Оптические методы в биофизике: цитофотометрия
Аннотация
Оптические методы, которые применяются для изучения клетки, объединяются термином «цитофотометрия». В данной работе проводилось исследование клеток (эритроцитов) основными цитофотометрическими методами: плаг-методом, одноволновым и двуволновым. Был построен график спектра поглощения красителя, которым окрашен образец, и выявлен максимум поглощения в интервале 523-551 нм. Были определены светофильтры, пригодные для проведения измерений всеми тремя методами (№8 – для плаг-метода, №18 – для одноволнового, №13 – для двуволнового). Построен график зависимости D(λ). Были вычислены относительные погрешности для всех трех методов и выяснилось, что наименьшая относительная погрешность обнаруживается при использовании одноволнового метода. Средние оптические плотности клетки, определенные тремя методами, различаются значительно. Площади клетки, полученные методом двух площадей и через площадь круга, также значительно отличаются, но можно принять площадь клетки равной площади одного из зондов (50-60 единиц барабана). Количество вещества (D*S), найденное одноволновым методом составило 0,000006674 усл. единиц, плаг-методом — 0,000017201 усл. единиц, двухволновым — 0,000008536 усл. единиц.
Введение
Оптические методы, которые применяются для изучения клетки, объединяются термином «цитофотометрия». Они учитывают особенности химической и структурной организации объекта измерения. В клетках оптическими центрами поглощения служат входящие в них различные молекулы или их комплексы. Область поглощения этих оптических центров определяется рядом факторов: химическим строением поглощающих молекул, их состоянием – адсорбированы ли они, растворены или находятся в конденсированном состоянии.
Исследование спектров поглощения – это основа качественного анализа цитоспектрофотометрии. Измерения же интенсивности тех или иных полос поглощения служат основой количественного анализа содержания соответствующих молекул, поскольку интенсивность поглощения определяется концентрацией поглощающих центров. В основе количественной цитофотометрии лежит закон Бугера - Бэра. При значении оптических плотностей от 0,1 до 1,2 точность измерений максимальна.
Клетка как объект фотометрии. В зависимости от спектральной области, в которой проихводятся измерения, цитофотометрию делят на УФ- и видимую. УФ-цитофотметрия охватывает область спектра 240-320нм. В этой области поглощают нуклеиновые кислоты, белки, свободные нуклеотиды, лигнин, витамины, гормоны.
Цитофотометрия в видимой области спектра, кроме преимуществ, связанных с простотой аппаратуры и измерительных приборов, с большой универсальностью в интерпретации данных, обладает еще и тем достоинством, что дает принципиальную возможность специфической метки, а значит, и анализа любого внутриклеточного соединения. Здесь краситель выступает в роли посредника. Чтобы по его содержанию можно было судить о количестве окрашенного вещества, необходимо выполнять следующие условия:
- краситель должен быть специфичным, т.е. окрашивать только те соединения, которые подлежат анализу;
- концентрация конечного продукта реакции красителя с веществом должна быть пропорциональна концентрации исследуемого соединения, т.е. быть количественной;
- окрашенный конечный продукт должен подчиняться закону поглощения.
Большинство ошибок в цитофотометрии имеют отрицательный знак и занижают истинное количество вещества. Разработаны различные методы цитофотметрии, позволяющие уменьшить ошибку.
Плаг-метод. Принцип этого метода заключается в представлении клетки в виде кюветы, заполненной поглощающим веществом. Фотометрирующий пучок вырезает в центральной части клетки объем в форме пробки. Для определения массы вещества необходимо знание всего объема клетки. Если концентрация вещества в клетке заметно изменяется, то фотометрирование большого поля даст большую ошибку распределения, а малого – окажется непредставительным. Определение площади клетки может быть выполнено различными способами: с помощью специального устройства – планиметра, с использованием окуляр-микрометра (для клеток простой формы), с помощью точечных масок. Задача существенно упрощается применением метода двух площадей. В этом методе производится измерение пропускания клетки двумя зондами.
Одноволновой метод. В этом методе зонд полностью перекрывает клетку и измерение ее площади делать не надо, однако, поскольку измеряемые оптические плотности очень малы, необходимо максимально уменьшить случайные погрешности измерений.
Двухволновой метод. Поглощающее вещество в одной части фотометрируемого поля отсутствует, а в другом – распределено равномерно. Под решением будем понимать определение средней оптической плотности клетки, которая служит основанием для расчета вещества. Этот метод не дает ошибки более нескольких процентов для самых неблагоприятных случаев. Выбирается такой размер зонда и такое увеличение объектива, чтобы зонд полностью охватывал площадь клетки. При вычислении массы вещества используется площадь зонда. Однако если площадь зонда намного больше площади клетки, то ошибка измерения возрастает.