCTCACTTCTGTTATG TCTCTGTGCCCTGTGCTCTCCCAGGATGAGGGGCATGAAGCTGCTGGGGG CGCTGCTGGCACTGGCGGCCCTACTGCAGGGGGCCGTGTCCCTGAAGATC GCAGCCTTCAACATCCAGACATTTGGGGAGACCAAGATGTCCAATGCCAC CCTCGTCAGCTACATTGTGCAGGTGAGGCCAGGGCAGCCTCCCCCCAAAA GCAGAGGAGCTCTGGAGTCTAGGGCTGGTGGGCAGGGCCAGCCCTATGGA GCCACAGGGTGTCGGGTGTGGGGTACTGAGCACCACTGCTCCC

Нуклеотидная последовательность 8.

TCCAACTCCAGTTCGGGGAACTGTATGTAGCTAGGTCACTATTCCCTAGT CCGTACATGATAATTTTCCTAATTTTCTATTAATCTAATAAATGGTGAAA TGATTTAATTTTCCTTGGGTTCTAAGGTGTCCACACGCAATCCATAAACT GTACCTCCATGATTTCATCCAGTGCAGATTTCTTTTTCTTCTTTTCTTTA GACTGAGTTGAGCTCTGGGAAGATTCTTTTCGTTTCACTGATGCTGAACT TCCTATCGTCTTCAGTGCACTCG

Нуклеотидная последовательность 9.

TATGTGTGTATATGTGTGTATGTATATATATAAAATGTATATAAATGCTG TAGGCTATATATATATACACACACACATATATGTGTGTGTGTATATATGT GTGTGTGTGTATATATATACATATCCACATATTCTTGCCCACATTCACAC AAAACAGCAAAAGAGAGAAACTTTAGCAGTTAAACAGAATCTTTTGGAAC ATAAAATGACCACAATAGAGAGCAGTTTTTGCATGCTGTAAATTTGCCAA GATGCCCACACACTGAAACTACCTCCCACTGCTGCCGCAAACTCCCTACC TGTGTAGCATAGGGCAAGCTTCTTCTTGCTGCACCTCTCATCATTCCACA TGCCCACATCTTTTTCTCTCTTGATGTAGATCTCCACGCAGTCCTCATCT TTTTGCCTATTGTTGGGTTCACCTGGAGCCCAGTTCTTGGCTTCTTCTGT CAGAGGTTTCTGGGTTCCTACCCAGACCCACACATTGTTGA

Нуклеотидная последовательность 10.

TTCCCTACCACAAACTCGCCGACCTGCGCTACCTGAGCCGCGGCGCCTCT GGCACTGTGTCGTCCGCCCGCCACGCAGACTGGCGCGTCCAGGTGGCCGT GAAGCACCTGCACATCCACACTCCGCTGCTCGACAGGTAGGCAGTCACTG GGGTTCCCTGGAAGAGCCCTCAACTCCTGCATCCCCTCAAGCCCCCTGAC AAGCGGGCTCTAGAGCCCAAATGGCAGTGACCGCTTGGGGCCGGCCTCAC CTCGTCACCTCTAGGGAGCCCTTCAAGCTTGGGAGATAGGGAGCACCCAC CCTTCAAGCTCTGGCACCGTAGGGAGCACAGGCTTCTCTGGAGATGCAGC AGTTGCATTCCTCCACACATCTCTCCATTACCCTTTCTCTCCTTCCCTCT TACTCCTAGGCGTTCTGG

Нуклеотидная последовательность 11.

GGCTTAGTGGCAGGCCCTGGTCCTCGCGCTGGCGCTCAGGGCTAAGCTGG GGCTCCTGCCCTCTGCTGCAGCCGACTCCTCTCTGTAGCCCCCCTCTGGG