Вопрос 15.
Методы окраски микроорганизмов. Виды микроскопов, принципы их работы.
Виды микроскопов и принципы их работы:
а) Простая микроскопия (в проходящем свете).
В основном проводится при помощи иммерсионных объективов с небольшим фокусным расстоянием и высокой разрешающей способностью (около 0,2 мкм).
Техника иммерсионной микроскопии:
1) Центрируем оптическую часть объектива (устанавливаем тубус микроскопа на длину 160 мм, поднимаем конденсор до уровня предметного столика, открываем диафрагму, устанавливаем объектив x8, освещаем при помощи плоского зеркала поле зрения)
2) Наносим каплю вазелинового масла (показатель преломления которого близок к показателю преломления стекла, поэтому пучок света, вышедший за пределы предметного стекла, не рассеивается и лучи, не меняя направления, попадают в объектив) на предметное стекло с окрашенным препаратом.
3) Погружаем осторожно объектив в нанесенную каплю масла под контролем глаза.
4) Поднимая тубус, смотрим в окуляр, вначале макро-, затем микровинтом устанавливаем четкое изображение объекта.
5) По окончанию работы поднимаем тубус, снимаем препарат, салфеткой удаляем масло с объектива.
б) Темнопольная микроскопия.
Цель: изучить подвижность бактерий или обнаружить патогенные спирохеты.
Техника темнопольной микроскопии:
1) Проводят при боковом освещении с помощью осветителя или лампы.
2) Используют параболоид-конденсор (для получения яркого бокового освещения и образования темного поля зрения).
3) Исследование ведется под сухой системой, специальный объектив x40 с диафрагмой.
4) Капля материала на предметном стекле покрывается покровным стеклом, на верхнюю линзу конденсора наносится иммерсионное масло, которое должно заполнять пространство между ним и предметным стеклом, и проводится исследование.
в) Фазово-контрастная микроскопия.
Цель: увеличение контрастности изображения прозрачных объектов (МБ) для изучения деталей их внутреннего строения. Основана на том, что оптическая длина света в любом веществе зависит от показателя преломления.
Техника: использование специальной оптической системы, преобразующей фазовые колебания света в амплитудные, хорошо воспринимаемые глазом.
г) Люминесцентная (флюоресцентная) микроскопия.
Цель: 1) обнаружение живых и погибших микроорганизмов, прозрачных и непрозрачных объектов 2) установление локализации бактерий, вирусов и их антигенов
Основана на способности некоторых клеток (собственная, или первичная, флюоресценция) и красителей (наведенная, или вторичная, флюоресценция) светиться при попадании на них ультрафиолетовых лучей света. Преимущества метода: получение цветного изображения и значительной контрастности.
Техника люминесцентной микроскопии:
1) Использование обычных световых микроскопов с ярким источником света и набором светофильтров, выделяющих коротковолновую часть спектра.
2) Использование красителей, способных флюоресцировать (аурамин для туберкулезной палочки, акридин желтый для гонококков)
Простые методы окраски – использование одного вида красителя.
а) Водный фуксин Пфейффера
б) Метиленовый синий Леффлера
в) Прижизненная окраска бактерий осуществляется метиленовым синим, нейтральным красным и др. малоядовитыми красителями
После окрашивания краситель смывают, препарат промывают водой и высушивают между листками фильтровальной бумаги.
При сложных методах окраски применяют комбинацию из нескольких красителей, что позволяет дифференцировать микробы и выявить некоторые особенности их строения.
1. Окраска по Цилю-Нельсену.
Применение: выявление кислото- и спиртоустойчивых бактерий (микобактерий туберкулеза, лепры и некоторых актиномицетов).
Механизм: т.к. из-за большого количества в клеточных стенках липидов и восков данные МБ непроницаемы для большинства разведенных красителей, их окрашивают феноловым фуксином Циля с подогреванием над пламенем горелки до закипания и отхождения паров. Кислотоустойчивые МБ не обесцвечиваются в дальнейшем слабыми растворами минеральных кислот и спирта.
Диагностика: кислотоустойчивые бактерии – интенсивно красный цвет, остальные – светло-синий.
2. Окраска по Романовскому-Гимзе.
Применение: для выявления спирохет, простейших, форменных элементов крови.
Механизм: окраска сложным красителей (метиленовый синий + азур + эозин).
Диагностика: цитоплазма простейших – голубого цвета, ядра – красного, боррелии – сине-фиолетовые, трепонемы и лептоспиры – слабо розовые, эритроциты – розовые и т.д.
3. Метод серебрения по Морозову.
Применяется для выявления спирохет и вирусных включений.
Выявление включений в цитоплазме (коринебактерии дифтерии).
4. Окраска щелочным метиленовым синим по Леффлеру.
Гранулы волютина – темно-синие, бактерия – голубая.
5. Окраска по Нейссеру.
Гранулы волютина сине-черные, бактерия – желтая.
Методы выявления капсул.
6. Окраска по Бурри-Гинсу (фуксином Пфейффера).
Капсулы видны в виде светлых ореолов вокруг красных бактерий на темном фоне препарата.
7. Окраска по методу Книги.
Капсулы-ореолы имеют едва видимый фиолетовый оттенок, бактерии окрашены в интенсивно фиолетовый цвет.
8. Окраска по Леффлеру для выявления жгутиков.
Методы выявления спор.
9. Окраска по Пешкову (с метиленовым синим по Леффлеру).
Споры – голубовато-синего цвета, тело бацилл и клостридий – розового.
10. Окраска по методу Ожешки.
Споры бактерий – красного цвета, вегетативные формы – синего.
Окраска по Граму.
Применение: позволяет установить родовую и видовую принадлежность многих возбудителей инфекционных заболеваний (все болезнетворные кокки, кроме гонококка и менингококка, бациллы и клостридии – Грам+, энтеробактерии, вибрионы, трепонемы – Грам-).
Механизм окраски: основана на разном содержании пептидогликана в оболочках различных прокариот. Грам+ бактерии прочно удерживают анилиновые красители и не обесцвечиваются спиртом, поэтому окрашиваются генцианвиолетом в фиолетовый цвет вследствие образования нерастворимого в спирте комплекса генцианвиолета с иодом. Грам- бактерии после обесцвечивания спиртом докрашиваются водным раствором фуксина в розовый цвет.
Техника окраски:
1. Фиксированный мазок окрашивается 1-2 мин раствором генцианвиолета (мазок можно покрыть полоской фильтровальной бумаги, пропитанной красителем – метод Синева).
2. Слив генцианвиолет или сняв полоску бумаги, мазок обрабатываем раствором Люголя в течение 1 мин.
3. Не промывая водой мазок, сливаем раствор Люголя.
4. Обесцвечиваем мазок спиртом в течении 0,5 мин и промываем его водой.
5. Окрашиваем мазок фуксином Пфейффера в течение 1-2 мин, краситель смываем водой.
6. Высушиваем препарат фильтровальной бумагой и микроскопируем его иммерсионной системой.
Диагностика: Грам+ бактерии – фиолетовые, Грам- бактерии – розовые.