Биохимия пособие Коновалова 2012

ш стадия: ЕР — ►Е+Р происходит очень быстро, выделяется пр0ДуКГ реакции, а фермент выделяется в неизменном количестве и

качестве.

4. факторы, влияющие на скорость ферментативных реакций

1.Концентрация субстрата

В1913 г. Михаэлис и Ментен показали, что скорость фермента­

ци й реакции изменяется не пропорционально концентрации субстра­ та При увеличении концентрации субстрата и постоянной концентрацлл фермента скорость вначале увеличивается линейно (а - реакция первого порядка), затем переходит в реакцию смешанного порядка (Ь), затем стремится к максимальной скорости (с —реакция нулевого поряд­

ка).

Для участка «а» было предло­ жено уравнение Михаэлиса-Ментен

__ Vmax• [S]

Ks +[S]

Преобразуем уравнение делением

/с,ч Vmax

на (S): v = — — , Ути - максимальная

1 + ^ ’

[S]

скорость, [S] - концентрация субстрата, К* —константа диссоциации фермент-субстратного комплекса.

Бриггс и Холдейн модифицировали это уравнение для всей

кривой - V = Vmax	, введя константу Михаэлиса Кт.
i+ Km

[S]

К т - численно равна концентрации субстрата, при которой ско­ рость реакции равна половине максимальной величины. Кт выражается в единицах концентрации субстрата, действительно, если Km = [S], то по Уравнению V = Vmax / (1+1)= Умах/2.

IQn - эго мера сродства данного субстрата к ферменту: если Кт велика, это означает, что потребуется много субстрата для достижения ^■^иих (реакция идет медленно); низкая величина Кга указывает на то, что доя насыщения фермента достаточно небольшого количества субстрата. Итак, величина К„, большая - низкое сродство субстрата к ФеРменту, Кш малая - высокое сродство субстрата к ферменту.

51

г

Нахождение величины Кт по кривой уравнения Бриггса и Холдейна неточное. Поэтому Лайнуивер и Бэрк преобразовали уравнение Бриггса и Холдейна по методу двойных обратных величин:

1	Km	1
— =	--------------j---------
V	Vmax• [S]	Vmax

В соответствии с этим уравнением строим график в координатах 1/V и 1/(S). Получаем прямую, тангенс угла который равен величине Km/Vmax; отрезок, отсе­ каемый прямой от оси ординат - 1/Умах; отрезок, отсекаемый от оси абсцисс - 1/Кт.

Для регуляторных ферментов с четвертичной структурой зависи­ мость скорости реакции от концентрации субстрата имеет S-образный характер вследствие кооперативного эффекта (незначительное измене­ ние концентрации субстрата приводит к резкому увеличению скорости реакции).

v А	2.	Влияние концентрации ферме
	та

у А

Vmax

При условии избытка субстрата скорость ферментативной реакции прямо пропорциональна концентрации фермента. Эта зависимость подчиняется уравнению

прямой v = к[Е].

3. Влияние температуры

Известно, что скорость химической реакции увеличивается в 2 раза при повы­ шении температуры на 10°С.

Однако, из-за белковой природы фер­ ментов, повышение температуры приведет к

37тепловой его денатурации и снижению ско­ рости реакции. Оптимальная температура —

52

та температура, при которой скорость реакции максимальна. Для Т е н т о в растений tDПТ 45-50°С, ферментов теплокровных - 37°С. ФеР точение: миокиназа мышц выдерживает нагревание до 100°С.

~JL 4 . Влияние pH среды

Ферменты, как и белки, Углах имеют заряженные группы. Об­ щий заряд молекулы фермента за­ висит от pH среды. Зависимость скорости ферментативной реакции от величины pH носит колоколо­ образный характер. Любые откло­ нения вправо и влево от оптимума pH изменяет заряд фермента, вплоть до достижения ИЭС, что

приводит к потере каталитических свойств. Большинство ферментов проявляет максимальную активность в узком диапазоне pH. Для боль­ шинства ферментов крови оптимум pH-7,4. Для некоторых ферментов оптимум pH находится в кислой либо щелочной среде. Например, для пепсина оптимум pH-1,5, для трипсина - 8,6.

