3. Область применения

Методические указания предназначены для выявления ДНК C. psittaci в биологических материалах – кровь, моча, конъюнктивальные или клоачные соскобы (отделяемое слизистых оболочек), фаренгиальные смывы, сперма, биоптаты (кусочки паренхиматозных органов), фекалии.

4. Количество реактивов и их концентрации

1. Термостабильная ДНК-полимераза. 100 мкл раствора ДНК-полиме­разы в концентрации 5 ед./мкл – 1 шт.

2. Смесь нуклеотидов (dNTP). 0,5 cм3 водного раствора дезоксинуклеотидтрифосфатов в концентрации 2,5 мМ каждого – 1 шт.

3. Смесь праймеров, специфичных для фрагмента генома Chlamydia psittaci по 0,5 cм³, концентрация 4 пмоль/мкл каждого праймера – 1 шт.

4. 5-кратный реакционный буфер, 1 см³– 1 шт.

5. Бромид этидия, 1%ный, 0,5 см³– 1 шт.

6. Лизирующий раствор – гуанидин тиоцианат 5,3 моль/л, 30 cм3 – 1 шт.

7. Суспензия сорбента, 2 cм3 – 1 шт.

8. Отмывочный раствор, 1, 30 cм3 – 1 шт.

9. Концентрат для отмывочного раствора, 2, 20 cм3 – 1шт.

10. Положительный контроль – водный раствор ДНК из штамма Chlamydia psittaci в концентрации 0,1 мкг/мкл, 0,1 см³– 1 шт.

11. Отрицательный контроль – деионизированная вода, 0,1 см³– 1 шт.

12. Воск для ПЦР 1 см³– 2шт.

13. Минеральное масло, 2 cм³вазелинового масла – 2 шт.

14. Агароза для электрофореза, 10г – 1 шт.

15. Смесь сухих реактивов для приготовления 2000 см³1-кратного буфера – 1шт.

5. Этапы работы

Тест-система предназначена для идентификации C. psittaci методом ПЦР. В состав тест-системы входят:

1) набор для выделения ДНК, «ДНК-сорб-ПЦР»,

2) набор для ПЦР-амплификации участка ДНК C. psittaci,

3) набор для электрофоретического анализа продуктов ПЦР.

5.1. Этап 1. Подготовка проб (выделение днк).

НЕОБХОДИМОЕ ОБОРУДОВАНИЕ:

• Термостат для пробирок типа «эппендорф» на 25 – 100°С.

• Центрифуга настольная типа «ОПН-300».

• Микроцентрифуга для пробирок типа «эппендорф».

• Вортекс-«миниген» или «микроспин».

• Отдельный набор автоматических пипеток переменного объема.

• Отдельный халат и одноразовые резиновые перчатки.

• Одноразовые полипропиленовые завинчивающиеся пробирки на 1,5; 5 и 10 см³.

• Одноразовые наконечники для пипеток переменного объема с аэрозольным барьером.

• Холодильник на 4 °С и на минус 20 °С.

Клинический материал – кровь, моча, соскобы (отделяемое слизистых оболочек), фаренгиальные смывы, сперма, биоптаты (кусочки паренхиматозных органов), фекалии – берут только одноразовыми инструментами в одноразовые пластиковые пробирки с крышками (кровь забирается в пробирку с 1/10 объема 3%-ного ЭДТА), упаковывают в отдельные пакеты с номерами или надписями и доставляют в лабораторию в емкости со льдом в течение суток. Хранить материал можно не более суток при 4°С и длительно в морозильнике. Допускается только однократное замораживание – оттаивание материала.

Предварительная обработка материала:

10 см³мочи или фаренгиальный смыв центрифугировать при 3000 об/мин в течение 10-15 мин. Супернатант осторожно слить, но не полностью, так чтобы над осадком осталось примерно 0,5 мл жидкости.

Осадок суспендировать в оставшейся надосадочной жидкости и перенести в пробирку на 1,5 см³. Суспензию центрифугировать на микроцентрифуге при 11 тыс. об/мин в течение 3 мин. Супернатант отбросить, осадок использовать для выделения ДНК.

2. Пробирку, содержащую сперму, растворенную в 0,5 см³физиологического раствора, центрифугировать на микроцентрифуге при 5 тыс. об/мин в течение 3 мин. Осадок отбросить, супернатант использовать для выделения ДНК.

3. Пробирку, содержащую соскоб со слизистой оболочки, растворенный в 0,5 см³физиологического раствора, центрифугировать на микроцентрифуге при 11 тыс. об/мин в течение 3 мин. Супернатант отбросить, осадок использовать для выделения ДНК.

4. В пробирку, содержащую предварительно измельченный кусочек паренхиматозного органа внести 0,5 см³физиологического раствора и центрифугировать на лабораторной центрифуге при 1 тыс. об/мин в течение 10 сек. Супернатант использовать для выделения ДНК, осадок отбросить.

5. В пробирку, содержащую 0,5 см³физиологического раствора внести кусочек фекалий и центрифугировать на лабораторной центрифуге при 2 тыс. об/мин в течение 10 сек. Супернатант использовать для выделения ДНК, осадок отбросить.

Выделение ДНК из 100 мкл предварительно подготовленного клинического материала проводят с помощью набора «ДНК-сорб-ПЦР».