Журнал Ветеринария

	2014, № 7	А. Т. Куцан, А. Л. Оробченко, Д. Н. Хаммади
					Таблица 3
	Динамика содержания никеля в мышцах, костях и коже кур
		на протяжении эксперимента (42 суток) (М±m, n=5)
				Группы
	Исследуемые	Сроки
			Контроль	І (никель	ІІ (никель
	пробы	исследований	(фон никеля	25,0 мг/кг корма)	37,5 мг/кг корма)
			2,0 мг/кг корма)
		До начала введения	0,129±0,005	0,126±0,006	0,128±0,005
	Мышцы	Через 14 суток	0,131±0,022	0,120±0,041	0,135±0,026
		Через 28 суток	0,087±0,003	0,141±0,024*	0,140±0,029*
	(«красные»)
		Через 14 суток после	0,095±0,009	0,164±0,056*	0,158±0,026***
		прекращения
		До начала введения	1,321±0,220	1,310±0,210	1,318±0,120
	Кости	Через 14 суток	1,336±0,552	1,492±0,658	1,129±0,251
		Через 28 суток	0,900±0,390	1,189±0,391	0,997±0,557
	голени
		Через 14 суток после	1,133±0,204	0,928±0,204	1,243±0,469
		прекращения
		До начала введения	0,125±0,030	0,120±0,030	0,123±0,029
		Через 14 суток	0,126±0,026	0,199±0,047*	0,180±0,025*
	Кожа
		Через 28 суток	0,128±0,013	0,196±0,005**	0,181±0,042*
		Через 14 суток после	0,091±0,016	0,110±0,017	0,154±0,024**
		прекращения

Примечания: * – Р ≤ 0,05; ** – Р ≤ 0,01; *** – P < 0,001 – относительно контроля.

Составлено авторами на основе данных собственных исследований.

выше, чем во ІІ группе. Так, достоверное превышение содержания никеля в коже кур І опытной группы составляло 1,6 и 1,5 раза, а в коже кур ІІ опытной группы 1,4 раза соответственно на 14-е и 28-е сутки опыта, через 14 суток после прекращения введе- ния дихлорида никеля в І опытной группе наблюдали тенденцию к повышению, а во ІІ – достоверное превышение содержания металла в 1,7 раза (Р≤0,01).

Заключение. Таким образом, на ос- новании результатов исследования ток- сикокинетики никеля в органах и тканях кур-несушек после экспериментального суб- хронического отравления дихлоридом ме- талла можно сказать, что никель обладает как материальной (отмечено накоп­ление в органах и тканях кур в процессе 28-суточно- го поступления (минимум в сердце – 0,136± 0,007 мг/кг, максимум в поджелудочной железе – 0,969±0,050 мг/кг) и последующее перераспределение его в организме после прекращения введения препарата), так и функциональной (значительно большее ко- личество никеля выводится из организма

через желудочно-кишечный тракт – в содер- жимом толстого отдела кишечника обнару-

жено от 23,564±0,715 до 63,761±0,700 мг/кг никеля) кумуляцией.

При посмертной диагностике отравлений кур соединениями никеля как диагностиче- ский критерий можно использовать содер- жание металла в содержимом толстого отде- ла кишечника и его стенках.

Литература

1.Авцын А. П., Жаворонков А. А., Риш М. А.

идр. Микроэлементозы человека: этио­ логия, классификация, органопатоло-

гия. М.: Медицина, 1991. – 496 с.

2.Агеев В. Н. Кормление высокопродуктив- ных яйценоских кур М.: Колос. 1973. – 101 с.

3.Бандман А. Л., Волкова Н. В., ГреховаТ. Д.

идр. Вредные химические вещества. Не- органические соединения V–VІІІ групп: Справ. изд. Л.: Химия, 1989. – 592 с.

4.Войнар А. И. Биологическая роль микро- элементов в организме животных и чело- века. М.: Высшая школа, 1960. – 544 с.

Ветеринария, зоотехния и биотехнология

71

Зоотехния

№ 7, 2014

5.Вредные вещества в промышленности. Неорганические и элементоорганиче- ские соединения / под ред. Н. В. Лазаре- ва. Л.: Химия, 1977. – 608 с.

6.Грушко Я. М. Вредные неорганические соединения в промышленных сточных водах. Л.: Химия, 1979. – 160 с.

