Биоинженерия / Тестирование_бионаноматериалов / mat_prop

33

1.2. Требования, предъявляемые к материалам медицинского назначения,

и методы их исследования.

Любой материал, предназначенный для биомедицинских целей, прежде всего, должен характеризоваться безвредностью для организма и функциональностью. Комплекс необходимых механо-физических и биосовместимых свойств, которыми должны обладать полимеры медицинского назначения, достаточно широко варьирует в зависимости от конкретных функций того или материала, места его имплантации, сроков службы и др. (Полимеры медицинского назначения, 1981; Пхакадзе, 1990; Ratner et al., 1992; Biomedical Polymers, 1994; Bioartificial organs, 1997; 1999; Amass et al., 1998; More and Sauders, 1998; Биосовместмимость, 1999).

«Биологическая совместимость», - как отмечают японские исследователи Я. Сакураи и Т. Акаике (1981), - «..понятие обширное, емкое. Материалы, обладающие этим свойством, образуют широкую гамму.» Среди них, например, материалы со значительной механической прочностью для ортопедии и эластичные материалы для сосудистых протезов; шовные нити, которые достаточно быстро должны резорбироваться и усвоиться организмом и искусственные клапаны сердца, предназначенные для длительного функционирования; антитромбогенные материалы, а также материалы, способствующие быстрому свертыванию крови. Таким образом, требования, предъявляемые к биоматериалам, разнообразны и многогранны, поэтому в каждом конкретном случае необходимо рассматривать конкретное содержание, вкладываемое в понятие биосовместимости применительно к целевому назначению каждого отдельного материала.

По отношению к организму имплантируемый материал должен отвечать следующим основным требованиям (Полимеры медицинского назначения, 1981; Биосовместимость, 1999; Biomedical Polymers, 1994; More, Sauders, 1998):

• не вызывать отравления организма и не быть аллергеном,

• не травмировать живую ткань,

• не быть канцерогенным,

• не вызывать антигенного действия,

• не вызывать деструкции и разложения белков и ферментов,

• не нарушать электролитный баланс,

• не вызывать отклонений в системах метаболизма.

Материалы, предназначенные для длительного контакта с кровью (группа гемосовместимых материалов) не должны также:

• провоцировать образование тромбов и тромбоэмболий,

• активировать свертывающую, фибринолитическую системы и систему комплемента,

• отрицательно влиять на белковые и форменные элементы крови.

Сформировавшееся в последние годы мультидисциплинарное направление биоматериаловедения и трансплантологии, -тканевая инженерия, остро нуждается в специализированных биосовместимых материалах. Тканевая инженерия ориентирована на создание конструкций, обеспечивающих восстановление, укрепление и улучшения функций тканей (Mooney and Vacanti, 1993; Williams et al., 1999; Heath, 2000; Humacher, 2000; Sodian et al., 2000). Существуют несколько подходов к использованию полимерно-тканевых конструкций – это инфузия выделенных клеток, создание тканево-индуцирующих материалов и имплантация и культивирование клеток на подложке – модели биоимплантанта. Материалы, применяемые в тканевой инженерии, строго должны обладать спектром специальных свойств. Прежде всего, продукты деградации конструкции не должны быть токсичными, конструкция должна сохранять свою форму и обладать достаточной прочностью до тех пор, пока новая ткань организма-хозяина в месте имплантации полностью не восстановится; материал, применяемый для изготовления конструкции, не должен быть иммунногенным, он должен поддерживать рост клеток и организацию их в ткань, в свою очередь сам имплантант должен беспепятственно отводить продукты обмена клеток.

Материал под воздействием организма, в свою очередь не должен:

• поддаваться механическому разрушению и истиранию,

• менять структуру и конфигурацию поверхности,

• химически трансформироваться и разлагаться,

• адсорбироваться и седиментироваться,

• экстрагироваться.

Полимерные материалы, отвечающие всем этим требованиям, к сожалению, пока не созданы. Тем не менее, последовательное изучение позволит в конце концов получить материалы, биосовместимые в буквальном смысле. Однако для создания и освоения новых полифункциональных и биосовместимых материалов необходимо знание и понимание механизм взаимодействия материала с организмом на молекулярном уровне (Полимеры медицинского назначения, 1981; Пхаказде, 1990; Трансплантология, 1995; Севастьянов, 1999; Ratner et al., 1992; Biomedical Polymers, 1994; Bioartificial organs, 1997; 1999; More and Sauders, 1998).

