Микробиология

41

организмов готовят в жидкой питательной среде. При работе с бактериями этот метод используется редко.

Препарат «отпечаток». Из агаризованной среды, на которой микроорганизмы растут сплошным газоном или в виде отдельных колоний, вырезают скальпелем небольшой кубик и переносят его на предметное стекло так, чтобы поверхность с микроорганизмами была обращена вверх. Затем к газону или к колонии прикладывают чистое покровное стекло, слегка надавливают на него петлей или пинцетом и тотчас же снимают, стараясь не сдвинуть в сторону. Полученный препарат помещают отпечатком вниз в каплю воды или метиленового синего (1:40) на предметное стекло. Отпечаток можно получить и на предметном стекле, если касаться поверхности колонии или газона предметным стеклом. Препарат «отпечаток» используют в основном при исследовании спороношения стрептомицетов.

Препарат «микрокультура» (или «агаровая пленка»). На тонкое, просте-

рилизованное и нагретое предметное стекло наносят стерильной нагретой пипеткой 0,2-0,3 мл горячей агаризованной питательной среды и распределяют по всей поверхности стекла. После застывания среды удаляют петлей лишний агар, оставляя два тонких участка пленки величиной с покровное стекло каждый. В центр квадратов бактериальной петлей или пипеткой наносят каплю жидкой культуры или суспензии клеток микроорганизма. Стекло помещают во влажную камеру (чашка Петри со слоем мокрой фильтровальной бумаги), которую ставят в термостат. Перед микроскопированием на пленку с выросшей микрокультурой наносят каплю красителя или каплю воды в случае подсыхания пленки и затем осторожно накрывают покровным стеклом.

Выращивание микроорганизмов непосредственно на предметном стекле позволяет вести микроскопическое наблюдение за процессами их роста и развития, изучать цикл развития, способ размножения (деление - почкование), влияние на эти процессы каких-либо агентов. На препаратах не нарушается естественное расположение клеток в растущей микроколонии. Выращивание микроколонии можно проводить в аэробных или анаэробных(под покровным стеклом, загерметизированным лаком) условиях.

Агаровую пленку можно нанести на покровное стекло и приготовить препарат «висячая капля». На таком препарате можно наблюдать движение бактерий по типу скольжения.

Препараты фиксированных окрашенных клеток микроорганизмов

Получение фиксированных окрашенных препаратов включает приготовле-

ние мазка, высушивание, фиксацию и окраску.

Приготовление мазка. На обезжиренное спиртом предметное стекло помещают маленькую каплю водопроводной воды и переносят в нее петлейне большое количество исследуемого материала, как для препарата«раздавленная капля». Полученную суспензию равномерно размазывают петлей на площади 1 - 2 см максимально тонким слоем. Мазок должен быть настолько тонок, чтобы быстро высыхал после приготовления.

42

Высушивание мазка лучше всего производить при комнатной температуре на воздухе. Хорошо приготовленный тонкий мазок высыхает очень быстро. Если высушивание происходит медленно, препарат можно слегка нагреть в струе теплого воздуха высоко над пламенем горелки, держа стекло мазком вверх. Эту операцию следует проводить осторожно, не перегревая мазок, иначе клетки микроорганизмов деформируются.

Фиксация препарата преследует несколько целей: убить микроорганизмы, т.е. сделать безопасным дальнейшее обращение с ними; обеспечить лучшее прилипание клеток к стеклу; сделать мазок более восприимчивым к окраске, так как мертвые клетки окрашиваются лучше, чем живые. Самым распространенным способом фиксации является термическая обработка. Для этого препарат обычно трижды проводят через наиболее горячую часть пламени горелки, держа предметное стекло мазком вверх. Не следует перегревать мазок, так как при этом происходят грубые изменения клеточных структур, а иногда и внешнего вида клеток, например их сморщивание. Для исследования тонкого строения клетки прибегают

кфиксации различными химическими веществами. Фиксирующую жидкость наливают на мазок, либо препарат на определенное время погружают в стакан с фиксирующим раствором.

