Молекулярная биология клетки Глава 3

11

Цитостатики

Ряд агентов (цитостатики, или статмокинетики) нарушает сборкуили распад микротрубочек, что блокирует митоз и внутриклеточный транспорт. Это свойство цитостатиков широко используют в клинике (преимущественно в онкологии) при химиотерапии некоторых опухолей для блокады пролиферации трансформированных клеток.

•Колхицин связывается с субъединицами тубулина и препятствует их присоединению к (+)-концу микротрубочек, блокируя их рост. При этом продолжающаяся деполимеризация микротрубочек с (–)-конца приводит кполной разборке всехмикротрубочек. Колхицин действует в М-фазе клеточного цикла, препятствуя образованию митотического веретена и как следствие этого делению клеток.

•Алкалоиды Vinca rosea. Винбластин и винкристин имеют тот же эффект, что иколхицин. Они специфически действуютнаклетки вМ-фазе.

•Таксол выделен из коры тиса. В отличие от алкалоидов Vincarosea и колхицина, подавляющих сборку микротрубочек, таксол, связываясь с микротрубочками, препятствуют их деполимеризации, что приводит к образованию стабильных микротрубочек. В митозе появление устойчивых к деполимеризации микротрубочек вызывает тот же эффект, что и алкалоиды Vinca rosea и колхицин: происходит торможе-

ние пролиферации клеток. Таксол действует в поздней G2- и M-фазах клеточного цикла. Этот мощный ингибитор деления эукариотических клеток используют в качестве антибластомного препарата.

Митотический цикл

В ходе митоза делятся ядро (кариокинез) и цитоплазма (цитокинез). Митоз делится на фазы: профаза, прометафаза, метафаза, анафаза, телофаза (рис. 3-4).

•Профаза. Хромосомы конденсируются, хроматиновые нити образуют клубок (материнский клубок). Каждая хромосома представлена двумя тесно прилегающими друг к другудочерними (сестринскими) хроматидами. Ядрышко реорганизуется. Ядерная оболочка распадается на мембранные пузырьки. В цитоплазме уменьшается количество структур гранулярной эндоплазматической сети и число полисом. Комплекс Гольджи распадается на везикулы. В клетке прекращается синтез РНК и белка. Центриоли двумя парами (диплосомы) расходятся к полюсам клетки, происходит формирование митотического (пролиферативного) аппарата, в который входят центриоли и веретено деления, состоящие из микротрубочек.

◊В клетках большинства видов растений формирование веретена деления происходит без участия центриолей.

12

Рис. 3-4. M-фаза клеточного цикла. После фазы G2 начинается M- фаза клеточного цикла. Она состоит из пяти стадий деления ядра (кариокинез) и деления цитоплазмы (цитокинез). M-фаза заканчивается к началуфазы G1 следующего цикла [из Gilbert S.F., 1985].

•Прометафаза. Завершается формирование веретена деления. Хромосомы направляются к экватору деления.

•Метафаза. Максимально конденсированные хромосомы выстраиваются в плоскости экватора клетки (метафазная пластинка или материнская звезда). К концу фазы хроматиды сохраняют лишь кажущуюся связь в области центромер. Их плечи располагаются параллельно друг другус хорошо различимой щелью междуними. Специальным образом приготовленные препараты метафазных хромосом цитогенетики используют для исследования кариотипа.

◊В клетках растений в метафазе хромосомы нередко располагаются в экваториальной плоскости без строгого порядка.

•Анафаза. Наиболее короткая по продолжительности фаза митоза. Хромосомы становятся похожими на шпильки. Дочерние (сестринские) хроматиды в качестве уже самостоятельных хромосом, будучи ориентированными центромерными участками к одному из по-

13

люсов, а теломерными (концевыми) — к экватору клетки, перемещаются к клеточным полюсам. Расхождение хромосом вдоль микротрубочек обеспечивается моторным белком (динеином). По завершении движения на полюсах собирается два равноценных набора хромосом (дочерние звёзды), предназначенных для дочерних клеток.

•Телофаза. Завершающую фазу митоза нередко делят на раннюю и позднюю телофазу. Важнейшее событие ранней телофазы — реконструкция ядер будущих дочерних клеток. Достигшие к концуанафазы клеточных полюсов хромосомы входят в контакт с пузырьками, представляющими собой производные мембран разобранной в профазе ядерной оболочки. Соответственно наличию в делящейся клетке двух полюсов формируются две полярные группы, где образуются дочерние ядра (дочерние клубки). К важным событиям телофазы относятся также деконденсация хромосом, образование ядрышка, разрушение веретена деления. Итогом поздней телофазы является разделение тела материнской клетки (цитотомия, цитокинез). В клетках животных это происходит путем образования перетяжки в экваториальной области.