Поэтому основополагающей задачей биоматериаловедения является необходимость изучения молекулярной совместимости материала с биологической субстранцией. При этом необходимо ответить на следующие три вопроса: какие полимеры, 2) под действием каких факторов, 3) каким образом изменяются.

Имплантированный материал и живой организм при контакте подвержены взаимовлиянию, как правило, негативного характера. При этом характер и степень выраженности этого воздействия определяется как комплексом физико-химическим свойств собственно материала, так и природой и силой ответных физиолого-биохимических реакций организма-хозяина.

Когда в организм вводят (имплантируют) инородное по отношению к нему вещество или тело, организм сразу реагирует на это. Биологические реакции можно резюмировать следующим образом (Рис. 1.1):

А 1

Б 2

В

3

Г 4

Д Е

Рис 1.1: Схема реакции организма на имплантируемый материал (по Я. Сакураи и Т. Акаике, 1981):

А-Химические факторы: основные составляющие полимеры (вещества, переходящие в раствор). Б-Механические факторы: конфигурация, размеры, характеристика поверхности. В–Факторы температурно-электрического характера. Г–Биологические факторы: действие организма и микроорганизмов. Д-Физические характеристики: прочностные, температурные, механо-физические свойства. Е-габитус, пол, возраст, иммунные свойства, условия циркуляции крови, место имплантации. условия циркуляции крови.

1-быстрая реакция всего организма (аллергия, острое отравление, высокая температура, нервно-паралитические реакции); 2-замедленная реакция организма: реакция антигенов и антител, неострое отравление, тератггеннеы явления, аномальные рефлексы; 3- быстрая реакция на участке имплантации: острое воспаление, распад и некроз ткани, активное вторжение и экскремирование инородного тела; 4-замедленная локальная реакция: хроническое воспаление, образование и рост гранулемы, рост соединительной ткани, осаждение известковых отложений, сращение, образование злокачественной опухоли, тромбоз.

Имплантант под воздействием организма, в свою очередь, также претерпевает различные изменения, причем биофизиологические факторы, влияющие на имплантируемый материал, весьма разнообразны (Рис.1.2).

Ухудшение меха-нических свойств

1

2

3

Ухудшение физических свойств

4

5

6

15

Ухудшение химических свойств

7 16

8 17

9 18

10 19

20

11 21

13

12

14

Рис.1.2. Биодеградационные изменения биоматериала в организме :

1-трение, 2-ударная нагрузка, 3-многократный изгиб, 4-переход в раствор, 5-адсорбция, 6-известковые отложения, 7-разложение основной макромолекулярной цепи, 8- разложение боковых цепей, 9- сшивание основных цепей, 10-сшивание боковых цепей, 12-нецепное разложение, 13-статистическое разложение, 14-органическое разложение, 15-природа химических связей, 16-влияние смежных групп и атомов (эффект заместителей), 17-конформационные преобразования, 18-кристалличность,степень сшивания, 19-структура поверхности, 20-конфигурация, 21-отношение к внешней среде (гидрофобность, гидрофильнсть). Ф-ферментные реакции. М-Характеристики материала.

Для понимание механизма взаимодействия полимерных имплантантов с тканями организма необходимы комплексные исследования закономерностей регенераторного процесса, с одной стороны, и изучение «судьбы» (включая кинетику биодеструкции и динамику прочностных свойств) имплантируемого материала, с другой. При этом нельзя не отметить, что трудности разработки новых медицинских материалов усугубляются также отсутствием унифицированных способ и критериев оценки их биосовместимости и огромным разнообразием существующих методов исследования (Полимеры медицинского назначения, 1981; Пхакадзе, 1990; Севастьянов, 1990: Севастьянов с соавт., 1990; Heung, Lemke,1994; Molecular and Cellular Methods…,1996). Это связано с разнообразием и множественностью реакций, возникающих в системе «имплантант-ткани-организм», а также отсутствием знания механизма биосовместимости медицинских материалов и изделий при кратковременном и длительном функционировании (Севастьянов с соавт., 1990).

