Состав набора (на 100 анализов):

Агароза для электрофореза...........................................................10 г.

Реактивы для приготовления 2000 см³1-кратного буфера.........1 шт.

Бромид этидия, 1%ный...................................................................0,3 cм³.

Порядок работы:

1. Смесь сухих реактивов растворить в 2000 см³дистиллированной воды. Добавить 200 мкл 1%-ного бромида этидия и все перемешать. Полученный раствор хранится при комнатной температуре в темном месте (т. к. бромид этидия выгорает на свету).

2. Если в лаборатории проводится небольшое количество анализов, то буфер смешивать с бромидом этидия следует небольшими порциями.

3. Взвесить 1,8 г агарозы, пересыпать в стеклянную колбу из термостойкого стекла, налить 100 см³готового 1-кратного буфера и плавить на электроплитке до полного растворения агарозы, после этого покипятить агарозу еще 5 мин. и немного остудить вращая колбу.

4. Залить расплавленного геля в подложку камеры столько, чтобы его толщина была 4,5-5,5 мм. Поставить гребенки на расстоянии друг от друга не менее 4 см, глубина лунок при этом должна быть 3,5-4,5 мм.

5. После полного застывания геля, осторожно вынуть из него гребенки, стараясь не повредить лунки. Поместить подложку с готовым гелем в камеру, лунки должны располагаться ближе к отрицательному электроду. ДНК, соответственно, движется к положительному. Залить в камеру 1-кратный буфер так, чтобы он покрывал гель на 4 – 5 мм.

6. Пробирки с продуктами амплификации выставить последовательно, отобрать из под слоя масла по 10 – 15 мкл и внести пробы в лунки геля (если для нанесения разных проб используется один и тот же наконечник, то его необходимо промывать буфером из камеры после нанесения каждой пробы).

7. Подключить камеру к источнику тока, соблюдая полярность и включить источник. Если нет нарушения контактов, то при прохождении тока от электродов должны подниматься пузырьки. Оптимальное напряжение 100 – 150 В.

8. Когда краситель (ксиленцианол) пройдет примерно 1 см от лунки, выключить источник, перенести гель на трансиллюминатор и рассматривать расположение полос ДНК в ультрафиолетовом свете. (Глаза и лицо должны быть защищены специальной маской или стеклянной пластиной). Элекрофореграмму следует сфотографировать на чувствительную пленку типа «Микрат 300» или зарисовать.

6. Учет и интерпретация результатов

В дорожке соответствующей положительному контролю должна быть специфическая светящаяся полоса оранжевого цвета, соответствующая фрагменту генома Chlamydia psittaci в 1033 пар нуклеотидов. Положительные образцы должны содержать специфическую светящуюся полосу большей или меньшей интенсивности строго на том же уровне, что и полоса в положительном контроле.

Отрицательный контроль, как и отрицательные образцы не должны содержать каких-либо полос, за исключением нечетких утолщенных полос праймер-димеров, которые располагаются в нижней части геля ниже уровня 100 нуклеотидных пар.

При работе с материалом, содержащим большое количество клеток, например кровь или биоптат, в ПЦР участвует большое количество неспецифической геномной ДНК (до 5 мкг в 50 мкл амплификационной смеси), при этом в дорожках геля появляются характерные шмеры, равномерно располагающиеся от лунки до самого низа дорожки или концентрирующиеся около лунки. На фоне такого шмера в положительном образце видна специфическая полоса, а в отрицательном образце полоса отсутствует.

Методические указания по индикации Chlamydia psittaci методом ПЦР утверждены Департаментом ветеринарии 20.11.97.

Тест-система для выявления Сhlamydia psittaci у птиц и млекопитающих методом ПЦР утверждена Департаментом ветеринарии 27.05.96 ТУ‑9388‑033‑00008064‑96.