Основы клеточной и генетической инженерии (90

Коровам и кобылам эмбрионы вводят нехирургическим путем. Каждому реципиенту мыши, кролика и свиньи пересаживают 20-30 инъецированных зигот, причем у свиней все эмбрионы трансплантируют в один яйцевод, а у мышей и кроликов – раздельно по яйцеводам. У овец, коз, крупного рогатого скота каждому реципиенту пересаживают два-четыре эмбриона.

Пересадка генетически трансформированных клеток в энуклеированную яйцеклетку. В отличие от микроинъекции гена в пронуклеус зигот этим методом ген вводят в соматические клетки, которые затем подсаживают к энуклеированным ооцитам и соединяют их с цитоплазмой, как правило, электрослиянием.

Реконструированные ооциты трансплантируются животнымреципиентам. Таким образом, осуществляется и клонирование животных. Использование метода клонирования эмбрионов для получения трансгенных животных существенно сокращает время и стоимость получения трансгенных животных.

Следует отметить, что пересадка девяти реконструированных эмбрионов коровам-реципиентам сопровождалась получением одного трансгенного теленка, тогда как при использовании техники микроинъекции гена должно быть проинъецировано и пересажено коровам-реципиентам около 500 эмбрионов, чтобы получить одного трансгенного потомка.

В птицеводстве необходимый ген вводят в зародышевые клетки донора путем обычной трансфекции в культуре клеток, как это делается на животных. Затем трансфецированные зародышевые клетки снова пересаживают в зародыш реципиента, который продолжает развиваться до вылупления. Таким образом, получают кур, продуцирующих с яйцом различные лекарственные белки.

Пересадка гена с использованием ретровируса. Впервые данная методика была опробирована на курах, мышах, а в 2001 году и на крупном рогатом скоте. Методика с использованием ретровирусов имеет высокую эффективность интеграции гена. В последних исследованиях было получено четыре из четырех

21

трансгенных телят путем введения гена в ооцит на стадии метафазы II. Однако существуют и недостатки метода с использованием ретровируса.

Во-первых, это относительно маленькое количество генетической информации, которое может быть перенесено ввиду малого объема вирусных частиц. Это создает проблему получения низкой экспрессии гена, что ограничивает практическое использование этого приема.

Другим недостатком этого метода является его сложность. Упаковка трансгенов в вирус осложняется техникой изготовления генной конструкции, введения ее в геном ретровируса. После того, как вирусы будут сконцентрированы, они могут быть введены в ооцит.

Пересадка генов путем введения его в сперму. Пересадка генов таким приемом в настоящее время продемонстрирована на нескольких видах животных. Эффективность интеграции экспрессии и передачи введенных генов очень высокая. Для соединения трансгенов со спермиями используются моноклональные антитела.

Всвязи с разработкой метода введения чужеродных генов в геном животных реципиентов появилась возможность создавать животных с совершенно новыми свойствами, связанными с улучшением продуктивности и качества животноводческой продукции, резистентности к болезням и создание трансгенных животных – биореакторов ценных биологич ески активных веществ.

Вмире уже существуют сотни трансгенных овец и коз, продуцирующих в молоке от десятков миллиграмм до нескольких грамм биологически активных белков человека в 1 литре молока. Такой метод производства экономически выгоден и экологически чище, хотя и требует от ученых больших усилий и времени при создании трансгенных животных по сравнению с созданием генноинженерных микроорганизмов. С молоком трансгенных животных можно получать не только лекарства. Известно, что для производства сыра высокого качества необходим фермент, створаживающий молоко - ренин. Этот фермент добывают из желудков молочных телят. Он дорог и не всегда доступен.

22

Наконец, генные инженеры сконструировали дрожжи, которые стали производить этот ценный белок при микробиологическом синтезе.

Следующий этап генной инженерии – создание трансгенных овец, которые синтезируют химозин в молоке. Небольшое стадо наших овец в России находится на Ленинских Горках под Москвой. Эти овцы синтезируют до 300

мг/л фермента в молоке. Для процесса сыроварения белок можно не выделять, а использовать просто в составе молока.