Окраска. Клетки микроорганизмов окрашивают главным образом анилиновыми красителями. Различают кислые и основные красители. К кислым относятся красители, у которых красящими свойствами обладает анион, у основных красителей хромофором является катион. Примерами кислых красителей служат эозин, эритрозин, нигрозин, кислый фуксин; все они интенсивно связываются с цитоплазматическими компонентами клетки. Основные красители - метиленовый синий, основной фуксин, генциановый фиолетовый, кристалл-виолет, сафранин - интенсивнее связываются с ядерными компонентами клетки. Высокая концентрация ДНК и рибосомальной РНК в клетке бактерии делает ее более чувствительной

косновным красителям. В связи с этим в микробиологической практике применяются почти исключительно основные красители.

Различают простое и дифференциальное окрашивание микроорганизмов.

В первом случае прокрашивается вся клетка, так что становятся хорошо видны ее форма и размеры. Дифференциальное окрашивание выявляет только определенные структуры клетки и запасные вещества.

Для простого окрашивания клеток микроорганизмов чаще всего пользуются фуксином, генциановым фиолетовым, метиленовым синим. Фиксированный препарат помещают на параллельные стеклянные палочки, лежащие над лотком, наносят на него раствор красителя и выдерживают в нем в течение1 - 3 мин. Следят за тем, чтобы во время окрашивания краситель на мазке не подсыхал, и в случае необходимости добавляют новую порцию красителя.

По окончании окраски препарат промывают водой до тех пор, пока стекающая вода не станет бесцветной. Затем препарат высушивают на воздухе или осторожно промокают фильтровальной бумагой, помещают на окрашенный мазок каплю иммерсионного масла и просматривают с объективом 100 х. Для получения более чистых препаратов краситель наносят на мазок, покрытый фильтровальной бумагой. Метод окрашивания в модификации Синева позволяет использовать

43

вместо раствора красителя заранее пропитанную им фильтровальную бумагу. В правильно окрашенном и хорошо промытом препарате поле зрения светлое и чистое, окрашены только клетки.

Фиксировать и окрашивать можно также и препараты-«отпечатки». Фиксированные, окрашенные препараты могут храниться длительное время.

Форму клеток и их расположение(цепочки, розетки, пакеты, тетрады и т.д.) выявляют, как правило, на препаратах «раздавленная капля» при светлопольной или фазово-контрастной микроскопии. Для определения формы клеток мелких палочковидных бактерий, таких как Setratia marcescens, готовят препарат фиксированных клеток и применяют простое окрашивание. Клетки мелких бакте-

рий, имеющих выросты - простеки (роды Caulobacter, Labrys, Prosthecomicrobium, Stella и некоторые другие,), целесообразно исследовать методом фазового контраста или в темном поле. Естественное расположение клеток в колонии микроорга-

низмов, а также спор и спороносцев у актиномицетов и мицелиальных грибов изучают на препарате «отпечаток».

Необходимо помнить, что возраст культуры, состав среды и условия культивирования существенно влияют на морфологию и цитологию микроорганизмов.

44

Лабораторная работа № 1.4.

Методы стерилизации. Фильтрация. Типы фильтрующих материалов. Системы, используемые для фильтрации разных материалов.

Практическая работа по стерилизующей фильтрации

Цели занятия

·Познакомиться с основными типами фильтрующих материалов и фильтрационными системами, применяющимися в микробиологической практике.

·Уметь собрать лабораторную установку для оценки фильтрующей способности материалов при разделении биологических дисперсных систем.

·Ознакомиться с устройством и порядком работы установки стерилизующей фильтрации жидкостей с модулями АР-0,2.

Оборудование и материалы

1.Образцы фильтрующих материалов.

2.Фильтрационная лабораторная установка.

3.Установка для стерилизации жидкостей в микробиологической практике.

4.Материалы (вата, марля, шпагат, мембраны для фильтрации).

5.Вакуумный насос.

Вопросы и задания для самоподготовки

1.Фильтрование, фильтрат.

2.Фильтрационный процесс и области его применения.

3.Выбор фильтра.

4.Скорость фильтрации – основная характеристика процесса.

5.Фильтр, основные фильтрующие материалы для дисперсных систем.

6.Фильтры для очистки воздуха.