◊В клетках растений с их ригидными (неподатливыми) клеточными стенками деление материнской клетки на две происходит путем построения перегородки из пузырьков комплекса Гольджи.

Нетипичные формы митоза

К нетипичным формам митоза относятся эндомитоз и его разновидность — политения.

•Эндомитоз характеризуется удвоением числа хромосом внутри ядерной оболочки без разрушения ядрышка и образования веретена деления. Это приводит к увеличению числа хромосом в клетке иногда в десятки раз по сравнению с диплоидным набором. Так возникают полиплоидные клетки. Пропорционально увеличению числа генов растет масса клетки, что повышает её функциональные возможности. В норме этот процесс встречаются очень часто в эпителиальных клетках печени (гепатоцитах) и мегакариоцитах красного костного мозга. С генетической точки зрения эндомитоз представляет собой геномную соматическую мутацию.

Гепатоциты (эпителиальные клетки печени). 25% гепатоцитов имеет дваядра. Для клеток характерна полиплоидия: 55–80% гепатоцитов — тетраплоидны, 5–6% — октаплоидны и только 10% — диплоидны.

14

Кардиомиоциты (сердечные мышечные клетки). Как правило, кардиомиоциты имеют одно ядро. Вместе с ростом массы миокарда уменьшается количество диплоидных клеток и возрастает количество полиплоидных кардиомиоцитов (рис. 3-5). Полиплоидия может достигать 64n.

•Политения. При этом типе деления происходит кратное увеличение содержания ДНК в хромосомах при сохранении их диплоидного числа. При этом количество хроматид может достигать 1000 и более, хромосомы приобретают гигантские размеры. При политении утрачиваются все фазы митотического цикла, кроме репродукции первичных нитей ДНК. Политения встречается в гепатоцитах. Политенные хромосомы в клетках слюнных желёз дрозофил применяются для построения цитологических карт генов в хромосомах.

Лимит Хейфлика

Клеточное или репликативное старение подразумевает ограниченную способность клеток к делению in vitro (лимит Хейфлика). В опытах Хейфлика (1965 г) установлено, что фибробласты кожи человека активно делятся в культуре, однако интенсивность пролиферации клеток постепенно снижается. Через 50-60 делений фибробласты необратимо теряют способность к делению, но сохраняют жизнеспособность ещё несколько недель. Предполагается, что подобное ограничение в количестве делений клеток может лежать в основе процессов старения организма и связано с прогрессивным укорочением длины теломер в результате неполной репликации концевых участков хромосом в каждом из последующих клеточных циклов.

Рис. 3-5. Изменение плоидности кардиомиоцитов в зависимости от массы миокарда [по Laflamme MA, Murry CE., из Nature, 2011].

15

РЕГУЛЯТОРЫ КЛЕТОЧНОГО ДЕЛЕНИЯ

Клеточный цикл жёстко регулируется множеством внутриклеточных и межклеточных молекулярных сигналов. К внутриклеточным молекулярным сигналам относятся собственно регуляторы клеточного цикла (циклины, циклин-зависимые протеинкиназы, их активаторы и ингибиторы), продукты протоонкогенов и антионкогенов. Регуляторы клеточного цикла также отвечают за правильность выполнения событий клеточного цикла. Проверка клеточного цикла происходит в так называемых сверочных точках (checkpoint). Эти точки расположены в концах фазы G1 (Сheckpoint 1: G1→S) и фазы G2 (Сheckpoint 2: G2→М) (рис. 3-1). В первой точке осуществляется проверка наличия повреждений ДНК, во второй точке проверяется завершённость репликации ДНК. Если выявляются повреждения ДНК, то клеточный цикл приостанавливается и даётся время для устранения повреждений ДНК. В случае невозможности репарации ДНК в клетке запускается механизм самоуничтожения — апоптоз.

Циклины А, B, E, D — регуляторные субъединицы циклин-зависи- мых протеинкиназ. Название этих белков — циклины — отражает цикличность внутриклеточной концентрации белков в процессе каждого клеточного цикла, достигающей максимума на его определённых стадиях (рис. 3-1).