Технология создания трансгенных животных является одной из наиболее бурно развивающихся биотехнологий в последние 10 лет. Трансгенные животные широко используются как для решения большого числа теоретических задач, так и в практических целях для биомедицины и сельского хозяйства. Некоторые научные проблемы не могли бы быть решены без создания трансгенных животных. На модели трансгенных лабораторных животных проводятся широкие исследования по изучению функции различных генов, регуляции их экспрессии, фенотипическому проявлению генов,

инсерционному мутагенезу и др. Трансгенные животные важны для различных биомедицинских исследований.

Существует множество трансгенных животных, моделирующих различные заболевания человека (рак, атеросклероз, ожирение и др.). Так, получение трансгенных свиней с изменённой экспрессией генов,

определяющих отторжение органов, позволит использовать этих животных для ксенотрансплантации (пересадки органов свиньи человеку). В практических целях трансгенные животные используются различными зарубежными фирмами как коммерческие биореакторы, обеспечивающие производство разнообразных медицинских препаратов (антибиотиков, факторов свёртываемости крови и др.). Кроме того, перенос новых генов позволяет получать трансгенных животных, отличающихся повышенными продуктивными свойствами (например, усиление роста шерсти у овец, понижение содержания жировой ткани у свиней, изменение свойств молока), устойчивостью к различным заболеваниям, вызываемым вирусами и другими

23

патогенами. В настоящее время человечество уже использует множество продуктов, получаемых с помощью трансгенных животных.

Задание: изучить способы получения трансгенных животных, их свойства.

Задание №1: зарисовать и изучить схему получения трансгенных животных методом инъекции ДНК в оплодотворённую яйцеклетку.

Задание №2: ответить на вопросы.

1.Дать определение трансгенным организмам.

2.Как осуществляется процесс переноса генетической информации в птицеводстве?

Домашнее задание: какое практическое значение имеют трансгенные животные и растения?

2.2Химеры и способы их получения

Понятие химера (греч. Chimaira) означает составное животное.

По классификации К. Форда следует различать первичный химеризм, когда разные клеточные популяции сосуществуют с момента оплодотворения или раннего эмбриогенеза и вторичный, при котором комбинируются ткани от двух и более взрослых особей или эмбрионов после начала глубокой клеточной дифференцировки.

В настоящее время одним из перспективных направлений биотехнологии является искусственное получение химер или генетических мозаиков.

Сущность такого биотехнического метода, основанного на достижениях клеточной инженерии и микроманипуляций на ранних эмбрионах, заключается в искусственном объединении эмбриональных клеток двух или более животных. Полученные животные - химеры несут признаки разных генотипов. Современная микрохирургия позволяет получать химер, имеющих четырёх и более родителей.

24

Агрегационный метод. Сущность метода заключается в следующем: два эмбриона, различающиеся генотипами на стадии 8 – 12 бластомеров, обрабатывают протеолитическим ферментом проназой, освобождают от прозрачной оболочки и сближают друг с другом в культуральной сред е до образования бластоцисты. Агрегационные химеры можно получать не только между двумя эмбрионами, но и между различным числом изолированных бластомеров или отдельными частями эмбрионов. Преимущество агрегационного метода состоит в том, что он не требует вмешательства микрохирургической техники (рис. 8).

А – агрегационный метод

Б - инъекционный метод

Рис. 8 – Схема получения химерных мышей (Б.П. Завертяев, 1989)

Используя химерных мышей и специальные методы анализа ферментов, доказали, что многоядерные клетки - результат слияния одноядерных клеток.

Изучение химерных животных позволило решить немало трудных вопросов, и в будущем благодаря применению этого метода появится возможность решать сложные проблемы генетики и эмбриологии.

Инъекционный метод. Данный метод требует применения микроманипуляционной техники и микроскопического вмешательства. При инъекционном способе используются эмбрионы, находящиеся на стадии бластоцисты. Бластоцисту удерживают всасывающей пипеткой, и используя микроманипуляторы, в трофобласте путём проколов делают отверстия, через

25

которые инъецируют ВКМ (внутриклеточную массу) донорского зародыша. Полученную химерную бластоцисту трансплантируют мыши-реципиенту.

