Бактериальный вагиноз

Культуральные признаки микрооганизмов определяются характером их роста на питательных средах. Будучи постоянными для каждого вида микроорганизма, они являются важным диагностическим признаком.

Идентификация выделенных чистых культур бактерий в зависимости от целей может быть ориентировочной (определение рода) или финальной (определение вида).

Видовая идентификация выделенных чистых культур бактерий проводится общепринятыми методами с использованием номенклатуры Берджи и сведений, обобщенных в руководствах по клинической микробиологии.

При видовой идентификации стафилококков учитываются пигмент, способность гемолизировать эритроциты, продуцировать лецитиназу, коагулировать плазму. Характерная пигментация колоний патогенных стафилококков, относящиеся к виду S. aureus, определяется при их росте на селективной питательной среде, содержащей высокую концентрацию NaCl (7,5%), маннит в качестве источника углеводов и желатин. Патогенные стафилококки, дают на этой среде колонии с желтой пигментацией. Ферментацию маннита определяют путем нанесения на изолированную колонию капли раствора бромтимолового синего (0,04%). В случае смены цвета красителя на желтый реакция считается положительной. На этой же среде возможно определение способности стафилококков сбраживать желатину. Для этого на изолированную колонию наносят каплю 20% водного раствора сульфосалициловой кислоты (реакция Stone). В случае положительной реакции через 10 минут вокруг колонии появляется прозрачная зона. Для подтверждения принадлежности бактерий к виду S.aureus проводятся тесты на выявление плазмокоагулазы и ДНК-азы. ДНК-азная активность выявляется на среде DNA agar (Oxoid) путем пересева материала из подозрительных колоний штрихами от центра к краю чашки. После инкубирования нуклеазная активность стафилококков выявляется при нанесении на среду красителя толуидинового синего (0,1%), при этом вокруг колоний, образованных S. aureus, появляется зона порозовения среды. Для подтверждения принадлежности стафилококков к виду S.aureus можно также воспользоваться идентификационными системами Staphyslide – Test (BioMerioux), принцип работы которых основан на агглюцинации эритроцитов, сенсибилизированных человеческим фибриногеном. Биохимическая идентификация стафилококков проводится при помощи тест-систем API 20 Staph и RAPIDEC staph (BioMerioux).

Видовая идентификация стрептококков основана на их биохимической активности и может быть проведена при использовании тест-системы API 20 Strept (BioMerioux).

Видовая идентификация грамотрицательных неспорообразующих факультативно-анаэробных бактерий производится при помощи тест систем API 20E (BioMerioux). Оксидазопозитивные бактерии (Pseudomonas spp., Aeromonas spp. и др.) идентифицируются с помощью тест системы API 20NE (BioMerioux). Для идентификации лактозопозитивных бактерий могут быть использованы тест-системы Enterofermtub, а лактозонегативных Oxifermtub (BioMerioux, Becton Dickinson). Кроме того, для идентификации всех грамотрицательных бактерий может быть использована тест-система BBL CRYSTAL (Becton Dickinson) или полуавтоматическая система "Sceptor" (Becton Dickinson) с использованием полистироловых планшетов для видовой идентификации грамотрицательных факультативно-анаэробных бактерий.

При отсутствии вышеперечисленных тест-систем энтеробактерии могут быть идентифицированы с помощю 12 биохимических тестов, которые выявляют: - способность энтеробактерий ферментировать глюкозу, лактозу, мальтозу, - маннит, сахарозу; - способность расти на цитратном агаре Симмонса; - отношение к мочевине и молонату натрия; - подвижность и способность продуцировать сероводород и индол.

Для видовой идентификации C.albicans, обладающей способностью продуцировать характерные для них хламидоспоры, подозрительные колонии (белые или розовые) пересевают со среды Сабуро на среду PCB (Diagnostics Pasteur) методом укола в толщу среды. Пробирки с пересевами инкубируют при комнатной температуре 24-48 часов. После инкубации определяют небольшой участок в зоне роста микроорганизмов и делают разветвленный мазок между двумя стеклами. Мазки изучают с помощью темнопольной микроскопии, при этом хламидоспоры ищут в зонах образования филаментов с находящимися на них бластоспорами. В случае отсутствия хламидоспор проводят повторный пересев. Если при этом вновь получают отрицательный результат, проводят биохимическую идентификацию дрожжеподобных грибов при помощи системы API 20C Aux (BioMerioux) или Micotube (BioMerioux, Becton Dickinson). Также видовая идентификация грибов рода Candida может быть проведена с помощью микробиологической системы Quantum (Abbot).