7.Требования, которые необходимо соблюдать при выполнении процесса фильтрации дисперсных систем.

8.Состав аппаратурно-технологической схемы мембранной стерилизации.

9.Порядок работы установки стерилизующей фильтрации жидкостей с модулями АР-0,2.

10.Устройство лабораторной установки получения стерильных растворов.

11.Перечислить наименования основных фильтрующих материалов согласно уменьшению размера пор.

12.Фильтры Шамберлана, Беркефельда, Мандлера.

13.Фильтры Крамера, пластинки Зейтца.

14.Дезинфицирующие растворы, используемые в процессах мембранной стерилизации.

Общие сведения Фильтрование (син. фильтрация) - процесс механического разделения

жидких или газообразных дисперсных систем с помощью пористых перегородок, способных пропускать дисперсионную среду и задерживать частицы, размеры которых превышают диаметр пор перегородки. Фильтрование широко используется

45

в санитарно-гигиенических, биохимических, микробиологических и клиникодиагностических лабораториях, в фармакологической, пищевой и других отраслях промышленности.

Прошедшую через фильтровальную перегородкуфильтр - жидкость называют фильтратом. Для ускорения Фильтрации создают перепад давления между разными сторонами фильтра, проводя процесс под повышенным давлением, при высоком разрежении или в центрифуге. Выбор фильтра и способа фильтрации определяется размером и формой частиц дисперсной фазы или природой дисперсионной среды. Фильтруемый образец не должен вступать в хим. реакцию с материалом фильтра, летучие жидкости нельзя фильтровать в вакууме; вязкие жидкости фильтруют под давлением или при повышенной температуре для уменьшения вязкости. При отделении твердых веществ, имеющих низкую температуру плавления, фильтрацию проводят при охлаждении.

Скорость фильтрации зависит от плотности фильтра и величины фильтрующей поверхности и определяется фильтрующей способностью, т.е. количеством жидкости (или газа) в мл, проходящей в 1 с через 1 см2 фильтрующей поверхности при перепаде (градиенте) давления в 1 см вод. ст.

Фильтры - устройства, предназначенные для отделения примесей или разделения смесей веществ, находящихся в различных агрегатных состояниях, имеющих разную степень дисперсности и электрозаряженности.

Основным элементом любого фильтра является фильтрующий материал, в качестве которого используют металлические сетки, ткани, песок, антрацитовую крошку, керамзит, дробленые шлаки, активированный уголь, силикагель, зерненую натронную известь, алюмосиликаты, ионообменные смолы и другие полимеры, воду, растворы кислот, щелочей, комплексообразователей (для задержки газообразных и парообразных веществ).

В зависимости от вида фильтрующего материала, агрегатного состояния и свойств компонентов фильтруемой смеси разделение на фильтрах осуществляется за счет механической задержки, процессов сорбции, в силу различия скоростей прохождения разных молекул через фильтрующую среду, ионного обмена или за счет потери энергии соответствующих волн. Прохождение фильтруемой смеси

через фильтрующую среду обеспечивается обычно различием барического или осмотического давления, разностью потенциалов или энергией волны.

Для очистки воздуха и других газов применяют тканевые, бумажные, масляные, угольные, известковые, гравийные, водяные (водяные завесы) фильтры, а также фильтры из искусственных полимерных материалов, например, ткань Петрянова.

При фильтрации необходимо соблюдать требования:

1.Подбирать размер пор фильтра соразмерно величине дисперсной фазы: чем меньше частицы, тем меньше должен быть фильтр, и наоборот.

2.Наблюдать за уровнем фильтра в воронке, который должен быть всегда ниже ее края.

3.Жидкость сливать на фильтр только при помощи стеклянной палочки, уровень жидкости не должен доходить на 3…5 мм до края фильтра.

46

4.Учесть термолабильность жидкости и оценить возможность ее подогрева с целью облегчения фильтрования.

5.При фильтрации каждую порцию жидкости добавлять только тогда, когда предыдущая порция уже стекла.

6.Для ускорения фильтрования применять воронки с удлиненным носиком, вакуум и воронку Бюхнера.