7.Доклинические исследования ветери- нарных лекарственных средств / под ред. И. Я. Коцюмбаса. Львов: Триада плюс, 2005. С. 104–105.

8.Копанев В. А. Роль социально-гигиени- ческих факторов в нарушении макро-

имикроэлементного статуса у детей школьного возраста в промышленном городе (Информационно-аналитический обзор). Новосибирск, 2001. 537 с.

9.Клиническая диагностика внутренних болезней животных / под. ред. В. И. Лев- ченко. Белая Церковь, 2004. – 608 с.

10.Малинин О. А., Куцан А. Т., Шевцова Г. Н.

идр.Определение неорганических элемен- тов в биологических субстратах методом рентгенофлуоресцентного анализа (мето- дические указания), утв. ГКВМУ Украины 23–24.12.2009, протокол № 1. 30 с.

11.Трахтенберг И. М., Колесников В. С., Лу-

ковенко В. П. Тяжелые металлы во внеш- ней среде: современные гигиенические и токсикологические аспекты. Минск.: На- вука і тэхніка, 1994. – 285 с.

12.Duffus J. H. Chemistry and human healt division clinical chemistry section, commission on toxicology «Heavy metals» a meaningless term? (IUPAC Technical Report). Pure Appl.

Chem., 2002. Vol. 74. No. 5, pp. 793–807.

References

1.Avtsyn A. P., Zhavoronkov A. A., Rish M. A.

еt all. (1991) Human microelementoses: eti- ology, classification, organopathology, p. 496.

2.Ageev V. N. (1973) Feeding high-egg laying chickens, p. 101.

3.Bandman A. L., Volkova N. V., Grek- hova T. D. еt all. (1989) Harmful chemi- cals. Inorganic compounds V–VIII groups,

p.592.

4.Wojnar A. I. (1960) Biological role of trace elements in the body of animals and humans, p. 544.

5.Harmful substances in the industry. Inorganic and organometallic compounds, 1977, p. 608.

6.Grushko Y. M. (1979) Harmful inorganic compounds in industrial wastewater,

p.160.

7.Preclinical studies of veterinary drugs (2005), pp. 104–105.

8.Kopanev V. A. (2001) Role of socio-hygienic factors in violation of macro-and trace element status of school children in the industrial city (Information-analytical review).

Novosibirsk. 537 р.

9.Clinical diagnosis of internal diseases of animals (2004), p. 608.

10.Malinin O. A., Kutsan A. T., Shevtso- va G. N. еt all. Determination of inorganic elements in biological substrates by X- ray fluorescence analysis (guidelines), ap- proved. GKVMU Ukraine 23–24.12.2009, protocol no 1, p. 30.

11.Trachtenberg I. M., Kolesnikov V. S., Lukovenko V. P. (1994) Heavy metals in the environment: the modern hygienic and toxicological aspects, p. 285.

12.Duffus J. H. (2002) Chemistry and human healt division clinical chemistry section, commission on toxicology «Heavy metals» a meaningless term? (IUPAC Technical

Report). Pure Appl. Chem. Vol. 74. No. 5,

pp.793–807.

72	Ветеринария, зоотехния и биотехнология

2014, № 7

Биотехнология

УДК 577.352.336

Флуоресцентные красители: свойства и применение в клеточной биологии*

С. Ю. Зайцев

доктор биологических наук, доктор химических наук, профессор, заведующий кафедрой химии Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К. И. Скрябина», Москва, Российская Федерация

E-mail: [e-mail]

М. Н. Шапошников

кандидат биологических наук, старший преподаватель кафедры химии Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К. И. Скрябина», Москва, Российская Федерация

E-mail: [e-mail]

Д. О. Соловьева

аспирант кафедры химии Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина», Москва, Российская Федерация

E-mail: [e-mail]

М. С. Царькова

доктор химических наук, профессор, профессор кафедры химии Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К. И. Скрябина», Москва, Российская Федерация.

E-mail: [e-mail]

Аннотация

Статья посвящена обзору основных работ, относящихся к созданию флуоресцентных кра- сителей и современным методам флуоресцентной микроскопии для клеточной биологии и биотехнологии. В обзоре проведен анализ имеющейся в литературе информации относитель-

но свойств флуоресцентных красителей, изучению процессов взаимодействия флуоресцентных красителей с мембранами и их транспорта в клетки, использовании таких соединений в мето- де конфокальной флуоресцентной микроскопии для фундаментальных исследований и при- менений в области клеточной биологии и биомедицины. Отдельный раздел посвящен фотоак- тивированным флуоресцентным красителям и их преимуществам по сравнению с обычными флуорофорами для окрашивания клеток животных и визуализации субклеточных структур.