При идентификации гарднереллы учитывается морфология колоний на селективной питательной среде через 2-4 дня инкубации. Обычно колонии бывают выпуклыми, шарообразными с гемолизом. При микроскопии – мелкие палочки или коккобациллы, по отношению к окраске по Граму – грамвариабильные. Каталазо- и оксидазоотрицательные, продуцируют кислоту при гидролизе крахмала и мальтозы, чувствительны к метронидазолу и триметоприму.

Ориентировочная идентификация лактобактерий проводится микроскопическим методом (окраска мазка по Граму), которая позволяет оценить морфологию клеток. В мазках лактобактерии имеют вид прямых палочек, расположенных в виде блоков, не имеют спор. Бактерии рода Lactobacillus не образуют каталазы и оксидазы.

Идентификация факультативно-анаэробных лактобактерий проводится с помощью систем индикаторных бумажных для идентификации лактобактерий (СИБ-Л) и планшета биохимического, дифференцирующего лактобактерии (ПБДЛ) (НИИЭМ, г. Нижний Новгород). Идентификации подвергаются грамположительные каталазоотрицательные палочки, выросшие через 48 часов на среде MRS. Для выделения чистой культуры проводится двукратное пассирование отдельных колоний. Дифференциация основана на выявлении ферментативных свойств штаммов по их действию на углеводы и многоатомные спирты (глюкоза, меллибоза, манноза, мелецитоза, рамноза, салицин). Учет результатов проводится через 72 часа инкубации при температуре +37⁰С. Интерпритация результатов биохимического тестирования производится при помощи таблиц биохимических свойств лактобактерий.

Анаэробные штаммы лактобактерий идентифицируются с помощью полуавтоматической системы "Sceptor" (Becton Dickinson), после предварительного исключения способности тестируемых бактерий к спорообразованию.

Ориентировочная идентификация облигатно-анаэробных грамотрицательных бактерий проводится по следующим критериям: рост в присутствии желчи (диски 5 мг, BioMerioux), бриллиантового зеленого (диски 100 мкг, BioMerioux) и канамицина (диски 1000 мкг, BBL, Becton Dickinson), ферментация глюкозы, наличие черного пигмента.

Используя эти тесты, бактерии делят на 4 группы:

1 группа - Bacteroides группы fragilis. Все бактерии этой группы сбраживают глюкозу и способны расти в присутствии желчи и канамицина, бриллилантовый зеленый подавляет их рост;

2 группа – бактерии рода Prevotella. Бактерии этой группы растут в присутствии канамицина, но не растут в присутствии желчи и бриллиантового зеленого, обладают сахаролитической активностью – сбраживают глюкозу. Некоторые виды могут образовывать черный пигмент на кровяных средах после 5-7 дней инкубации;

3 группа – род Porphyromonas. Асахоролитические бактерии, не растущие в присутствии желчи и бриллиантового зеленого, но растущие в присутствии канамицина, образуют черный пигмент. Бактерии этой группы чувствительны еще и к ванкомицину (диски 5 мкг, BBL, Becton Dickinson).

4 группа – бактерии рода Fusobacterium. Эти бактерии не растут в присутствии желчи и канамицина, но растут в присутствии бриллиантового зеленого.

Для выявления группы Prevotella melaninogenica/ Porphyromonas asacharolytica и некоторых других строгих анаэробов (Fusobacterium spp., Clostridium dificile) первичные посевы возможно исследовать в лучах длинноволнового ультрафиолетового излучения, при использовании люминисцентного микроскопа с фильтрами ФС 1-2 и СЗС 24-4. При наличии микроорганизмов группы Pr.melaninogenica / P.asacharoliticus колонии светятся малиновым цветом. Зеленое свечение характерно для Fusobacterium spp. или Clоstridium dificile.

Финальная идентификация облигатно-анаэробных грамотрицательных бактерий проводится с применением биохимической идентификационной системы для этих бактерий API (BioMerioux), а также на полуавтоматической системе "Sceptor" (Becton Dickinson) c использованием полистироловых планшетов для грамотрицательных облигатно-анаэробных бактерий.