В начале 80-х годов была предпринята попытка получения химерных телят от коров Bos taurus и Bos indicus, используя при этом агрегационный метод, но полученные таким образом химерные молекулы погибали, соответственно данный метод неприемлем для получения химер крупного рогатого скота, так как трудно удалить 5%-й проназой зону пеллюцида. Кроме того, ещё нет надёжных сред для культивирования in vitro 8-12 клеточных смешанных агрегатов бластомеров. Для получения химер крупного рогатого скота использовали метод инъекции ВКМ бластоцисты донора в бластоцель реципиентного эмбриона. Были получены межвидовые химеры между овцой и козой, которых назвали овцекозами. Для получения межвидовых химер применяли агрегационный и инъекционный методы. Шерсть у таких животных представляла собой смесь волос исходных видов, рога по строению как у козы, но закручены как у барана, а экстерьер соответствовал одному из родительских видов. Химерные животные не передают потомкам характерную для них генетическую мозаичность. Подобно гетерозиготным или гибридным животным у потомков происходит расщепление, в результате чего нарушаются цельные генетические комбинации.

Задание: изучить способы получения животных с новыми хозяйственными признаками.

Задание №1: зарисовать схему получения химерных мышей.

Задание №2: отметить отличительные особенности агрегационного и инъекционного способа получения химер. Задание выполнить по форме таблицы №4, наличие или отсутствие тех или иных операций отмечать знаками « + », « - ».

26

Таблица 4- Отличительные особенности методов получения химерных организмов

№	Операции	Способы получения химер
		агрегационный	инъекционный
1	Использование
	микроманипуляционной техники
2	Обработка бластомеров для слияния
	проназой
3	Есть возможность получать
	химерные организмы между
	отдельными частями эмбрионов.

Домашнее задание: отметить практическую значимость химерных

животных.

2. 3 Клонирование, как способ совершенствования существующих пород, линий и типов сельскохозяйственных животных

Известно, что ядро соматической клетки обладает полной генетической информацией о данном организме и если создать условия для реализации этой информации, то можно получить практически неограниченное число генетических копий (клонов) определённой особи. Успешное клонирование датировано1970 годом получением лягушки (таблица 5).

Таблица 5 – История клонирования млекопитающих

Год получения	Вид животных
клонов
1996	овечка Долли
1997	первая мышь
1998	первая корова
1999	первый козёл.
2001	первая кошка
2002	первый кролик
2003	первые бык, мул, олень
2004	первый опыт клонирования с коммерческими целями (кошки).
2005	первая собака (афганская борзая по кличке Снуппи).
2006	первый хорёк
2007	вторая собака
2008	третья собака (лабрадор по кличке Чейс). Клонирована по государственному
	заказу. Начало коммерческого клонирования собак
2009	первое успешное клонирование верблюда, также впервые на Ближнем Востоке
	(а именно в Иране) была успешно клонирована коза (предыдущие страны,
	которым это удалось: США, Великобритания, Канада, Китай).

27

Существует несколько способов получения идентичных животныхклонирование животных путем пересадки ядер соматических клеток в энуклеированные яйцеклетки; клонирование эмбрионов путем пересадки ядер эмбриональных клеток в энуклеированные яйцеклетки; создание партеногенетических животных

Клонирование животных путем пересадки ядер соматических клеток в энуклеированные яйцеклетки. Опыт клонирования эмбрионов путем пересадки ядер тотипотентных клеток из эмбрионов в энуклеированные яйцеклетки послужил базой для разработки метода клонирования животных путем пересадки ядер соматических клеток в энуклеированные яйцеклетки. Отличие состоит в том, что клонирование путем пересадки ядер эмбриональных клеток обеспечивает получение идентичных животных между собой, тогда как пересадка ядер соматических клеток взрослого животного обеспечивает получение идентичных по генотипу с животным-донором соматических клеток. Это открывает возможность получать неограниченное число генетически идентичных потомков уже в первом поколении. Возможность получения клонов животных с использованием ядер соматических клеток была впервые продемонстрирована в 1997 г. получением овцы Долли (рис. 9).