7.Перед фильтрацией фильтр смачивать в воронке той жидкостью, которая будет фильтроваться.

8.При фильтровании под вакуумом(с воронкой Бюхнера, воронкой с пористым стеклом) следить, чтобы в колбе Бунзена не собиралось слишком много фильтрата и чтобы он не доходил до отростка, соединяющего ее с вакуумным насосом.

9.При сборке лабораторной установки для фильтрования под вакуумом следует помещать предохранительную склянку между колбой Бунзена и вакуумным насосом.

10.При работе с фильтрами из прессованного стекла не забивать их так, чтобы потом их нельзя было промыть. Очищать фильтры из пористого стекла растворами щелочей нельзя.

47

Порядок изготовления и использования фильтра, защищающего органы дыхания при работе в микробиологической лаборатории (ватно-марлевая

повязка)

Задание: Изготовить и уметь использовать фильтр (ватно-марлевую повязку).

Последовательность выполнения задания

Фильтр (см. рис. 1) изготавливают следующим образом. Возьмите кусок марли длиной 100 см и шириной 50 см; в средней части куска на площади30x20 см положите ровный слой ваты толщиной примерно 2 см; свободные от ваты концы марли по всей длине куска с обеих сторон заверните, закрывая вату; концы марли (около 30-35 см) с обеих сторон посредине разрежьте ножницами, образуя две пары завязок; завязки закрепите стежками ниток (обшейте).

В случае наличия марли и отсутствия ваты, допускается изготовление марлевой повязки из марли. Для этого вместо ваты на середину куска марли положите 5-6 слоев марли.

Порядок использования фильтра. Ватно-марлевую (марлевую) повязку наложите на лицо так, чтобы нижний край ее закрывал низ подбородка, а верхний - доходил до глазных впадин, при этом хорошо должны закрываться рот и нос. Разрезанные концы повязки завяжите: нижние - на темени, верхние - на затылке. Неплотности, образовавшиеся между повязкой и лицом, заложите ватными тампонами.

Рисунок 1 – Ватно-марлевая повязка и ее изготовление

Получение стерильных растворов на лабораторной установке

Задание: Получить стерильную (дистиллированную воду, физиологический раствор) при помощи лабораторной установки.

48

Последовательность выполнения задания

Рисунок 2 – Лабораторная установка

Лабораторная установка (рис. 2) состоит из элементов:

1.Колба с отводной трубкой (колба Бунзена).

2.Воронка с впаянной пластинкой из пористого стекла.

3.Фильтрующая мембрана.

4.Стеклянный фильтр, набитый ватой с вакуумными резиновыми труб-

ками.

5.Соединительная резиновая трубка.

6.Предохранительная склянка (ставится при необходимости).

7.Вакуумный насос.

Подготовку лабораторной установки осуществляют следующим образом. На впаянную пластинку из пористого стекла воронки поместите мембрану(испытуемый образец фильтрующего материала), которую предварительно выдержите в дистиллированной воде в течение10 мин. На поверхность мембраны осторожно, пинцетом поместите небольшой слой хирургической ваты, смоченной в дистиллированной воде. Подготовленную таким образом воронку с мембраной установите вращающими движениями в горловину колбы с отростком. К последнему присоедините с помощью резиновой трубки стеклянный фильтр. Собранную установку простерилизуйте в автоклаве при температуре(120 ± 1)0С в течение 30 мин.

После стерилизации и охлаждения до комнатной температуры установка готова к работе. Непосредственно перед процессом стерилизующей фильтрации мембрану смочите той жидкостью(раствором), который будет фильтроваться. Далее установку подсоедините к предохранительной склянке, которую в свою очередь, к штуцеру вакуумного насоса. После создания разрежения в системе (0,15 ± 0,5) МПа приступите к подаче стерилизуемой жидкости. Удобнее это производить при помощи стеклянной палочки(пипетки). Палочку приложите к стакану, в котором находится жидкость(раствор), на расстоянии не более чем6…7 см от конца. Жидкости дайте стекать по палочке, направляя поток ее в середину

49

мембраны. При фильтрации, когда нужное разрешение будет достигнуто, резиновую трубку плотно зажмите пальцами, снимите ее со штуцера насоса(допускается использование зажимов), после чего оставьте жидкость фильтроваться до тех пор, пока скорость фильтрации не замедлится. Периодически колбу снова соединяйте с насосом для создания в ней вакуума. После прохождения всего раствора через мембрану из колбы с соблюдением правил асептики отберите пробу на микробиологическую чистоту. Фильтрат высейте по0,5 мл в пробирки со средой, разлитой по 4.5 мл. Посев инкубируйте при температуре (27 ± 2)0С в течение 2..3 суток.