Грамположительные анаэробные кокки могут быть идентифицированы на основании их чувствительности к новобиоцину (диски 25 мкг) и по их биохимическому профилю с применением биохимической идентификационной системы rapid ID32 A (API – BioMerioux) или полуавтоматической системы "Sceptor" (Becton Dickinson) с использованием полистироловых планшетов для видовой идентификации грамположительных анаэробных кокков.

Ориентировочная идентификация бифидобактерий проводится микроскопическим методом (окраска мазка по Граму), который позволяет оценить морфологию клеток. В мазках бифидобактерии обычно имеют вид прямых или разветвленных палочек X,Y и V-образной формы с утолщениями на концах. Бактерии рода Bifidobacterium синтезируют фермент фруктозо-6-фосфатфосфокетолазу (Ф6-ФФК), не образуют индол и каталазу, не восстанавливают нитраты, не сбраживают адонит (рубит), дульцит, эритрит, глицерин, рамнозу и альфа-метил-D-маннозид.

Биохимическая идентификация клостридий может быть осуществлена при помощи идентификационных систем API 20A или RapID Ana II (BioMerioux).

Видовая идентификация гарднерелл проводится по морфологическим критериям (окраска по Граму – грамвариабильные коккопалочки) и на основании биохимической идентификации при помощи идентификационных систем API 20 Strep или API Zym (BioMerioux).

Ввиду отсутствия единых представлений о показателях нормы из-за, прежде всего, технической сложности культивирования облигатно-анаэробных и микроаэрофильных микроорганизмов в настоящее время не определены четкие критерии нормоценоза вагинальной микрофлоры, пограничных состояний и БВ. Чаще всего при бактериологической диагностике вагинального отделяемого используются следующие критерии:

Нормоценоз - общее количество микроорганизмов в вагинальном отделяемом составляет 10⁶-10⁸ КОЕ/мл; - абсолютное преобладание лактобактерий; - условно-патогенные микроорганизмы в низком титре - <10⁴ КОЕ/мл;

Бактериальный вагиноз - массивное микробное обсеменение вагинального отделяемого с общим количеством микроорганизмов, превышающим 10⁹ КОЕ/мл; - отсутствие лактобактерий или резкое снижение их титра до 10⁴ КОЕ/мл и менее; - полимикробный характер микрофлоры с абсолютным преобладанием облигатно-анаэробных микроорганизмов и G.vaginalis [17]. При проведении классического бактериологического исследования необходимо учитывать тот факт, что само по себе обнаружение отдельных видов облигатных анаэробов и G.vaginalis не всегда равнозначно микробиологическому диагнозу БВ, т.к. G.vaginalis и облигатно-анаэробные микроорганизмы могут быть частью индигенной микрофлоры. Поэтому, бактериологическая диагностика БВ должна, в первую очередь, основываться на интегральной оценке микрофлоры с учетом не только ее видового и количественного состава, но и количественного соотношения отдельных ее компонентов.

РЕЦЕПТЫ ОСНОВНЫХ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД

1. Мясная вода Парную говядину или конину освобождают от костей, жира, сухожилий, пропускают через мясорубку. 1 кг полученного мясного фарша заливают 2 л водопроводной воды и кипятят в течении часа, накипь снимают. После кипячения мясную воду остужают для застывания жира, который легко при этом удаляется, фильтруют через ватно-марлевый фильтр до полной прозрачности, затем доливают водопроводной водой до первоначального объема, разливают в бутыли и стерилизуют 20 минут при температуре +120⁰С.

2. Пептонная вода К 1л дистиллированной воды прибавляют 1- 2г пептона и 0,5г хлорида натрия, устанавливают необходимое значение рН,кипятят 30 минут, проверяют рН, фильтруют через бумажный фильтр до полной прозрачности и стерилизуют при температуре +120⁰С в течение 30 минут.

