Методические указания по индикации chlamydia psittaci методом полимеразной цепной реакции

1. Введение

Хламидиозы (Chlamydioses) – группа разнообразных по проявлению контагиозных болезней млекопитающих, птиц и человека, вызываемых хламидиями.

Хламидии – бактерии с характерной для прокариотов структурой, имеющие вид мелких грамотрицательных кокков, содержащие ДНК и РНК, обладают уникальным циклом внутриклеточного развития, включающего две формы (стадии) жизненного существования микроорганизма: элементарное тельце (ЭТ) – высокоинфекционная форма возбудителя размером 250-300 нм и ретикулярное (инициальное) тельце (РТ) – малоинфекционная форма размером 600-1500 нм. Также были обнаружены промежуточные стадии – переходные тельца.

Проникновение ЭТ в клетки хозяина происходит за счет фагоцитоза. В начальной стадии инфицирования ЭТ становится инициальными (вегетативная форма), которые путем почкования или фрагментации материнской клетки реорганизуются в элементарные (споровая форма). Все эти процессы протекают внутри вакуоли клетки-хозяина. Затем ЭТ освобождаются из фагосом и инфицируют другие клетки-мишени. В зависимости от условий паразитирования цикл развития микроорганизма колеблется от 24 до 48 часов.

На основе такого уникального цикла развития эти микроорганизмы, согласно решению юридической комиссии Международной ассоциации микробиологических обществ от 1 января 1980 года, выделены в самостоятельный порядок Chlamydiales, семейство Chlamydiaceae, род Сhlamydia. В настоящее время известно 4 вида этих микроорганизмов: C. psittaci, С trachomatis, C. pneumoniae и C. pecorum.

К виду C. psittaci относятся возбудители пситтакоза (орнитоза), конъюнктивитов, энтеритов, аборта, полиартритов и энцефалитов сельскохозяйственных, домашних и диких животных, которые не редко являются источниками возбудителя инфекции человека.

2.Сущность метода

В 1983 году К.Мюллис (Cetus Corporation, США) открыл принцип избирательного умножения нуклеотидных последовательностей, а в 1984 году исследователи этой корпорации разработали метод ПЦР, позволяющий всего за несколько часов получать миллионы копий выбранного фрагмента ДНК. Для амплификации специфического ДНК-фрагмента методом ПЦР достаточно знать нуклеотидную последовательность двух коротких участков ДНК, окаймляющих фрагмент-мишень. На основе этих последовательностей химически синтезируют два олигонуклеотида (праймера), которые необходимы для инициации полимеризации ДНК в каждом цикле ПЦР. Длина праймеров (обычно 20-30 нуклеотидов) должна быть такой, чтобы их последовательность была статистически уникальна и не встречалась в других участках ДНК, присутствующей в реакционной смеси. ПЦР включает серию повторяющихся циклов, каждый из которых начинается со стадии денатурации молекулы ДНК. На первой стадии при нагревании реакционной смеси до 96°С разрываются водородные связи, соединяющие спиральные цепи. На второй стадии температуру реакционной смеси понижают до заранее определенных значений, соответствующих температуре отжига праймеров, что приводит к комплементарному их взаимодействию с последовательностями, окаймляющими фрагмент-мишень. Третьей стадией является элонгация праймеров в сторону фрагмента-мишени под действием ДНК-полимеразы. Продолжительность реакции обычно составляет 30-40 циклов. Поскольку число молекул ДНК удваивается в каждом цикле, то многократное их повторение приводит к экспоненциальному нарастанию (амплификации) количества специфических фрагментов ДНК (ампликонов), которое затем выявляют методом электрофореза или гибридизации с меченым ДНК-зондом.