Ключевые слова: флуоресцентные красители, окрашивание клеток, фотоактивация, ми- кроскопия.

* Обзорная работа частично выполнена за счет гранта Российского научного фонда (проект № 14-16-

00046).

Ветеринария, зоотехния и биотехнология

73

Биотехнология	№ 7, 2014
Biotechnology

Fluorescent dyes: properties and application in cell biology

S. Yu. Zaitsev

doctor of chemical sciences, doctor of biological sciences, professor, Head of the Chemistry Department, Federal state budgetary educational institution of higher professional education «Moscow state academy of veterinary medicine and biotechnology by K. I. Skryabin», Moscow, Russian Federation.

E-mail: [e-mail]

M. N. Shaposhnikov

Ph.D., senior Lecturer of the Chemistry Department, Federal state budgetary educational institution of higher professional education «Moscow state academy of veterinary medicine and biotechnology by K. I. Skryabin», Moscow, Russian Federation.

E-mail: [e-mail]

D. O. Solovyova

Ph.D.-student of the Chemistry Department, Federal state budgetary educational institution of higher professional education «Moscow state academy of veterinary medicine and biotechnology by K. I. Skryabin», Moscow, Russian Federation.

E-mail: [e-mail]

M. S. Tsarkova

doctor of chemical sciences, professor, professor of the Chemistry Department, Federal state budgetary educational institution of higher professional education «Moscow state academy of veterinary medicine and biotechnology by K. I. Skryabin», Moscow, Russian Federation.

E-mail: [e-mail]

Abstract

The paper provides an overview of major works relating to the creation of fluorescent dyes and modern techniques of fluorescence microscopy for cell biology and biotechnology. The review analyzes the available information in the literature on the properties of fluorescent dyes, the study of the interaction of fluorescent dyes with membranes and their transport into cells, the use of such compounds in the method of confocal fluorescence microscopy for basic research and applications in cell biology and biomedicine. A separate part is devoted to the photoactivated fluorescent dyes and their advantages over conventional fluorophores to stain animal cells and visualization of subcel-

lular structures.

Keywords: fluorescent dyes, painting of cages, photoactivation, microscopy

ведение. Одним из активно развивае-	тических и эукариотических форм живых
Вмых направлений современной физико-	организмов. Одной из перспективных задач
химической биологии является разработка	в этой области является исследование фото-
и применение флуоресцентных красителей	активируемых флуоресцентных красителей
(ФК), обладающих селективными свойства-	(ФФК), изначально существующих в нефлу-
ми окрашивания клеток человека и живот-	оресцентной форме, которая может быть пре-
ных и субклеточных органелл прокарио-	образована во флуоресцентную форму путем

74	Ветеринария, зоотехния и биотехнология

2014, № 7

С. Ю. Зайцев, М. Н. Шапошников и др.

облучения светом (рис. 1) [9]. Изменяя мощ- ность облучающего света и его локализацию, можно варьировать число и пространствен- ное расположение образовавшихся флуо- ресцентных «зондов» и далее следить за их движением, определять форму и взаимное расположение субклеточных объектов, по- меченных ФФК. Эти и другие свойства та- ких красителей активно используются для разработки и применений новых методов исследования в биологической микроско- пии. Одним из существенных ограничений в этой области является то, что большинство существующих ФФК имеют большой раз- мер «маскирующей» группы, а продукты их фотолиза токсичны для клеток. Работы по моделированию и синтезу новых ФФК, про- изводных родамина, имеющих компактную «маскирующую» группу, не токсичную для клеток, активно ведутся как за рубежом (Макс-Планк-Институт биофизической хи- мии, Гёттинген, ФРГ), так и в России (МГУ, ФГБОУ ВПО МГАВМиБ). Эти ФФК являют- ся ценным инструментом для исследовате- лей в различных областях биохимии, биоме- дицины и бионанотехнологий (рис. 1).