3. Мясо-пептонный бульон К 1 л мясной воды добавляют 1г сухого пептона и 5мг хлорида натрия, устанавливают нейтральную рН, кипятят в течении 30 минут, после чего доводят уровень воды до первоначального объема. Затем фильтруют через бумажный фильтр, окончательно устанавливают насыщенным расвором гидрокарбоната натрия или 10% раствором едкого натра требуемую реакцию, стерилизуют 15-20 минут при температуре +120⁰С. Если после стерилизации в мясо-пептонном бульоне выпадает осадок, его фильтруют вторично и снова стерилизуют. Вторичная стерилизация производится при более низкой температуре, чем предшествующая, для предотвращения выпадения осадка.

4. Мясо-пептонный агар К 1л мясной воды прибавляют 1г пептона и 0,5г хлорида натрия, кипятят на слабом огне при постоянном помешивании до полного растворения добавленных ингредиентов. Приготовленный таким образом бульон фильтруют, устанавливают слабощелочную реакцию (рН 7,2-7,4) и добавляют 0,2-2г измельченного агар-агара (в зависимости от качества агар-агара и назначения среды). После добавления агар-агара жидкость кипятят на слабом огне при постоянном помешивании до полного растворения агара. При помутнении среды ее просветляют. Приготовленный агар фильтруют или декантируют, разливают в пробирки или во флаконы и стерилизуют в автоклаве при температуре +120⁰С в течение 20 минут.

5. Сахарный бульон (бульон с глюкозой) К 1л мясопептонного бульона нейтральной реакции прибавляют глюкозу в количестве 0,25мг-2г. Перед добавлением к бульону глюкозу растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды. Приготовленную среду стерилизуют текучим паром 3 дня подряд по 30 минут или однократно в автоклаве при температуре +115⁰С 30 минут.

6. Триптический перевар Хоттингера Говяжье мясо освобождают от костей, жира, сухожилий, нарезают мелкими кусочками, взвешивают и опускают в кипящую воду из расчета 1 кг мяса на 1 л воды. Мясо кипятят в течение 15-20 минут, затем вынимают и пропускают через мясорубку. Бульон смешивают с фаршем и сливают в бутыль с таким расчетом, чтобы 1/3 бутыли оставалась свободной. К горлышку бутыли подбирают хорошо пригнанную резиновую пробирку. Смесь подщелачивают 20% раствором питьевой соды до рН 7,8-8,0, прибавляют очищенную от жира, соединительной ткани и дважды пропущенную через мясорубку поджелудочную железу в количестве 10% к имеющемуся объему (на 1 л жидкости 100 г железы). Вместо панкреатической железы можно прибавить панкреатин в количестве 0,5% и выше в зависимости от его активности. Через 1-2 часа после добавления фермента проверяют реакцию перевара и подщелачивают его повторно до рН 7,4-7,5. Отсутствие сдвига реакции смеси в сторону окисления после прибавления фермента указывает на его недоброкачественность. Содержание бутыли тщательно перемешивают, добавляют хлороформ из расчета 10-30 мл на каждый литр перевара. Бутыль плотно закрывают резиновой пробкой и ставят в термостат при +37⁰С на 7-10 суток. В течении первого дня содержимое бутыли перемешивают вначале каждые 15-20 минут, затем через 2-3 часа, а в последующие дни – по нескольку раз в день, открывая при этом пробку для выхода избытков паров хлороформа. При стоянии в термостате мясо ферментируется, преврящаясь в однородный осадок серовато-желтого цвета, а жидкость из мутно-серой становится совершенно прозрачной, соломенно-желтого цвета. Об окончании переваривания судят по образованию триптофана, обнаруживаемого следующим образом: в пробирку наливают 3-4 мл фильтрованного перевара, добавляют 3-4 капли бромной воды. При наличии триптофана жидкость принимает розово-фиолетовый цвет. Приготовление бромной воды. На 100 мл дистиллированной воды берут 3-3,5 мл чистого брома для получения насыщенного раствора. Хранят в склянке темного стекла. 7. Кровяной агар Расплавляют 1л 2% мясо-пептонного стерильного агара, охлаждают его до температуры +45⁰С и прибавляют 5-10мл дефибринированной стерильно взятой крови лошади, кролика или барана. Добавление крови производят, соблюдая правила стерильности. Готовую среду разливают в стерильные чашки Петри (предварительно нагретые в термостате), дают ей застыть и подсушивают в термостате. Слой агара должен быть равномерно окрашен в красный цвет.