Циклин-зависимые протеинкиназы (Cdk — cyclin dependent protein kinase). Активация индивидуальной Cdk происходит после её взаимодействия со специфическим циклином. Образование комплекса циклинов с Cdk становится возможным после достижения циклином критической концентрации. Последовательная активация Cdk и последующее фосфорилирование ими критических субстратов контролируют клеточный цикл, переключая его с одной фазы на другую (с G1 на S или G2 на M). В результате снижения концентрации определённого циклина происходит обратимая инактивация соответствующей Cdk. Белки, связывающиеся с комплексом циклинов с Cdk и ингибирующие его каталитическую активность, блокируют клеточный цикл в ответ на антипролиферативные сигналы.

Протоонкогены кодируют белки, стимулирующие клеточный цикл (например, ras, erbb2). Мутированные протоонкогены называют онкогенами.

•RAS — суперсемейство генов, кодирующих ras G-белки (малые ГТФа-

зы — гуанозинтрифосфатазы). Ras G-белок локализуются на внутренней стороне клеточной мембраны и участвуют в передаче внешнего сигнала от рецептора к ядру, стимулирующего пролиферацию

16

клеток. В результате мутации ras G-белок остаётся активированным, что приводит к неуправляемомуразмножению клеток(рис. 3-6). Му-

Рис. 3-7. Роль ras протоонкогена в злокачественной трансформации клеток. Ras G-белок кодируется ras протоонкогеном. Мутированный ген кодирует онкопротеин, неспособный гидролизовать ГТФ, в результате чего клеточный цикл не прерывается

17

тированный ras (онкоген) обнаруживается в 15% всех новообразований человека, включая 25% — рак лёгкого, 50% — рак толстой кишки, 90% — рак поджелудочной железы.

•ERBB2 — (erythroblasticleukemia viraloncogene homolog2; 17q21.1) коди-

рует белок семейства рецепторов эпидермального фактора роста. Рецептор не связывается с факторами роста, но тесно взаимодействует с другими рецепторами эпидермального фактора роста, стабилизируя их связь с лигандами и, таким образом, поддерживая клеточную пролиферацию. Амплификация или сверхэкспрессия гена errb2 встречается при разных онкологических заболеваниях, например, при раке молочной железы и раке яичника.

Антионкогены (онкосупрессоры) кодируют белки, блокирующие клеточный цикл. Мутации генов онкосупрессоров неизбежно приводят к появлению бесконтрольно пролиферирующего клеточного клона.

•Белок р53 — один из важнейших регуляторов клеточного цикла, специфически связывается с ДНК и активирует экспрессию генов,

блокирующих цикл в контрольной точке G1→S. При неблагоприятной информации о состоянии генома (активация онкогенов, повреждения ДНК) р53 блокирует клеточный цикл до тех пор, пока нарушения не будут устранены. В повреждённых клетках содержание р53 возрастает. Это даёт клеткам шансы восстановить ДНК путём блокирования клеточного цикла. При серьёзных нарушениях ДНК р53 инициирует самоубийство клетки — апоптоз. В случае мутации р53 и как следствие отсутствия сдерживающего фактора клетки с повреждённым геномом продолжают активно размножаться, что приводит к опухолевомуросту (рис. 3-7). При врождённых дефектах р53 хотя бы на одной хромосоме риск онкологии в юношеском возрасте достигает 95%. Первый генный препарат, разрешённый в клинической практике для лечения онкологических заболеваний — рекомбинантный аденовирусный вектор, экспрессирующий белок р53.

•Семейство белков р21 — ингибиторов Cdk — включает три белка, p21, р27 и р57. Эти белки связывают и ингибируют комплексы: циклин D/Cdk4, циклин Е/Cdk2, и циклин А/Cdk2. Выявление содержания р27 используют в диагностике рака молочной железы. Снижение уровня р27 является плохим прогностическим признаком.

•Белок р16 — ингибитор Cdk — препятствует взаимодействию Cdk4/6 с циклином D, блокируя клеточный цикл в точке рестрикции G1→S (Сheckpoint 1).

18

Рис. 3-7. Белок р53 в регуляции клеточного цикла. Нормальный белок р53 связывается с ДНК и инициирует экспрессию генов, продукты которых блокируют активность Cdk2 в сверочной точке G1→S, что приводит к остановке клеточного цикла. Аберрантный белок р53 не способен связываться с ДНК и блокировать клеточный цикл.

