Сизенцов А.Н. Общая вирусология с основами таксономии вирусов позвоночных

· результатам электронно-микроскопического изучения морфологии виру-

сов;

· вирусиндуцированным патологическим изменениям в чувствительных живых системах.

10.3.2.2 Идентификация по антигенной структуре

Реакция нейтрализации (РН).

С помощью РН идентифицируются вирусы, выделенные из материала боль-

ных при заражении им культуры клеток, куриных эмбрионов и животных. В таких случаях к вируснейтрализующим сывороткам прибавляют питательную среду из культуры клеток, вируссодержащие жидкости эмбрионов и взвеси пораженных ор-

ганов животных. После определенного времени инкубации смесями инфицируют культуры клеток, куриные эмбрионы и животных.

РН основана на способности специфических антител достаточно прочно -со единяться с вирусной частицей. В результате взаимодействия между вирусом и ан-

тителом происходит нейтрализация инфекционной активности вируса вследствие блокады антигенных детерминант, ответственных за соединение вирусной частицы с чувствительными клетками. В результате вирус утрачивает способность размно-

жаться в чувствительной к нему биологической системе in vitro или in vivo.

Результаты РН становятся очевидными после того, как смесь вируса и гомоло-

гичных ему антител после определенной по времени экспозиции будет внесена в чувствительную биологическую систему(тканевая культура клеток, куриный эм-

брион, организм восприимчивого животного), где вирус может размножаться и вы-

зывать поддающиеся учету изменения, которые будут подавлены частично или пол-

ностью в присутствии антител.

В РН участвуют 3 компонента:

а) вирус;

б) сыворотка, содержащая антитела;

в) биологический объект (лабораторные животные, развивающиеся куриные

281

эмбрионы, тканевые культуры), выбор, которого зависит от вида вируса, с которым предполагается проводить исследования.

Перед постановкой РН необходимо приготовить вируссодержащую суспензию из выделенного возбудителя или из известного лабораторного штамма(при титро-

вании сывороток). В зависимости от вида вируса его выращивают в культурах тка-

ни, в органах лабораторных животных или в куриных эмбрионах. Для РН использу-

ют полученные в результате этого культурные жидкости, суспензии органов лабора-

торных животных, аллантоисную и амниотическую жидкости куриных эмбрионов.

В зависимости от целей, стоящих перед исследователем, РН используют либо для идентификации выделенного неизвестного возбудителя, либо для обнаружения и титрования антител в сыворотках. В первом случае пользуются сыворотками спе-

циально иммунизированных лабораторных животных или переболевших людей. Во втором случае используют сыворотки, взятые в начальной стадии болезни и в пери-

од реконвалесценции.

При идентификации выделенных возбудителей пользуются заранее приготов-

ленными гипериммунными сыворотками различных животных: кроликов, белых крыс и мышей, морских свинок, обезьян, баранов, лошадей и т.д. Активность гипе-

риммунных сывороток для РН зависит от способа иммунизации животных.

Взаимодействуя с организмом, вирусы вызывают образование антител, кото-

рые, адсорбируясь на вирионах, препятствуют их проникновению в клетки и разви-

тию цитопатического действия (ЦПД); нейтрализуют смертельное действие вирусов при репродукции их в куриных эмбрионах и организме животных; инактивируют вирионные гемагглютинины и нейраминидазы, предотвращая реакцию гемагглюти-

нации (РГА) и реакцию гемадсорбции (РГАд) на пораженных вирусом клетках. Эти вируснейтрализующие антитела вызывают также агглютинацию и преципитацию вирусных частиц, а образующиеся при этом иммунные комплексы связывают ком-

племент. В связи с этим для идентификации вирионов используется классическая реакция нейтрализации (РН) па культурах клеток, куриных эмбрионах и животных и ее модификации: реакция торможения гемагглютинации (РТГА); реакция торможе-

ния гемадсорбции (РТГАд). Те же реакции используются в серодиагностике вирус282

ных инфекций для обнаружения в сыворотке больных вируснейтрализующих анти-

тел по известному вирусному антигену (диагностикуму).