8. Бульон на переваре Хоттингера Для приготовления бульона основной перевар Хоттингера разводят в несколько раз дистиллированной или водопроводной водой, добавляя на 1л бульона 0,5мг хлорида натрия, 1мг двузамещенного фосфата калия, устанавливают рН 7,4-7,6 и кипятят 15-20 минут. Приготовленный таким образом бульон фильтруют через ватно-марлевый или бумажный фильтр, разливают во флаконы или пробирки и стерилизуют при температуре +120⁰С в течение 20-30 мин.

9. Желточно-солевой агар (Чистовича) Для приготовления желточно-солевого агара готовят впрок мясо-пептонный агар (рН 7,2-7,4) с содержанием 10% хлорида натрия. После разливки во флаконы по 100-200 мл агар стерилизуют в автоклаве в течение 20 минут при температуре +120⁰С. Перед употреблением расплавливают, охлаждают до +45-50⁰С и добавляют 20% по объему) стерильной желточной взвеси (1 желток куриного яйца на 150-200 мл стерильного изотонического раствора хлорида натрия). Среду быстро помешивают, разливают в стерильные чашки, которые продолжительное время могут сохраняться в холодильнике.

10. Молочно-солевой агар К 1л расплавленного мясо-пептонного агара рН 7,2-7,4, содержащего 5-7,5г хлорида натрия, добавляют 10мл стерильного теплого хорошо обезжиренного молока, тщательно перемешивают и разливают в чашки.

11. Среда Эндо Мясо-пептонный (100 мл) агар рН 7,4 растапливают и охлаждают до температуры +70⁰С, прибавляют 1 г лактозы, предварительно растворенной в стерильной пробирке в небольшом количестве дистиллированной воды и прокипяченной. В отдельных пробирках приготовляют: 2-3 мл спиртового насыщенного основного фуксина; 10 мл 10% водного раствора сульфида натрия. В стерильную пробирку отмеривают 1 мл фуксина и прибавляют раствор сульфида натрия до обесцвечивания фуксина (бледно-розовый цвет). Приготовленную смесь вливают в растопленный агар, хорошо перемешивают и разливают по чашкам. Горячий агар имеет бледно-розовый цвет, а при застывании становится бесцветным. Среду готовят в день ее использования.

12. Среда Ресселя К 100 мл мясо-пептонного агара (рН 7,2) прибавляют 1г лактозы, 1г глюкозы и 1 мл индикатора Андреде. Среду разливают в пробирки в количестве 5-6 мл, стерилизуют в автоклаве при +112⁰С в течение 20 минут и скашивают так, чтобы на 2-3 см от дна пробирки агар оставался в виде столбика. Ферментацию лактозы определяют по появлению малиновой окраски соответственно добавленному индикатору Андреде в скошенной части среды, сбраживание глюкозы – по окраске столбика. При сбраживании лактозы и глюкозы происходит резкое покраснение всей среды: столбика и скошенной его части. Характер изменения цвета среды Ресселя определяется не одинаковой интенсивностью расщепления микроорганизмами азотистых веществ и образованием щелочных продуктов в аэробных и анаэробных условиях. Газообразование в среде определяют по вспениванию конденсационной жидкости на дне пробирки, а также по образованию трещин и разрывов в агаре.

13. Цитратный агар Симмонса Растворяют в 1 л дистиллированной воды сульфата магния 2мг, фосфата натрия-аммония 1,5 г, одноосновного фосфата калия 1 г, цитрата натрия кристаллического 3 г, Смесь стерилизуют в автоклаве. Прибавляют 20 г агар-агара, нагревают до его расплавления, устанавливают рН 7,2 и затем прибавляют 1 мл 1,5% спиртового раствора бромтимолового синего.

14. Среда Сабуро Помещают 18 г агара в 1 л дистиллированной воды и дают ему набухать 30 мин, нагревают, помешивая, пока не растворится агар, добавляют 10 г пептона и 40 г глюкозы или мальтозы. Стерилизация среды проводится в течение 15 мин при +115⁰С.