Рис. 1. Обобщенная схема фотоактивации ФФК и детекции определенных биоструктур внутри клетки с интенсивной флуоресценцией (синефиолетовый цвет обозначает белки актина, красно-бордовый – белки тубулина, зеленые пятна – пероксисомы) [9]

Основными целями данного обзора явля- ются: анализ имеющейся в литературе ин- формации как относительно свойств ФК, так и методов их использования для клеточной биологии и биотехнологии; оценка достоинств и недостатков метода конфокальной флуорес- центной микроскопии для фундаментальных исследований и применений для практики в области биомедицины; рекомендации по ис- пользованию ФФК для окрашивания клеток и субклеточных структур.

Изучение процессов взаимодействия флуоресцентных красителей с мем-

бранами и их транспорта в клетку. Вы-

деляют следующие пути проникновения флуоресцентных красителей: пассивная диффузия, активный транспорт, пиноци- тоз, клатрин-зависимый рецепторно-опосре­ дованный эндоцитоз, актин-зависимый рецепторно-опосредованный эндоцитоз, по- средством Р-гликопротеинового насоса [10]. Рецепторно-опосредованные эндоцитозы наиболее характерны при проникновении антител, а Р-гликопротеиновый насос пред- ставлен не во всех клетках и реализуется для достаточно узкого спектра различных веществ, в том числе ФК. В случае гидро- фильных ФК в основном способ проникно- вения определяется механизмами актив- ного транспорта и эндоцитозов, а в случае лиофильных ФК – посредством пассивной диффузии. На сегодняшний день развитие данного направления является достаточно новым и актуальным, а многие вопросы на- ходятся на стадии научных разработок.

Если ФК хорошо растворим в воде, то ско- рость его встраивания в фосфолипидный бислой будет, очевидно, зависеть от частоты и эффективности столкновений молекулы ФК со сферической липидной везикулой (рис. 2) [2]. Частота таких столкновений за- висит от радиусов сталкивающихся частиц и от коэффициентов их диффузии в воде [4]. В свою очередь, коэффициент поступатель- ной диффузии сферической частицы зави- сит от ее радиуса, вязкости среды и темпе- ратуры [1].

Рис. 2. Модель связывания ФФК с липидным бислоем липосом

Ветеринария, зоотехния и биотехнология

75

Биотехнология

№ 7, 2014

В качестве примера можно рассмотреть взаимодействие одного из водораствори- мых ФК (RA = 0,35 нм) с липосомами (RM ≈ 15 нм). Экспериментально измеренная ве- личина коэффициента диффузии для это- го ФК и липосом при 30° составляла 2,1.108 М-1с-1 [1]. Это означает, что только одно из 340 столкновений ФК с липосомой сопрово- ждалось включением зонда в мембрану. Тем не менее процесс происходит очень быстро: порядка 1 мс для 5 мкМ раствора ФК. Повидимому, и другие водорастворимые зонды столь же быстро встраиваются в мембрану.

Совершенно иная ситуация возникает, если встраиваться в мембрану предстоит ФК, плохо растворимому в воде. Лишь при очень медленном введении раствора зонда в спирте или в диметилформамиде в водную суспензию мембранных везикул молекулы зонда будут встраиваться сразу в мембра- ну. При быстром введении зонд будет обра- зовывать агрегаты, мицеллы и кристаллы; в обоих случаях встраивание займет немало времени из-за низкой концентрации раство- ренного в воде ФК. Скорость встраивания связана с этой концентрацией и бимолеку- лярной константой взаимодействия зонда с мембраной. В свою очередь концентрация ФК в мембране зависит от константы связы- вания зонда с собственными агрегатами [1].

Из этого следует, что необходимо, по воз- можности, избегать появления крупных агрегатов зонда. Лучше, например, вносить зонд постепенно, чем сразу: вероятность кри- сталлизации из пересыщенного раствора бу- дет тогда ниже. Для гидрофильных ФК по- рядок добавления зонда и мембран не имеет значения[11],втовремякакболеегидрофоб- ные зонды следует добавлять только к мем- бранам, но не наоборот. Более внимательно при этом надо относиться к незаряженным ФК, так как для них более вероятно форми- рование крупных кристаллов. Если это допу- стить, то можно наблюдать долгую кинетику встраивания, для некоторых гидрофобных ФК (даже более часа). Между тем в боль- шинстве работ такие ФК, как пирен, ФНА и ДФГТ [12], добавляют сразу и без должного контроля за тем, как и за какое время они встраиваются в мембраны.