19

ДИФФЕРЕНЦИРОВКА КЛЕТОК. КЛЕТОЧНЫЙТИП И ЕГО ФЕНОТИПЫ

В ходе специализации (дифференцировки) клеток, начиная от оплодотворённой яйцеклетки, формируются разные клеточные типы с разными фенотипами. При дифференцировке клетки экспрессируют строго определённую часть генома: транскрибируют специфические РНК и синтезируют специфические белки, что и определяет морфологические

ифункциональные признакидифференцированных клеток. Следовательно, различия между клетками, обладающими одинаковым набором генов, определяет дифференциальная активность генов. Дифференцировка обусловлена репрессией и активацией определённых групп генов. Разные клеточные типы экспрессируют разные гены.

Специализация конкретного клеточного типа начинается с преддиференцировки. В эту стадию клетка сохраняет способность к пролиферации, накапливает органеллы, необходимые для выполнения будущей функции. На следующей стадии протодифференцировки пролиферативная активность клетки ограничивается, начинается синтез специфичного продукта. В стадии собственно дифференцировки митозы прекращаются, белоксинтезирующий аппарат начинает работать в полную силу. В заключительной стадии терминальной дифференцировкиклеткав полном объёме продуцирует специфические белки, приобретает характерные морфологические признаки, специализированные на выполнение определённой функции.

Известно более 200 клеточных типов — однородных групп (популяций) клеток с идентичным набором разрешённых к экспрессии генов, определяющих морфологические и функциональные различия между клеточными типами. Нервные, мышечные, хрящевые, железистые — клетки разных клеточных типов, формирующие разные ткани организма (нервную, мышечную, соединительную, эпителиальную). Клеточный тип включает понятия границы нормы клеточного типа, пластичность

иклеточные фенотипы.

•Границы нормы клеточного типа определяются набором генов, контролирующих дифференцировкуи функциональнуюактивность клетки.

•Пластичность клеточного типа выражается фенотипическими различиями клеток одного клеточного типа.

•Фенотип — совокупность всех реализованных признаков клетки, как морфологических, так и физиологических.

Вкачестве примера дифференцировки клеточного типа с разными фенотипами на уровне разрешённых к экспрессии генов рассмотрим

20

развитие (миогенез) поперечнополосатого мышечного волокна. Репрессор миогенеза MyoR (myogenic repressor) блокирует дифференцировку клеток мезодермы в мышечном направлении во время их миграции из миотома сомитов в места закладки скелетных мышц. Миогенез инициируется геном pax3, контролирующим активность мышечно-специфи- ческих факторов транскрипции [MyoD (myogenic differentiation), Myf5 (myogenic factor 5), миогенин, MRF4 (myogenic regulatoryfactor4)], имеющих мотив (определённую последовательность аминокислот) “спираль- поворот-спираль” для связывания с ДНК. MyoD и Myf5 контролируют образование миобластов из клеток миотомов, а миогенин и MRF4 отвечают за терминальную дифференцировку мышечных волокон, активируя экспрессию мышечно-специфических белков (скелетно-мышечные актин, миозины, тропомиозины), участвующих в образовании сократительных органелл мышечного волокна — миофибрилл. Каждая скелетная мышца уникальна по спектрувходящих в её состав мышечных волокон. Фенотипические различия скелетных мышечных волокон генетически детерминированы, а экспрессия того или иного признака зависит от активности специфических генов, регулируемых нервной и гуморальной системами. При различных функциональных и патологических состояниях организма структурно-функциональные характеристики (фенотипические признаки) мышцы изменяются в широких пределах, что является проявлением мышечной пластичности. К таким фенотипическим признакам относят скорость сокращения и способ клеточного дыхания (аэробное, анаэробное) мышечных волокон. По скорости сокращения мышечные волокна делятся на быстрые и медленные, что определяется экспрессией генов, кодирующих либо быстрые, либо медленные изоформы сократительных белков. По уровню экспрессии генов, контролирующих гликолиз (распад глюкозы с образованием АТФ), различают окислительные, гликолитические и промежуточные фенотипы. На практике различают три фенотипа типа мышечных волокон: быстрые красные, быстрые белые, медленные промежуточные.

СМЕРТЬ КЛЕТОК

Клеточный состав многоклеточного организма постоянно изменяется, и для его нормального существования предполагается наличие баланса между клеточной пролиферацией и гибелью клеток.

Удаление из организма ненужных, постаревших и клеток с повреждённой ДНК происходит с помощью регулируемого процесса самоуничтожения — апоптоза. Программа апоптоза консервативна и универсальна от червя до человека. Смерть клетки при апоптозе является след-