Реакция задержки (нейтрализации) цитопатического действия вирусов

(РЗЦПД). Реакция нейтрализации цитопатического действия вирусов воспроизво-

дится в чувствительных к вирусу живых системах. РН основана на нейтрализации инфекционной активности вирусов при связывании со специфическими противови-

русными антителами.

Из материала, содержащего вирус, готовят серийные разведения и добавляют к ним специфическую сыворотку в разведении в соответствии с титром, указанным на этикетке ампулы. Смеси вирус-сыворотка инкубируют от 30 до 60 мин при 37 °С

для обеспечения связывания антигенов с антителами. После этого смесью заражают культуру ткани, куриные эмбрионы или лабораторных животных. Контролем слу-

жит чувствительная система, зараженная вирусом без сыворотки.

Положительной считают реакцию в случае нейтрализации ЦПД в культуре клеток, патологических изменений в куриных эмбрионах или организме животных.

На основании результатов РН определяют индекс нейтрализации – отношение титра вируса (где еще имеется ЦПД) в контроле к титру вируса в опыте. Если индекс ней-

трализации менее 10 – реакция отрицательная, от 11 до 49 – сомнительная, от 50 и

выше – положительная (достоверное соответствие вируса антисыворотке).

Смесью вирусов и сывороток можно заражать чувствительных животных. В

таких случаях нейтрализующую активность антител чаще всего определяют по ней-

трализации смертельного действия вируса на животных. Одновременно вычисляют индекс нейтрализации, выражающий максимальное количество смертельных доз вируса, которое нейтрализуется данной сывороткой, по сравнению с результатами контрольного опыта, принимаемыми за единицу (рисунок 49).

Для разведения вирусов для постановки РН на лабораторных животных или в куриных эмбрионах используют ФБР(рН от 7,0 до 7,2). При работе с культурами тканей используют ту среду, которую употребляют в качестве поддерживающей для данного вида клеток (среда 199, растворы Игла или Эрла, от 2,5 % до 5 % гемогид-

ролизат и т.п.).

283

Перед постановкой каждого нейтрализационного опыта вирус предварительно титруют, определяя конечное разведение, вызывающее повреждение культуры тка-

ни или инфицирование лабораторных животных (или куриных эмбрионов). Для это-

го готовят 10-кратные разведения вируссодержащего материала в любой питатель-

ной среде или в ФБР. Титр вируса выражают в 50 % дозе (ТКИД50-50 % инфекцион-

ная доза для тканевой культуры; ИД50-50 % инфекционная доза для животных или для куриных эмбрионов; ЛД50-50 % смертельная доза, рассчитывая ее методом Рида и Менча или Кербера (таблице 7).

«+» – положительная; «–» – отрицательная.

Рисунок 49 – Реакция нейтрализации для идентификации вирусов и противо-

вирусных антител

Таблица 7 – Расчет титра по формуле Рида и Менча

				Кумулятивные данные
Разведе-					летальность
ние виру-	Умерло	Выжило	умерло	выжило	отношение числа умер-	%
					ших животных к числу
са
					учтенных при данном раз-
					ведении
10-1	8	0	25	0	25/25	100
10-2	8	0	17	0	17/17	100
10-3	7	1	9	1	9/10	90
10-4	2	6	2	7	2/9	22
10-5	0	8	0	15	0/15	0

284

Кумулятивные количества умерших и выживших животных получают путем сложения чисел в соответствующих колонках в последовательности, указанной стрелками. Число животных в опыте равно 8 для каждого разведения вируса.

По данным учета гибели животных, определяют интервал, в котором находит-

ся доза вируса, вызвавшая 50 % смертность. В примере, показанном в таблице 7, она находится в промежутке между разведениями10-3 и 10-4. Интервал рассчитывается по следующей формуле

[% летальности, где гибель превышала 50%]- 50% =					90-50 = 40 = 0,6
% летальности, где		–		% летальности, где		90-22 68
гибель превышала 50 %			гибель была менее 50 %

Получив показатель пропорциональности интервала(0,6), рассчитывают от-

рицательный логарифм титра ЛД50, равный сумме: (отрицательный логарифм разве-

дения, в котором отмечена гибель более 50 % животных) + (пропорциональный ин-

тервал). Отрицательный логарифм титра ЛД50 - 3,0 + 0,6 = - 3,6. Отсюда титр ЛД50 =

10-3,6.