С ростом температуры встраивание зон- дов, естественно, ускоряется. Другой спо-

соб ускорения связывания – применение детергентов или хаотропных агентов (типа NaClO4). Приходится, однако, помнить, что все эти воздействия могут повлиять на саму мембрану, и, кроме того, если температуру всегда можно снизить, то удалить полно- стью детергент из мембраны непросто.

Замечание об опасности повредить мем- брану при попытках введения ФК относится икприменениюрастворителя,вкоторомФК добавляют к водной суспензии мембран или раствору, омывающему клетки. Разумеется, если зонд вносят в органическом раствори- теле, то концентрация последнего в суспен- зии мембран должна быть минимальной. Обычно она составляет ≤ 1%, но для этано- ла считают, что допустимы и более высокие концентрации — до 11% [13]. Хлороформ же влиял на мембраны уже в концентрации 1,5% [13]. Не все зонды растворимы в этано- ле. Филипин вносили в диметилформамиде [14], который является более «универсаль- ным», растворяя те ФК, которые не удается растворить в других средах.

Операцией, завершающей процедуру внесения зонда в мембрану, может быть удаление избытка ФК (а заодно и раство- рителя), например, гельфильтрацией на сефарозе или центрифугированием [15]. Чтобы узнать, какое количество зонда оста- лось связанным с мембранами, к суспензии мембран можно добавить детергент, напри- мер, тритон Х-100 до конечной концентра- ции 3%, или ЦТАБ до 0,04 М, или 5 объемов этанола, и затем определить количество ФК по его флуоресценции.

Одним из главных достоинств метода флуоресцентных зондов является возмож- ность исследования одного липидного мо- нослоя или бислоя, одной клетки или ее субклеточных структур. Работа с такими объектами имеет свои особенности и, в об- щем, оказывается более сложной, чем рабо- та с суспензиями мембран в обычных спек- трофлуориметрах.

Применение стандартных флуорес-

центных красителей в биомедицине.

Флуоресцентная микроскопия применяется для прижизненной диагностики в молеку- лярной биологии: проточную цитометрию и технику гибридизации проводят in situ,

76	Ветеринария, зоотехния и биотехнология

2014, № 7

С. Ю. Зайцев, М. Н. Шапошников и др.

на гистологическом срезе [8]. Первый метод необходим для количественного анализа со- держания ДНК в клетках опухолей и других патологических субстратов. С этой целью исследуемый фрагмент нефиксированной ткани с помощью ферментов подвергают дезагрегации, т.е. разъединению и размель- чению до отдельных клеток. Затем в спе- циальной установке поток суспензии изо- лированных клеток толщиной в 1 клетку, окруженный обволакивающей жидкостью, проходит через считывающий лазерный пу- чок. Недавно научились изолировать ядра клеток и проводить их в более узких пото- ках, что усовершенствовало и без того точ- ный анализ.

Существует множество ФК, которые дей- ствуют как флуоресцирующие индикаторы, оказывающие различное окрашивающее действие на различные виды белков, суще- ствующих в клетках тела. Такого эффекта можно достичь с разными красителями, но ни один из них не действует так хорошо, как акридин оранжевый при его взаимодей- ствии с ДНК и РНК. Когда акридин оран- жевый осаждают на ДНК, а затем освещают его ультрафиолетовым светом, то поглощен- ный краситель флуоресцирует с зеленым или желтым оттенком. С другой стороны, когда тот же краситель осаждают на РНК, ультрафиолетовое облучение возбуждает флуоресценцию, коричневую, оранжевую или ярко-красную в зависимости от концен- трации РНК. Если изучаемые образцы со- держат и ДНК, и РНК, то можно визуаль- но различить эти соединения. Более того, просто при облучении клеток, пропитанных этим красителем, оказывается иногда воз- можно быстро на глаз провести различие между клетками: какие из них богаты ДНК, а какие – РНК [4].

В этом случае техника флуоресцентной микроскопии относительно проста. Объ- ект освещается светом 200-ваттной ртут- ной лампы высокого давления. Необходимо только между лампой и объектом поместить голубой фильтр, а для защиты наблюдателя перед окуляром микроскопа вставить жел- тый фильтр. Результаты получаются сразу же при визуальном просмотре.