Изучение устройства и порядка работы установки стерилизующей фильтрации жидкостей с модулями АР-0,2

Задания. Изучить устройство установки.

Собрать установку согласно аппаратурно-технологической схемы (рис. 4). Провести процесс стерилизующей фильтрации.

Выполнить химическую стерилизацию установки.

Последовательность выполнения задания Устройство установки. Основным элементом конструкции любой фильт-

рационной установки является разделительный аппарат.

Аппарат разделительный, фильтрующий элемент которого - полое волокно. Серийно выпускаемое волокно изготавливается из ароматического полиамида и отличается стабильностью своих характеристик, устойчивостью к воздействию различных химических веществ(перекись водорода, формалин, муравьиная кислота), не изменяет своих характеристик при работе с кислыми и щелочными растворами в зоне величин рН от 2 до 13 ед.рН.

Аппарат разделительный с поверхностью фильтрации0,2 м2. Разделительный элемент выполнен в виде пучка параллельно уложенных полых волокон с размером пор 0,2 мкм, герметизирован по торцам в корпусе аппарата, изготовленном из полиметилметакрилата марки Дакрил-4Б. В качестве герметика использован компаунд на основе эпоксидной мастики. В настоящее время проведены токсикологические испытания аппаратов типа АР и доказана возможность их применения для получения лекарственных препаратов.

Движение стерилизуемой жидкости обеспечивается перистальтическим насосом с производительностью до 60 дм3ч-1 по дистиллированной воде.

Перистальтический насос представляет собою цилиндрической формы камеру, в периферийной части которой расположена силиконовая трубка. В центре камеры размещена прямоугольной формы вращающаяся пластинка. На ее узких сторонах установлены подвижные цилиндры, сжимающие при вращении силиконовую трубку со стерилизуемой жидкостью.

Корпус установки изготовлен из нержавеющих трубок(Сталь Х18Н10Т), внутренняя полость которых отполирована. Установка является двухсекционной с последовательно вмонтированным с помощью стягивающих спиц съемными разделительными аппаратами АР-0,2.

50

С целью контроля гидродинамического воздействия на полые волокна, подающий стерилизуемую жидкость патрубок снабжен манометром(предел измерения давления 0,02 … 0,20 МПа). Аналогичный прибор установлен на отводящих коммуникациях.

Давление в системе регулируется дроссельным вентилем«шарикового» типа. Материальным каналом вентиля является силиконовая трубка. Металлический шарик, перемещаясь посредством резьбового соединения, сокращает рабочее сечение канала, изменяет величину давления в системе. Корпус вентиля выполнен из пластмассы.

На рисунке 3 показана конструкция мембранной установки.

Рисунок 3 - Мембранная установка

Состав аппаратурно-технологической схемы мембранной стерилиза-

ции жидкостей. Аппаратурно-технологическая схема (АТС) мембранной стерилизации жидкостей построена по циркуляционному типу, т.е. раствор по системе проходит многократно через два(или один) разделительных аппарата, соединенных между собою параллельно.

Для этого предусмотрен специальный контур с насосом. Подача свежего раствора в контур и создание в нем давления осуществляется перистальтическим насосом.

Порядок сборки установки. Аппараты разделительные АР-0,2 подсоедините к трубному каркасу установки. Манометры установите на линии входа и выхода исходного раствора, аналогично закрепите запорные вентили. Емкости для стерилизуемой жидкости с помощью силиконовых шлангов соедините со штуцерами рабочего контура установки, а также перистальтическим насосом. Проверьте правильность сбора установки по схеме (рисунок 4).