Таким же способом рассчитывают титр ТКИД , заменяя отношение чисел по-

50

гибших и инфицированных животных отношением числом пробирок с цитопатиче-

ским эффектом и зараженных пробирок. Метод Кербера. Пользуясь данными, таб-

лицы 7, подставляем их в формулу

Логарифм ЛД50=0,5 + логарифм максимальной концентрации – используемого вируса

– сумма процентов погибших животных = 100

= 0,5+(-1.0) – 100 + 100 + 88 + 25 100

Логарифм титра ЛД50 = 0,5-1,0-3,1 = -3,6.

ТитрЛД50 = 10-3,6

При расчете индекса нейтрализации разведения суспензии вируса соединяют с равными объемами неразведенной иммунной или неразведенной контрольной сыво-

роток. Индекс нейтрализации представляет собой отношение титра вируса в ЛД в

50

285

смеси с контрольной сывороткой к числу вируса в ЛДв смеси с неразведенной

50

иммунной сывороткой. Для нахождения индекса из логарифма титра ЛД в присут-

50

ствии контрольной сыворотки вычитают логарифмы титра ЛД вируса в присутст-

50

вии иммунной сыворотки. Индекс выражают либо логарифмом количества ЛД,

50

нейтрализуемого обследуемой сывороткой, либо соответствующим антилогариф-

мом, обозначающим его количество арифметически.

Основываясь на данных таблицы 8, можно провести расчет индекса нейтрали-

зации (число животных в опыте равно 6 для каждого разведения вируса).

Таблица 8 – Расчет индекса нейтрализации по формуле Рида и Менча

Разведение						Кумулятивные данные
вируса в	Умерло	Выжило				летальность отношение числа
смеси с сы-				умерло	выжило	умерших животных к числу уч-	%
вороткой						тенных при данном разведении
				Нормальная	сыворотка
10-3	6	0		14	0	14/14	100
10-4	6	0		8	0	8/8	100
10-5	2	4		2	4	2/6	33
10-6	0	6		0	10	0/10	0
				Иммунная	сыворотка
10-1	6	0		11	0	11/11	100
10-2	5	1		5	1	5/6	83
10-3	0	6		0	7	0/7	0
10-4	0	6		0	13	0/13	0
10-5	0	6		0	19	0/19	0

Метод Рида и Meнча. Нормальная контрольная сыворотка

	Пропорциональный интервал =	100 – 50	=	50	=	0,8
		100 - 33		67

[Отрицательный логарифм титра ЛД50] = -4,0 + [0,8 × (- 1,0)] =

= -4,0+(-0,8) = -4,8.

Титр ЛД50 =10-4,8

Метод Рида и Менча. Иммунная (испытуемая) сыворотка

	Пропорциональный интервал =	83 – 50	=	33	=	0,4
		83 - 0		83
	[Отрицательный логарифм титра ЛД50] =		-5,0 + [0.4 × (-1,0)] =
	= -2,0+(-0,4) = -2,4.

Титр ЛД50 =10-2,4

Индекс нейтрализации = 4,8-2,4 (нейтрализовано 2,4 lg вируса)

286

Метод Кербера. Нормальная контрольная сыворотка

[Отрицательный логарифм	= -3 -	100 + 100 + 33		× lg10 = -3 – [(2,33 – 0,5) × 1] = -4,8
титра ЛД50]			100

Титр ЛД50 =10-4,8

Метод Кербера. Иммунная сыворотка

[Отрицательный логарифм	= -3 -		100 + 83	- 0,5 × lg10 = -3 × [(1,8 – 0,5) × 1] = -2,3
титра ЛД50]			100

Титр ЛД50 =10-2,3

Индекс нейтрализации = 4,8 - 2,3 (нейтрализовано 2,5 lg вируса)

Эту же величину можно обозначить антилогарифмом: индекс нейтрализации =

антилогарифм 2,5 = 320. Индекс нейтрализации менее 10 указывает на отсутствие антител в исследуемой сыворотке. Индекс от 11 до 49 считается сомнительным, а 50

и выше – положительным, свидетельствующим о достоверной вируснейтрализую-

щей активности сыворотки.