Флуоресцентная микроскопия имеет идругиеприменениявдиагностике.Многие

минералы обладают собственными, харак- терными для них цветами флуоресценции, благодаря чему они поддаются отождествле- нию и прослеживанию. Сверхтонкие выра- щиваемые структурные слои в кристаллах, которые могут улавливать мельчайшие примеси, были выявлены по их диффе- ренциальным флуоресцентным эффектам. Некоторые живые клетки флуоресцируют в силу естественных причин, другие могут побуждаться к этому введением красителей, как это имеет место с описанными выше ДНК и РНК. Существует естественная пер- вичная флуоресценция, обусловленная соб- ственным природным содержимым клеток, и вторичная флуоресценция, которая может быть вызвана обработкой клеток красите- лями. Эта обработка для флуоресцентного исследования иногда называется флуорох- ромией, в ней используются специальные красители (такие, как акридин оранжевый), называемые флуорохромами. Некоторые флуорохромы в химическом отношении до- статочно слабы, и их можно вводить опре- деленным животным, не нанося им вреда: это позволяет при помощи флуоресцентной микроскопии следить за процессами жизне- деятельности живых клеток. Посредством флуоресценции можно распознавать также определенные бациллы.

В настоящее время в процессе развития находятся совершенно новые способы под- крашивания для использования их во флуо- ресцентной микроскопии.

В современной технике фосфоресценция и флуоресценция получили радикально но- вые применения. За этим развитием зача- стую лежит понимание тонких оптических квантовых процессов. Метод флуоресцент- ной микроскопии успешно применяется для диагностики заболеваний почек (в частно- сти, постинфекционного гломерулонефри- та) и генных патологий [14].

Свечение, испускаемое люминесциру- ющими клетками, предварительно поме- ченными флуорохромами, например, по непрямой методике, попадает на фотоинди- каторы. Затем осуществляется сортировка, а отсортированные клетки направляются в разные емкости. Размеры клеток или изо- лированных ядер определяют в компьютере после анализа углового светового рассея-

Ветеринария, зоотехния и биотехнология

77

Биотехнология

№ 7, 2014

ния, которое прямо пропорционально этим размерам. Для параллельного определения содержания в клетках ДНК и РНК, как уже упоминалось, клеточную суспензию окра- шивают акридин-оранжевым – флуорохро- мом, который окрашивает ДНК в зеленый, а РНК в оранжево-красный цвет [4].

Более двух десятилетий имеет место при- менение данного метода в онкологии [5]. При этом особое значение имеет использова- ние его при диагностике врожденных поро- ков развития. Раковые клетки могут содер- жать гораздо больше РНК, чем нормальные здоровые клетки. Таким образом, наличие в образце оранжевой или красной флуо- ресценции является серьезным признаком опасности [1].

Помимо этого, определенный интерес имеет применение метода люминесцентной микроскопии в инфекционной патологии. Ярким примером является изучение тако- го распространенного заболевания, как ту- беркулез. Уже приобретен положительный опыт по совершенствованию люминесцент- ной микроскопии для диагностики у боль- ных туберкулезом, позволяющий повысить результативность анализа, сократить затра- ты рабочего времени в отдельных моментах исследования и обезопасить персонал при работе с вирулентной культурой [3].

Нейродегенеративные заболевания вы- ходят на ведущий рубеж в мире в связи с ростом продолжительности жизни и улуч- шения ее качества. При разработке лекар- ственных препаратов для лечения болезни Альцгеймера и для оценки их эффективно- сти широко используют высокочувствитель- ный и высокоселективный биохимический метод определения активности ацетил-хо- линэстеразы (АХЭ).

В международной практике активно ис- пользуется колориметрический метод Эл- лмана. [16] Он основан на определении ско- рости ферментативного гидролиза субстрата ацетилтиохолина в отсутствие и в присут- ствии анализируемой пробы с использова- нием в качестве индикатора на тиольную группу 5,5-дитиобис-(2-нитробензойной) кислоты (реактива Эллмана), которая при взаимодействии с тиохолином образует окрашенный анион RS–. Метод Эллмана имеет ряд недостатков, основным из кото-

рых является лёгкая окисляемость выше

названного окрашенного аниона (в области

412 нм).

Известно влияние АХЭ на флуоресцен-

цию обратимых ингибиторов-флуорофоров.

Эти данные использовали для разработки

экспресс-метода определения ингибиторов

АХЭ. Действительно, введение нефлуорес-

цирующего ингибитора, характеризующего-

ся более высоким сродством к ферменту (или

при его существенно более высокой концен-

трации), приводит к смещению равновесия и освобождению ингибитора-флуорофора в соответствии с системой.