По отношению к изделиям из полимерных материалов, используемых в современной медицине, установлен ряд критериев, необходимых для контроля с точки зрения их биологической безопасности. Первоочередными при этом является комплекс исследований физико-химических свойств материала; далее переходят к биологическим испытаниям материала и экстрактов материала в системах in vitro и in vivo. При этом первоначальный скрининг проводится in vitro и ex vivo, затем выполняется комплекс острых и хронических тестов in vivo и только после этого приступают к клиническим испытаниям. В настоящее время документом, регламентирующим исследования такого рода в США, России и ряде зарубежных стран, является международный стандарт ИСО 10993 (Standards for Biological Evaluation…,1993). В общем виде система тестов ИСО 10993 включает серию последовательных стадий, различающихся как методам, так и объектами исследований (таблица 1.2). В России для исследования биологических свойств медицинских изделий и материалов действуют также рекомендации Минздрава РФ (Сборник руководящих методических материалов…,1987; Сборник методических рекомендаций…,1991).

Наиболее полное представление о существующих современных подходах и методах исследования новых материалов и изделий медицинского назначения дает коллективная монография ведущих специалистов России в данной области, подготовленная под редакцией руководителя Центра по экспериментальному исследованию гемосовместимых биоматериалов НИИ трансплантологии и искусственных органов Минздрава России, профессора В.И. Севастьянова (Биосовместимость, 1999). Программа исследований нового биоматериала формируется с учетом длительности и характера контакта с живым организмом (Севастьянов с соавт., 1999).

Таблица 1.2

Программа испытаний медицинских изделий

по стандарту ИСО 10993

Стадия	Содержание
I стадия Характеристика и тестирование исходного сырья	Экспресс-оценка химических, физических и биологических (цитотоксичность, гемо-лиз in vitro) до и после технологическких операций (прессование, экструзия и пр.)
II стадия Исследование биосовместимых свойств компонентов изделий	Оценка биологической безопасности отдельных составляющих изделия
III стадия Оценка качества и эффектив-носи контроля на производстве	Аттестация производственных помещений (оценивается система контроля исход-ного сырья и конечного продукта)
IV стадия Контроль качества конечного продукта	Контроль исходного сырья и конечного продукта на соответствие паспортным данным и требуемым медико-техническим свойсвтам.

По характеру контакта материалы и изделия медицинского назначения подразделяются на три группы:

- контактирующие с поверхностями покровных тканей (внешние протезы, электроды, изделия для ортодентии и ортопедии, контактные линзы, мочевыводящие катетеры, раневые покрытия);

- не контактирующие непосредственно с организмом (внешние устройства) (системы для хранения и переливания крови, диализаторы, иммунносорбенты, системы дренирования, лапаро- и артроскопы, оксигенаторы);

- имплантируемые изделия, контактирующие с тканью/костью (ортопедические шпильки, шовный материал, протезы), внутренней средой глаза (эндопротезы, интраокулярные линзы), кровью (артерио-венозные фистулы, протезы кровеносных сосудов, клапаны сердца).

По продолжительности контакта медицинские изделия подразделяются на три категории:

• (А) ограниченное воздействие (до 24 час),

• (Б) длительное воздействие (от 24 час до 30 сут),

• (В) постоянный контакт (свыше 30 сут).

Cанитарно-химические методы, включающие измерения рН-, УФ- и ИК-спектроскопии позволяют понять природу реакции организма на имплантируемый материал. Рекомендовано также анализировать окисляемость и бромируемость водных вытяжек из полимеров для оценки стабильности материала и потенциальной миграции в среду продуктов синтеза полимера и технологических стабилизаторов и добавок. Важным моментом является изучение механо-физических свойств материала и изделий, включаю топографию и микроструктуру поверхности, электрические, температурные, динамические и др. свойства. Следует анализировать также методы, приемлемые для переработки материала в специальные изделия, необходимость применения специальных технологических добавок и их природу, а также отношение материала к общепринятым методам стерилизации.