Определение 50 % нейтрализующего эффекта сыворотки показано в таблице

9. Вирусную суспензию в разведении, содержащем 100 ЛД вируса, соединяют с рав-

ными объемами последовательных двукратных разведений сыворотки и после соот-

ветствующей инкубации смесь вводят определенному числу лабораторных живот-

ных (таблица 9).

Таблица 9 – Расчет 50 % нейтрализующего действия сыворотки по формуле Рида и Менча

Разведение сы-					Кумулятивные данные
					летальность
воротки (по-	Умер-	Выжило	умерло	выжило	отношение числа умерших животных	%
стоянная виру-	ло				к числу учтенных при данном разве-
са)
					дении
1:4(10-0,6)	0	6	0	17	0/17	0
1:16(10-1,2)	0	6	0	11	0/11	0
1:64(10-1,8)	2	4	2	5	2/7	29
1:256 (10-2,4)	5	1	7	1	7/8	88
1:1024 (10-3,0)	6	0	13	0	13/13	100

Число животных для каждого разведения вируса равно 6

287

Метод Рида и Менча.

[Пропорциональный интервал] =

50 %- (процент летальности в разведении с эффектом ниже 50 %)

процент летальности в разведении с эф-			-	процент летальности				в разведении			с
фектом выше 50 %				эффектом ниже 50 %
						50-29		21
По данным таблицы пропорциональный интервал =							-		= 0,35
						88-29		59

Логарифм разведения сыворотки, защищающего 50 % животных, = - 1,8 + [0,35 × (-0,6)] = -1,8 + (- 0,2) = 2,0

Разведение сыворотки, защищающее 50 % животных, = антилогарифм -2,0 = 0,01, т.е. 1:100.

Метод Кербера. Логарифм разведения сыворотки, защищающего 50 % животных =

	= -3,0 - (0,6) ×	33 + 83 + 100	- 0,5 = -3,0 – [(0,6) × (2,2-0,5)] = -3,0 + 1,0 = 2,0
		100

Разведение сыворотки, защищающее 50 %.животных, = антилогарифм - 2,0 = 0,01, т.е. 1:100.

Реакция задержки (нейтрализации) бляшкообразования (РЗБО)

Идентифицировать вирус по характеру бляшек очень трудно, поэтому прибе-

гают к постановке РН выделенного вируса заведомо известными вируснейтрали-

зующими сыворотками. С этой целью полученный от больного вирус накапливают в культуре клеток, и различные его разведения смешивают с неразведенной противо-

вирусной сывороткой или, наоборот, постоянную дозу вируса добавляют к различ-

ным разведениям иммунной сыворотки. Смеси инкубируют в термостате при темпе-

ратуре 37 °С в течение времени от 1 до 2 ч или при температуре 4 °С в течение 18 ч.

После этого смесями вируса и сыворотки заражают культуру клеток и о нейтрали-

зующей силе ее антител судят по отсутствию ЦПД на клетки.

Наиболее чувствительным вариантом РН является подавление вирусног

288

бляшкообразования под действием вирусспецифической антисыворотки(реакция редукции вирусных бляшек). При постановке этой реакции к вируссодержащему материалу (от 50 БОЕ до 100 БОЕ – бляшкообразующих единиц) добавляют антисы-

воротку (в разведении, соответствующем титру) и после инкубации в термостате в течение времени от 30 до 60 мин смесь наносят на монослой чувствительных куль-

тур клеток. Бляшкообразование выявляют вышеописанными методами(с примене-

нием агарового или бентонитового покрытия). Соответствие вируса антителам сы-

воротки проявляется подавлением бляшкообразования(в сравнении с контролем).