Лекция 4

РЕГУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ. МЕДИЦИНСКАЯ

этимология

Способы регуляции активности ферментов

Активность ферментов, а значит и скорость химической реакции, можно регулировать, изменяя следующие параметры:

1)Абсолютное количество фермента.

2)Условия протекания реакции (pH, t, р), количество субстрата, на­ личие активаторов, ингибиторов.

3)Каталитическую эффективность фермента.

1. Регуляция количества ферментов

Абсолютное количество фермента в клетке определяется скоро­ дами его синтеза и распада.

В клетке существует два вида ферментов:

53

1.Конститутивные ферменты —всегда присутствуют в клетках данного организма. Они являются обязательными компонентами клет­ ки, синтезируются с постоянной скоростью в постоянных количествах.

2.Адаптивные ферменты —их образование зависит от условий складывающихся в клетке. Среди них выделяют индуцируемые и репрессируемые ферменты.

Индуцируемыми обычно бывают ферменты с катаболической функцией (катаболизм — процессы распада). Их образование может быть вызвано или ускорено субстратом данного фермента.

Репрессируемыми обычно бывают анаболические ферменты (ана­ болизм - процессы синтеза). Ингибитором (репрессором) синтеза ферментов может быть конечный продукт данной ферментативной реакции.

2. Влияние активаторов и ингибиторов на активность ферментов

Активаторы ферментов

Активаторы ферментов - вещества, которые разными путями повышают способность ферментов ускорять реакцию.

Свойства активаторов:

1.Формируют активный центр фермента (Со2+, Mg2*, Zn2+, Fe2+, Си2*).

2.Облегчают образование фермент-субстратного комплекса (Mg2*, Мп2*).

3.Стабилизируют нативную структуру фермента.

4.Защищают функциональные группы активного центра от по­ вреждения, например, восстанавливают SH-группы активного центра (глутатион, цистеин).

5.Воздействуют на субъединицы молекулы фермента (протеинкиназа регулируется цАМФ).

Активаторами обычно бывают катионы (в таблице Менделеева с 19 по 30), реже анионы. Исключение: ионы хлора и анионы других га­ логенов активируют пепсин, амилазу, аденилатциклазу. Активаторами могут быть белки: апопротеины AI активирует ЛХАТ, апопротеины СИ

ЛПЛ.

Ингибиторы ферментов

Это соединения, которые взаимодействуя с ферментом, препятст­ вуют образованию нормального фермент-субстратного комплекса, уменьшая тем самым скорость реакции или прекращая её.

54

Классификация ингибиторов ферментов

Ингибиторы

неспецифические специфические

необр: атимые

конкурентные неконкурентные (изостерические) (аллостерические)

Неспецифические ингибиторы вызывают денатурацию фермента (соли тяжелых металлов, кислоты, щелочи). Их действие не связано с механизмом ферментативного катализа.

Специфические ингибиторы —их действие связано с механизмом ферментативного катализа.

При необратимом ингибировании образуется прочный комплекс фермента и ингибитора, и фермент частично или полностью теряет свою активность. Даже если удалить свободный ингибитор из среды, та часть молекул фермента, которая успела связаться с ингибитором, остается угнетенной длительное время.

Примеры необратимых ингибиторов

1.Ингибиторы металлосодержащих ферментов - HCN, KCN, СО, NaN3—дыхательные яды, они стойко меняют валентность Fe и Си, вхо­ дящих в состав ферментов дыхательной цепи, препятствуя переносу электронов на 0 2.

2.Вещества, связывающие SH группы активного центра - моноиодацетат, соединения ртути и мышьяка.

3.Вещества, связывающие ОН-группы серина в активном центре

-фосфорорганические соединения —боевые отравляющие вещества.

Вслучае обратимого действия ингибитор образует с ферментом непрочный комплекс, способный распадаться, в результате чего снова возникает активный фермент. Обратимые ингибиторы бывают конку­ рентные и неконкурентные.