Рис. 9 – Схема клонирования животного на примере овечки Долли. (Б. Глик, 2002)

28

Клонирование эмбрионов путем пересадки ядер эмбриональных клеток в энуклеированные яйцеклетки. После пересадки ядер эмбриональных клеток в энуклеированные яйцеклетки ядро репрограммируется таким образом, что начинает развиваться новый эмбрион. Теоретически все бластомеры из эмбриона донора имеют одну и ту же генетическую основу и, таким образом, способны обеспечить развитие идентичных особей. Эмбрионы, развившиеся после пересадки ядер, в свою очередь, могут быть использованы как доноры ядер. После нескольких генераций создается возможность получения сотен и даже тысяч идентичных эмбрионов.

Клонирование эмбрионов путем пересадки ядра включает три основных этапа: выделение интактного ядра донора, энуклеацию ооцита, пересадку ядра в энуклеированную яйцеклетку. В отличие от амфибий пересадка ядра у млекопитающих не стимулирует ооцит. Поэтому требуется четвертый этап — активация ооцита и слияние мембран яйца и ооцита. Под действием электрического импульса происходит активация ооцита и слияние мембран между ядром клетки донора и энуклеированным ооцитом-реципиентом. Технология пересадки ядер клетки способствовала успешному получению клонированных живых кроликов, мышей, овец, коз, крупного рогатого скота и свиней. Было показано, что только эмбрионы на предимплантационной стадии являются тотипотентными, но эффективность этой технологии пока низка.

Получение однояйцовых близнецов. Однояйцовые близнецы имеют большое значение для животноводства. С одной стороны, увеличивается выход телят от одного донора, а с другой — появляются генетически идентичные двойни. Получение идентичных двоен в большом количестве могло бы облегчить оценку быков по качеству потомства, уменьшить стоимость спермопродукции, ускорить и удешевить тестирование препаратов и упростить исследования в области кормления животных.

В 1981 году был разработан один из способов получения однояйцовых близнецов. Микроманипуляции проводятся на 6-8 суточных эмбрионах, находящихся на стадии поздней морулы или ранней бластоцисты. Бластоцисту разрезают на две

29

части с помощью специального микроманипулятора, разделяющего эмбрион на половинки после извлечения из оболочек, такой способ получил название – дисекция.

Этапы разделения:

1.вымывание эмбриона;

2.освобождение из зоны пеллюцида (химическим или механическим способом);

3.разделение бластомеров (или разделение пополам клеточной массы

– морулы или бластоцисты);

4.заключение одиночных бластомеров в пустую золу пеллюцида;

5.помещение в агар;

6.трансплантация промежуточному реципиенту.

Создание партеногенетических животных. Под партеногенезом понимают развитие эмбриона из женской гаметы без участия мужской половой клетки. Из этого определения видно, что партеногенетические особи в хромосомах содержат только гены матери. Таким образом, партеногенез принимает форму бесполого размножения у животных с половым способом воспроизведения.

В биологии размножения животных разграничивают две разновидности партеногенеза — гиногенез и андрогенез. При гиногенезе сперматоз оид проникает в яйцеклетку, но функция его состоит лишь в активации яйцеклетки, эмбрион, же развивается без участия хромосом сперматозоида. Однако важно знать, что при гиногенезе сперматозоид может внести в ядро яйцеклетки внехромосомные, в том числе и наследственные факторы, которые могут принимать участие в индивидуальном развитии животного.

При андрогенезе в отличие от истинного партеноге неза после активации женской гаметы сперматозоидом весь генетический материал оплодотворенной яйцеклетки элиминируется, и поэтому эмбрион содержит лишь отцовский набор хромосом. В этом случае зигота, а затем и эмбрион развиваются только с участием набора хромосом мужского ядра.

30