Токсикологические исследования биоматериалов включают биологические тесты (раздражающий эффект, цитотоксичность in vitro, на острую токсичность, гемолитическое действие, биодеградацию, имплантационные тесты с последующим морфологическим анализом); иммунологические методы; мутагенность, канцерогенность, воздействие на репродуктивную функцию, перинатальное и постнатальное развитие.

Цитотоксичность материала, экстрактов и изделий на его основе исследуют in vitro на различных клетках (сперма крупного рогатого скота, клеточные культуры фибробластов, макрофагов, кератоцитов и др.) Данные тесты позволяют выявить прямое воздействие химических веществ, составляющих материал.

Тест на раздражение позволяет определить способность материала или его экстракта вызывать воспалительную реакцию при прямом контакте с тканью in vivo.

С помощью имплантационного теста оценивают местное (макро- и микроскопическое) патогенное воздействие на ткани.

Исследование общей (острой) токсичности направлено на определение летальной дозы материала или вытяжки (ЛД) или ЛД₅₀ и выявление возможного токсического эффекта материала при однократном или многократном воздействии течение периода времени, менее 24 ч.

Субхроническая (не менее 90 сут) и хроническая токсичность (свыше 90 сут) определяется для материалов, предназначенных для длительного контакта с внутренней средой организма. В ходе эксперимента анализируют поведение животных, динамику их привесов, массу внутренних органов, формулу крови.

Сенсибилизационный тест применяют для выявления возможных проявлений аллергических реакций организма под воздействием веществ, экстрагируемых из материала.

В качестве дополнительных методов рекомендованы следующие тесты: на генотоксичность, эмбриотоксичность и канцерогенность.

Исследование гемосовместимых свойств материалов проводится в системах in vitro, ex vivo и in vivo по набору методов, характеризующих процессы взаимодействия материала с кровью, включая изменения свойств компонентов крови и собственно материала или изделия. Для оценки гемосовметимости новых полимерных материалов, исходя из многофакторности данного понятия, в настоящее время принята комплексная система методов, разработанную в рамках межправительственной СССР-США программы «Исследование и разработка искусственного сердца», а также международной рабочей группой «Взаимодействие синтетических полимеров с живыми системами» при Международном союзе по теоретической и прикладной химии (ИЮПАК) (Севастьянов, 1990; Севастьянов с соавт., 1999; Сборник методических рекомендаций…, 1991). Данная система методов является составной частью международного стандарта ИСО 10 993 по оценке биологической безопасности медицинских материалов и изделий и предусматривает исследование физико-химических и физико-механических характеристик, а также два уровня оценки собственно гемосовместимых свойств тестируемых материалов. Первый уровень исследования включает экспресс-методы предварительной оценки гемосовместимых свойств (определение времени рекальцификации, оптической плотности супернатанта, количества адгезированных тромбоцитов). Второй уровень предусматривает исследование реакции высвобождения тромбоцитов, степени распластывания адгезированных тромбоцитов, активации системы комплемента, динамики адсорбции альбумина и кальция.

Тканевая реакция на имплантант является важным моментом в оценке биосовместимости имплантируемого материала. Экспресс-методы, применяемые для этого, включают исследования in vivo и in vitro. Последние проводят на различных типах клеток (фибробластах, моноцитах, лимфоцитах, макрофагах и др.) с целью оценки реакции клеток на инородный материал, например, жизнеспособности по интенсивности матричных процессов (включение ³Н-тимидина ядрами, окрашивание трипановым синим) и высвобождения клетками специфических компонентов и тканевых медиаторов (Gonzalez et al., 1996), а также получить количественные оценки (Галатенко с соавт, 1982). Эксперименты in vivo предусматривают имплантирование материала (в виде пленок, губок, волокон, пластин) подкожно, внутримышечно, внутрибрюшинно, а также в органы и сосуды на различные сроки в зависимости о конкретных задач. В ходе опытов оценивается как общая реакция организма и местная тканей, а также структура и морфология внутренних органов, в которых возможна аккумуляция продуктов деструкции материала (Пхакадзе, 1990; Шехтер, Розанова, 1999).