Конкурентный ингибитор —эта молекула очень похожая на субстрат и фермент не может различить их, т.е. ингибитор и субстрат кон­ курируют за активный центр фермента.

Врезультате связывания конкурентного ингибитора с активным Центром фермента падает концентрация фермент-субстратных ком­ плексов и скорость реакции уменьшается, т.к. комплекс ингибитор­

55

фермент 1-Е не способен давать продукт. Однако для активного центра фермента все же лучше подходит субстрат. Поэтому при достаточно большой концентрации субстрата его молекулы начнут вытеснять ингибитор I из активного центра фермента, увеличится число молекул фермент-субстратного комплекса ES и скорость реакции увеличится. Т.е. путем увеличения концентрации субстрата можно нейтрализо­ вать действие конкурентного ингибитора и достичь максимальной скорости реакции. Однако для ее достижения потребуется гораздо большая концентрация субстрата.

Действие конкурентных ингибиторов

л<^ + 1 - > Е 1 } $ Е + Р

Е

+S—►ES —►Е + Р

Кинетика ферментативных реакций при действии конкурент­ ных ингибиторов

	В ы в о д :
	конкурентные ингибиторы
Ушах = VmaxI	увеличивают Km реакции,
К ml > Km	но не влияют на Vmax

Пример конкурентного ингибирования

56

С О О Н		С О О Н	С О О Н
1	СДГ	1	| с д г
сн2		сн	С Н у -Х -
1	- ш	’||	1
сн2		С Н	С О О Н
		1	малонат
С О О Н		С О О Н
сукцинат		фумарат

СДГ - сукцинатдегидрогеназа

Сукцинат (янтарная кислота) - истинный субстрат для фермента сукцинатдегидрогеназы, который превращает ее в фумарат.

Малонат похож по строению на сукцинат и может взаимодействовать с активным центром фермента (конкурентный ингибитор), но фумарат не образуется.

Неконкурентные ингибиторы связываются не с активным центром фермента, а с каким-либо другим участком фермента (часто с аллостерическим центром). В результате активный центр фермента свободен и к нему может присоединиться субстрат, т.е. образуется комплекс ESI.

Механизм ингибирования состоит в том, что комплекс ESI медленно образует продукт и увеличение [S] не влияет на Vmax, Vmax реакции будет снижена. Поскольку эти ингибиторы не мешают связыванию субстрата с активным центром - величина Км не меняется.

Действие неконкурентных ингибиторов

Е + S + 1 -> ESI	медленно
	------------------► Е + Р + I

Кинетика ферментативных реакций при действии конкурентных ингибиторов

57

В ы в о д :

неконкурентные ингибиторы понижают

VmaxI<Vmax

Vmax, но не влияют на Km.

KmI=Km

В медицине широко применяются антиметаболиты. Это струнтурные аналоги природных субстратов (метаболитов). Антиметаболиты выступают в роли конкурентных ингибиторов ферментов, превращаю­ щих природные метаболиты. Пример: сульфаниламидные препараты:

ПАБК —парааминобензойная кислота

SA - сульфаниламиды

Для роста и размножения бактерий необходима фолиевая кислота, которая синтезируется из ПАБК (природного субстрата) под действием фермента.

Сульфаниламиды, будучи похожими по строению на ПАБК, вы­ тесняют ее из активного центра ферментов, фолиевая кислота не синте­ зируется, микробы не размножаются.

3. Регуляция каталитической эффективности ферментов

Это все изменения активности фермента, происходящие при по­ стоянном его количестве.

58

Рассмотрим наиболее важные пути регуляции:

1. Превращение проферментов в активные ферменты. Ряд фер­ ментов (например, протеолитические) синтезируются в неактивной форме - в виде проферментов. Чтобы перейти в активную форму, про­ фермент должен подвергнуться ограниченному протеолизу (т.е. удале­ нию части полипептидной цепи). В ходе протеолиза открывается или формируется активный центр и фермент активируется. Протеолитиче­ ские ферменты синтезируются в поджелудочной железе в форме про­ ферментов (исключается самопереваривание железы), а активация про­ исходит только в желудочно-кишечном тракте при появлении пищи.