РН позволяет определить видовую и типовую (вариантную) принадлежность вируса.

Реакция задержки (нейтрализации) ЦПД в цветной пробе.

Одним из вариантов РН является цветная проба(колориметрическая реакция нейтрализации). При положительном результате противовирусные антитела блоки-

руют размножение вируса в культуре клеток, и под действием кислых метаболитов последних в среде меняется цвет индикатора. В пробирки вносят по 0,25 мл рабоче-

го разведения вируса (от 100 до 1000 ЦПД50) и соответствующего разведения сыво-

ротки. Смесь выдерживают при комнатной температуре от30 до 60 мин, добавляют в каждую пробирку по0,25 мл клеточной суспензии и закрывают их резиновыми пробками или заливают стерильным вазелиновым маслом. Пробирки помещают в термостат на время от 6 до 8 дней при 37 °С. Результаты реакции учитывают коло-

риметрически: рН 7,4 и выше указывает на репродукцию вируса, 7,2 и ниже – на нейтрализацию вируса антителами.

Реакция торможения (задержки или нейтрализации) гемагглютинации

(РТГА).

Являясь группоспецифической, РГА не дает возможности определить видо-

вую принадлежность вирусов. Их идентифицируют с помощью реакции торможения гемагглютинации (РТГА) Для ее постановки используют заведомо известные им-

мунные противовирусные сыворотки, которые в двукратно снижающихся концен-

трациях разводят в изотоническом растворе натрия хлорида и разливают по0,25 мл.

К каждому их разведению добавляют равное количество вируссодержащей жидко-

сти, при типировании вируса гриппа, например, в четырехкратном титре, т.е. 4 ге-

289

магглютинирующие единицы. Контролем является взвесь вируса в изотоническом растворе натрия хлорида. Планшеты со смесью сывороток и вируса выдерживают в термостате 30 мин или при комнатной температуре2 ч, затем в каждую из них до-

бавляют по 0,5 мл 1 % взвеси эритроцитов. Спустя от 30 до 45 мин определяют титр вируснейтрализующей сыворотки, т.е. максимальное ее разведение, вызвавшее за-

держку агглютинации эритроцитов.

Используя РТГА в серологической диагностике вирусных болезней, рекомен-

дуется ставить ее с парными сыворотками, одну из которых получают в начале за-

болевания, а другую – спустя от 1 до 2 нед. и более. Четырехкратное нарастание титра антител во второй сыворотке подтверждает предполагаемый диагноз.

Эта реакция основана на блокировании вирусных гемагглютининов специфи-

ческими антителами. Ее можно рассматривать как частный случай реакции нейтра-

лизации. РТГА может быть использована как для серологической диагностики, так и для идентификации гемагглютинирующих вирусов. Феномен РТГА проявляется в образовании компактного осадка эритроцитов вместо«зонтика» гемагглютинации.

Реакцию проводят на полистироловых пластинах и оценивают по отсутствию склеи-

вания эритроцитов, добавленных к смеси вируса и специфической сыворотки. Для удаления или разрушения неспецифических ингибиторов гемагглютинации сыво-

ротки, используемые для РТГА, предварительно обрабатывают периодатом калия,

каолином, бентонитом, ацетоном или другими веществами. Затем готовят двукрат-

ные разведения сыворотки в ИХН и к каждому разведению добавляют равное коли-

чество вируссодержащей жидкости с активностью 4 ГЕ. Смесь инкубируют от 30 до

60 мин при необходимой для данного типа вирусов температуре(0 °С, 4 °С, 20 °С, 37 °С), а затем добавляют равный объем0,5 – 1,0 %-й взвеси эритроцитов. После этого смесь снова инкубируют в течение времени от30 до 45 мин и учитывают ре-

зультаты реакции. Титром сыворотки считают ее наибольшее разведение, которое

«тормозит» гемагглютинацию. Для РТГА широко применяется также микрометод с использованием микропланшетов и делютеров Такачи (для разведения материала).

Реакция торможения гемадсорбции (РТГАд).

Данная реакция основана на нейтрализации эффекта адсорбции эритроцитов

290