15. Среда Китта-Тароцци Печень животного, обычно говяжью, нарезают кусочками по 1,0-1,5 г, прибавляют по весу тройное количество мясо-пептонного бульона или бульона Хоттингера нейтральной реакции, кипятят 30 минут. Бульон отфильтровывают, печень промывают под краном на сите. Отфильтрованный бульон разливают по 7-10 мл в пробирки. В каждую пробирку кладут по 4-5 кусочков отмытой печени. Бульон сверху заливают слоем вазелинового масла и стерилизуют в автоклаве при давлении 0,5 атм 30 минут.

16. Кровяной агар Цейсслера К 1л 3% мясо-пептонного агара прибавляют 1г глюкозы, устанавливают рН 7,2, разливают во флаконы по 100 мл, стерилизуют при давлении 0,5 атм 30 минут. Перед употреблением к расплавленной и охлажденной до +45⁰С среде прибавляют 20мл свежей дефибринированной крови. Среду разливают в чашки Петри.

17. Кровяной сахарный агар Агар 2% на бульоне Хоттингера в объеме 100 мл расплавляют и охлаждают до +45⁰С, после чего добавляют к нему 10-15 мл свежевзятой стерильной дефибринированной крови кролика, барана или крупного рогатого скота и 10 мл 20% стерильного раствора глюкозы. Смесь взбалтывают так, чтобы не образовалось пузырей пены, и разливают по чашкам.

РЕЦЕПТЫ ИНДИКАТОРОВ

1. Индикатор бромтимоловый синий Бромтимоловый синий позволяет определить изменение реакции среды в пределах рН 6,0-7,6. В щелочной зоне рН 7,6 индикатор имеет синий цвет, в кислой зоне рН 6,0 – желтый. При изменении рН в указанном диапазоне бромтимоловый синий изменяет окраску через различные оттенки зеленого цвета. В нейтральной точке рН 7,0 индикатор имеет характерный, легко запоминающийся травянистый оттенок. В работе применяют раствор бромтимоловый синий, приготовленный по следующей прописи. Бромтимоловый синий 0,4 г растворяют в 40 мл дистилированной воды, нагревая ее до кипения. После этого к раствору прибавляют 6,4 мл децинормального раствора едкого натра, в результате чего жидкость приобретает зеленоватый цвет, и доливают дистиллированной водой до 100 мл. Приготовленный таким образом индикатор может сохраняться в темном месте в склянке, закрытой притертой пробкой в течении длительного времени.

2. Индикатор Андреде Фуксина кислого 0,5 г растворяют в 16,4 г N раствора гидрата окиси натрия, прибавляют 100 мл дистиллированной воды, настаивают 24 часа при +37⁰С, стерилизуют при температуре +100⁰С в течение 5 минут. Сохраняют во флаконах темного стекла с притертой пробкой. Приготовленной таким образом индикатор имеет соломенно-желтый цвет. При смещении рН в кислую зону индикатор Андреде приобретает ярко-малиновый цвет.

3. Индикаторная бумага на сероводород Для выявления сероводорода полоски фильтровальной бумаги смачивают в растворе следующего состава: - дистиллированная вода 100 мл - ацетат свинца 20 г - бикарбонат натрия 1 г. Бумагу высушивают, нарезают полосками шириной 0,2-0,4 мм и длинной 5-6 см. Перед употреблением бумага бесцветна, а при образовании микробной культурой сероводорода приобретает черно-бурый цвет.

4. Индикаторная бумага на индол Полоски фильтровальной бумаги пропитывают следующим реактивом: парадиметиламидобензальдегид – 5г, спирт этиловый 96% - 50 мл, фосфорная кислота (очищенная концентрированная) – 10 мл. После растворения порошка полученной тепловатой жидкостью смачивают полоски фильтровальной бумаги, высушивают и хранят их в банке темного стекла. Цвет бумажек желтый, при наличии индола – серовато-розовый до интенсивного малинового.

5. Индикатор для обнаружения оксидазы Нафтола 30-40 мг растворяют в 2,5 мл этилового спирта-ректификата, добавляют 7,5 мл дистиллированной воды и расворяют 40-60 мг диметил-П-фенилендиамина.