2. Химическая модификация. Это ковалентное присоединение или отщепление от фермента небольшой химической группы, что приводит к изменению активности фермента. Чаще всего к ферменту присоединя­ ется или отщепляется фосфатная группа - фосфорилированиедефосфорилирование фермента. Такой способ регуляции характерен для ферментов синтеза и распада гликогена.

Фосфорилирование и дефосфорилирование проводится разными ферментами, т.е. процесс обратим в функциональном смысле (активен

онеактивен), но не в химическом.

3.Мультиферментные комплексы. Это объединение нескольких ферментов, катализирующих многоступенчатую последовательность метаболических реакций. Пример: все ферменты синтеза жирных ки­ слот объединены в единый мультиферментный комплекс - синтаза. Адекватное взаимное расположение ферментов облегчает перенос про­ межуточных продуктов от одного фермента к другому, что ускоряет выход конечного продукта. Кроме того, такое объединение обеспечива­ ет более эффективный метаболический контроль.

4.Аллостерическая регуляция. Это регуляция путем взаимодейст­ вия эффекторов с аллостерическим центром фермента. Как правило, ал­ лостерическая регуляция характерна для ферментов, имеющих субъеди­ ничное строение. Их называют аллостерическими или регуляторныМи ферментами. Каждая субъединица такого фермента содержит свои активный и аллостерический центры. Различают гомотропные и гетеротропные регуляторные ферменты.

59

Гомотропные: субстрат служит и эффектором. Гетеротропные: эффекторы не являются субстратом.

В аллостерических ферментах активный центр одной субъедини­ цы фермента оказывает влияние на активный центр другой субъедини­ цы в той же молекуле. В результате такого взаимодействия между субъ­ единицами связывание субстрата становится кооперативным. Т.е. ки­ нетические свойства таких ферментов не описываются уравнением Ми- хаэлиса-Ментен и зависимость скорости реакции от концентрации суб­ страта имеет форму S-образной кривой, а не гиперболы. При этом не­ большое увеличение концентрации субстрата будет приводить к значи­ тельному возрастанию скорости реакции.

Для объяснения кооперативных эффектов используют 2 модели: симметричную (Моно, Уаймен, Шанжи) и последовательную (Кошланд, Немети, Филмер). Рассмотрим фермент, состоящий из двух субъединиц, имеющих свои активные центры, которые могут в третич­ ной структуре находиться в двух конформациях —R и Т. Причем если фермент находится в R (relax —расслаблять) конформации, субстрат имеет высокое сродство к ферменту, а если в Т (tense —напрягать) — низкое сродство. Из таких субъединиц возможны следующие комбина­ ции четвертичной структуры: RR; ТТ; RT.

По симметричной модели каждый мультимерный фермент мо­ жет существовать в двух разных состояниях с неодинаковой четвер­ тичной структурой, но все субъединицы в этих состояниях имеют оди­ наковую третичную структуру. Т.е. согласно этой модели возможны четвертичные структуры RR, ТТ и не может быть RT. В отсутствии суб­ страта преобладают формы ТТ. При связывании субстрата с Т- конформерами произойдет одновременный переход всех субъединиц в R-состояние, что вызовет значительное увеличение скорости реакции. По этой модели гомотропная регуляция всегда положительная, т.к. при­ соединение субстрата всегда увеличивает сродство фермента к нему - все ТТ перейдут в RR.

S+TT —»RR

Последовательная модель, кроме состояний ТТ, RR допускает существование состояния TR, когда отдельные субъединицы мультиме­ ра могут в одно и то же время иметь разные третичные структуры. При этом связывание субстрата одной субъединицей вызывает изменение третичной структуры соседней субъединицы и в результате увеличива­ ется или уменьшается их сродство к субстрату.

S+TT -> TR RR (+)

S+RR —* TR —►ТТ (-)

60