Имплантация в организм чужеродного материала неизбежно вызывает клеточную реакцию, расцениваемую обычно как асептическое воспаления. Эта реакция является защитной функции тканей и направлена на их регенерацию. Воспалительный процесс ведет к пролиферации фибробластов, которые продуцируют компоненты экстрацеллюлярного матрикса, включая коллагеновые волокна. Далее происходит процесс формирования фиброзной капсулы, которая изолирует инородное тело от окружающих его тканей. Интенсивность воспаления, и длительность регенеративных процессов зависят от природы имплантируемого материала, степени его биосовместимости. Течение этих процессов имеет свои особенности в каждом конкретном случае. Поэтому новые биоматериалы медицинского назначения обязательно подвергаются токсикологическим и морфологическим исследованиям в условиях in vivo (Полимеры медицинского назначения, 1981; Пхаказде, 1990; Трансплантология, 1995; Севастьянов с соавт., 1999; Шехтер, Розанова, 1999; Bioartificial organs, 1997; 1999; Amass et al., 1998; More and Sauders, 1998). В ходе этих исследований анализируют в динамике не только местную реакцию тканей, окружающих имплантант, но и внутренние органы животных, в которых могут аккумулироваться продукты деструкции материала.

После хирургического вмешательства и имплантации материала или испытуемого изделия в месте имплантации развивается асептичекое воспаления тканей, которое принято подразделять на несколько стадий: альтерации (повреждения), экссудации и пролиферации; последняя также является первой стадией репаративной регенерации (Рис. 1.3).

П овреждение.

И нородное тело

Микроциркуляторная и медиаторная реакции,

Р

В

еакция тромбоцитов и лаброцитов

ФЭ

Экссудация, реакция нейтрофилов

Макрофагальная реакция,

о бразование гигантских клеток; резорбция

Пролиферация и миграция фибробластов;

р

ФП

ост сосудов, грануляционная ткань

Б

Р

иосинтез и фибриллогенез коллагена

С

Ф, Р

озревание грануляционной ткани, фиброз,

Формирование капсулы

Реорганизация и инволюция рубца или капсулы

Рис.1.3. Кинетика воспалительно- репараторной реакции тканей на

имплантацию (по А.Б. Шехтеру и В.В. Серову, 1991):

ФЭ-фаза экссудации; ФП- фаза пролиферации; Ф, Р-фиброз,

рубцевание; В-воспаление; Р-регенерация.

Первые две стадии, экссудативную и пролиферативную, иногда подразделяют на нейтрофильную, макрофагальную и фибробластическую фазы. Нейтрофильная фаза наступает в первые часы после хирургического вмешательства, олиморфоядерыне лимфоциты (ПЯЛ) из сосудов мигрируют в сторону источника раздражения, окружая его, образуя через 6-12 ч лейкоцитарный вал. Время жизни ПЯЛ короткое; в течение суток миграция нейтрофильных лейкоцитов прекращается, они начинают распадаться (Серов, Шехтер,1981; Воспаление,1995; Шехтер, Серов, 1995; Anderson, 1988). В месте острого воспаления накапливаются недоокисленные продукты, прежде всего, молочная кислота, развивается ацидоз тканей, происходит перекисное окисление липидов. В данной фазе продукты секреции и распада ПЯЛ активируют системы комплемента, свертывания и фибринолиза и вызывают дегрануляцию тучных клеток. Эти факторы стимулируют образование из эмигрировавших из сосудов моноцитов макрофагов и их хемотаксис. В адгезированных на поверхности имплантанта клетках происходит активация ферментов. На следующей стадии основными клетками становятся макрофаги (макрофагальная стадия), которые внедряются в лейкоцитарный вал и фагацитируют клеточный детрит, продукты распада тканей и имплантированного материала. Макрофаги окружают инородное тело и формируют нейтрофильно-макрофагальный → макрофагальный → макрофагально-фибробластический барьеры, которые предшествуют образованию грануляционной ткани. Макрофаги взаимодействуют с другими клетками через секретируемые медиаторы (к настоящему времени среди них выделено свыше 40) (Шехтер и Серов, 1991;1995). Макрофагам отводится одна из основных ролей в определении биосовместимости имплантируемых материалов (Пхаказдзе, 1990; Marchant et al., 1983; Zhao et al., 1992; Кao et al., 1994).