РЕЦЕПТЫ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФЕРМЕНТАЦИИ УГЛЕВОДОВ

Цветные среды Гисса с углеводами К 100 мл дистиллированной воды добавляют 1 г пептона, 0,5 г хлорида натрия. Пептон и соль растворяют при нагревании воды в течение нескольких минут, фильтруют через бумажный фильтр так, чтобы раствор был совершенно прозрачным, устанавливают рН 7,0-7,4, прибавляют 0,5-1 г одного из необходимых углеводов (лактоза, глюкоза, сахароза, маннит и т.д.), а затем индикатор Андреде в количестве 1 мл на 100 мл среды или 0,1 мл 1,6% раствора индикатора бромтимолового синего.

Готовую среду разливают по 3 мл в пробирки, простерилизованные вместе с поплавками, расположенными запаянным концом кверху. Среду стерилизуют текучим паром 3 дня подряд по 30 или 20 минут при температуре +112⁰С. Во время стерилизации поплавки заполняются доверху питательной средой. Основой сред, применяемых для определения ферментации углеводов, является пептонная вода. Мясной бульон для этой цели не пригоден, так как он содержит различные углеводы, что может привести к получению неправильных результатов. Среды Гисса с индикатором Андреде имеют соломенно-желтый цвет, с индикатором бромтимоловым синим – болотно-зеленый (рН 7,0-7,2). В результате роста бактерий, сопровождающегося расщеплением углевода с образованием кислых продуктов, цвет среды изменяется: в первом случае она приобретает ярко-розовый цвет; во втором – желтый. Образование газа в среде определяют по наличию пузырьков газа, собирающихся в поплавке.

МЕТОД ГАЗОЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

Использование метода газожидкостной хроматографии при диагностике БВ основано на идентификации группы веществ – продуктов метаболизма микроорганизмов, связанных с БВ, и микроорганизмов, присутствующих в норме. К числу таких метаболитов относят летучие жирные кислоты (уксусная, изопропионовая, пропионовая, изомасляная, масляная, изовалериановая, валериановая) и нелетучие органические кислоты (молочная и янтарная).

В качестве материала для исследования используются смывы вагинального отделяемого в физиологическом растворе. Для этого во влагалище вводится 3 мл стерильного физиологического раствора, делается смыв вагинального содержимого со стенок влагалища ватным микробиологическим тампоном и переносится в пробирку с притертой пробкой. Для анализа летучих жирных кислот готовятся их эфирные экстракты. К 1 мл образца добавляется 0,5-1 мл диэтилового эфира и экстрагируется в пробирке со шлифом в течении 1 минуты с помощью миницентрифуги "Vortex". После этого эфирный экстракт отделяется, использованием пастеровской пипетки с небольшим количеством безводного сульфата магния. Для анализа нелетучих компонентов образец подвергается метилированию: к 2 мл смыва добавляют 4 мл метанола, пробирку закрывают пленкой и на 45 минут помещают в морозильную камеру при температуре –20⁰С. Далее жидкость переливается в герметическую пробирку и к ней добавляется 0,2 мл 50% раствора серной кислоты, после чего пробирка выдерживается в течении 30 минут при +80⁰С. По завершении процесса этерификации содержимое пробирки охлаждается проточной водой и в нее добавляется 2 мл дистиллированной воды. Для экстракции летучих эфиров используется 1 мл хлороформа. 1 мкл подготовленных экстрактов вводится в инжектор-хроматограф с помощью микрошприца. В качестве эталона используются экстракты водных растворов летучих жирных кислот и нелетучих органических кислот (внешний стандарт). Для проведения газожидкостной хроматографии возможно использование хромотографа "Chrom-5". Хромотограф "Chrom-5" оснащен пламенноионизационным детектором и стеклянными колонками, заполненными сорбентом FFAP 15% на Chromosorb W, 80-100 mesh. Рабочие условия: температура испарителя - +190⁰С, термостата - +50⁰С, детектора - +250⁰С. Скорость газа-носителя (азота) и водорода 30 мл в минуту, воздуха – 300 мл в минуту. Идентификация анализируемых веществ проводится с учетем времени их удерживания, а концентрации анализируемых веществ определяются по площади пика на хромотограмме. Интерпритация результатов проводится в соответствии с руководствами по микробиологии и хроматографии. Метод газожидкостной хроматографии позволяет сравнить содержание в вагинальном отделяемом основных продуктов метаболизма лактобактерий и облигатно-анаэробных микроорганизмов – молочной и янтарной кислот. В норме соотношение янтарной и молочной кислот составляет 0,4, а при БВ более 0,4.