Одним из эффективных методов изуче-

ния изменений конформационных свойств

белков является тушение флуоресценции.

Суть этого явления состоит в уменьшении интенсивности флуоресценции вещества

(лиганда, зонда) при его взаимодействии с другим веществом - тушителем, например, при диффузионном столкновении с ним или при образовании нефлуоресцирующего ком- плекса. По степени тушения можно судить об условиях взаимодействия между флуоро- фором и тушителем. Если флуорофор свя- зан с белком, то на эффективность тушения влияют динамические и пространственные свойства связывающей области белковой молекулы.

Былопоказано,чтовзаимодействиезонда К-35 со связывающими центрами главного транспортного белка крови человека (альбу- мина) у больных тревожной депрессией до- стоверно изменено по сравнению со здоро- выми лицами [7]. Очевидно, у них изменена химическая структура или конформация связывающих центров в молекуле альбуми- на. Транспорт альбумином лигандов, как эндогенных, так и экзогенных, определяет- ся свойствами связующих центров альбуми- на. Независимо от молекулярного механиз- ма обнаруженных нарушений изменение условий связывания альбумином естествен- ных метаболитов (жирных кислот, билиру- бина, и др.) и ксенобиотиков (в том числе лекарственных средств) может привести к перераспределению концентраций низко- молекулярных веществ в организме и, как следствие, к нарушению метаболических процессов и гомеостаза в целом. Это может иметь значение при формировании депрес-

78	Ветеринария, зоотехния и биотехнология

2014, № 7

С. Ю. Зайцев, М. Н. Шапошников и др.

сивного расстройства, его течения и тера- певтической динамики, а также оказывать влияние на течение осложнений тревожной депрессии. Регистрация изменений альбу- мина при депрессии может служить одним из методов оценки состояния организма, помогающим выработать рекомендации по прогнозу эффективности терапии, что со- кратит сроки лечения, а, следовательно, улучшит качество жизни пациентов.

Таким образом, применение флуорес- центной микроскопии в медико-биологи- ческих исследованиях позволяет уточнить, дополнить и верифицировать пато- и мор- фогенез заболевания с целью определения путей и тактики их лечения.

Фотоактивируемые флуоресцентные

красители для биологической микро-

скопии. Фотоактивируемые («закрытые» или «замаскированные») флуоресцентные красители находятся во нефлуоресцирую- щемсостояниизасчетвключениялабильной химической группы. Фоточувствительные «маскирующие» группы могут быть расще- плены облучением в УФ области света, тем самым делая краситель флуоресцирующим [9]. Закрытые флуоресцентные красители представляют огромный интерес для созда- ния изображений биологических объектов, потому что они могут быть использованы для отслеживания белка [17, 18], создания многоцветных приложений [19], наноско- пии дальнего поля и за ее пределами.

Сейчас становится популярной сложная фотофизика (например, фотопереключе- ние, флуорогенные реакции, многоцветные излучения), требующая более сложных ме- тодик визуализации. Например, супер-раз- решающие схемы визуализации (PALM, F-PALM, STORM) [20–22] требуют актив-

ного контроля над флуоресценцией, чтобы «включать» только несколько излучателей в каждом цикле визуализации [23, 24].

Новые ФФК – закрытые родамины NN, могут использоваться как метки в отдельно- сти или в сочетании с традиционными флу- оресцентными красителями и «переключае- мыми» родаминовыми спироамидами [7]. В последнем случае они позволяют получать новые схемы-изображения, основанные на ступенчатой активации и детекции несколь-

ких флуоресцентных маркеров. В обычной

«многоцветной» микроскопии флуорофоры

отличаются их спектрами поглощения и из-

лучения, что приводит к появлению арте-

фактов из-за хроматических аберраций [25,

26]. Чтобы решить эту проблему и сократить

число источников возбуждения и обнаруже-

ния каналов, исследователи решили объ-

единить три флуорофора с аналогичными

спектрами поглощения и излучения. Чтобы

различать эти три красителя, которые по

своим люминесцентным свойствам близки

спектрами поглощения и возбуждения, их

отдельно переключали, и были использова-

ны характеристики открытых форм: ТМР; ТМР-NN может быть фотоактивирован облу-

чением «длинным» УФ-излучением (около

405 нм) и спироамид RhS может быть фото-

активирован «коротким» УФ-излучением (≤

375 нм). Используя такую схему, получают

многоцветные микрофотографии [9] (рис. 1).

На интенсивность флуоресценции могут

оказывать влияние даже небольшие изме-

нения pH [25]. Спектр поглощения и спектр

флуоресценции у родамина В, согласно [27],

для цвиттериона находится в более синей

области, чем у протонированной формы.

Цвиттериионная форма также более чув-

ствительна к полярности растворителя.

В работе [27] приводятся данные другой

публикации, где с помощью ЯМР было до-

казано, что отрицательный заряд карбокси-

группы оказывает существенное влияние на

протоны аминогруппы. Высказана мысль,
что у цвиттериона порядок связи	C		N
в цвиттерионе больше, связь более прочная,

чем в протонированной форме, вращение во- круг данной связи затруднено, а так как оно способствует затрате энергии на вращение, а не на излучение, то с её ограничением уве- личивается и энергия фотона, а длина его волны падает. При низких рН, когда прото- нированная форма преобладает, спектры по сравнению с нейтральной ищелочной средой должны быть сдвинуты в красную сторону.

В экспериментах по изучению распреде- ления продуктов реакции при фотоактива- ции ФФК родаминового ряда, диазокетон 13 подвергался фотолизу в метаноле, с исполь- зованием света с длиной волны >320 нм [9]. Основные результаты приведены в схеме на рис. 3.

Ветеринария, зоотехния и биотехнология

79

Биотехнология

№ 7, 2014

Рис. 3. Фотолиз диазокетона 13 в метаноле со средним облучением ртутной лампой (150 В), оснащенной боросиликатным стеклянным фильтром (около 50% пропускания при 320 нм).

Примечание: схема из работы [9]

При освещении лампой 1 мМ раствор сое-		свидетельствуют о том, что все соединения
динения 13 сразу становится красным, про-		типа 13 могут быть эффективно «открыты»,
дукты распада могут быть обнаружены в ре-		а их фотолиз обеспечивает высокий уровень
акционной смеси, а после 40 мин облучения		флуоресценции продуктов – гомологов рода-
исходное вещество полностью расходуется.		мина (типа сложного эфира 15).
Образование продуктов легко объясняется		В процессе освещения происходит посте-
известными закономерностями [9]. Фотолиз		пенное уменьшение интенсивности флуо­
α-диазокетонов сопровождается отщеплени-		ресценции. Это явление носит название
ем азота и промежуточным образованием		«выцветание» флуорохрома. Степень вы-
карбена (16C), участвующего в перегруппи-		цветания зависит от интенсивности возбуж-
ровке Вольфа. Получающийся кетен (16K)		дающего света и времени экспозиции. На
«перехватывается» любыми нуклеофила-		скорость и степень выцветания могут ока-
ми, присутствующими в реакционной сре-		зывать влияние физические и химические
де (водой, аминами, спиртами и т.д.). Эти		изменения самого флуорохрома, наличие
подробно изученные преобразования удли-		в растворе других флуорохромов, а также
няют углеродную цепь на один атом [28].		окислителей или солей тяжелых металлов.
Интересно, что фотолиз диазокетонов был		Современные флуорохромы выцветают зна-
также использован для «сшивки» амино-со-		чительно медленнее, чем те, которые ис-
держащих	соединений [29]. Образование	пользовались 10–15 лет назад. Тем не ме-
побочного	нефлуоресцирующего продукта	нее проблема замедления снижения уровня
14 можно объяснить миграцией связи «a»		флуоресценции все еще актуальна, посколь-
в карбене	16C. Основной красный флуорес-	ку она напрямую связана с возможностью
цирующий продукт 15 получается в ходе пе-		получения качественного изображения ис-
регруппировки Вольфа карбена 16C в кетен		следуемого объекта [6].
16K (с миграцией связи «b») в присутствии		Для защиты флуорохромов от выцвета-
метанола, который присоединяется к высо-		ния готовые препараты необходимо хранить
ко реакционоспособной кетеновой группе,		в темноте при низких температурах (4°С для
а С-С связь с четвертичным атомом углеро-		водных заключающих сред и кратковремен-
да при этом разрушается. Эти результаты		ного хранения, –20°С для длительного хране-

80	Ветеринария, зоотехния и биотехнология