новая папка / 4006360

4006360-Desc-ru var ctx = "/emtp"; The translation is almost like a human translation. The translation is understandable and actionable, with all critical information accurately transferred. Most parts of the text are well written using a language consistent with patent literature. The translation is understandable and actionable, with most critical information accurately transferred. Some parts of the text are well written using a language consistent with patent literature. The translation is understandable and actionable to some extent, with some critical information accurately transferred. The translation is not entirely understandable and actionable, with some critical information accurately transferred, but with significant stylistic or grammatical errors. The translation is absolutely not comprehensible or little information is accurately transferred. Please first refresh the page with "CTRL-F5". (Click on the translated text to submit corrections)

Patent Translate Powered by EPO and Google

French

German

  Albanian

Bulgarian

Croatian

Czech

Danish

Dutch

Estonian

Finnish

Greek

Hungarian

Icelandic

Italian

Latvian

Lithuanian

Macedonian

Norwegian

Polish

Portuguese

Romanian

Serbian

Slovak

Slovene

Spanish

Swedish

Turkish

  Chinese

Japanese

Korean

Russian

      PDF (only translation) PDF (original and translation)

Please help us to improve the translation quality. Your opinion on this translation: Human translation

Very good

Good

Acceptable

Rather bad

Very bad

Your reason for this translation: Overall information

Patent search

Patent examination

FAQ Help Legal notice Contact УведомлениеЭтот перевод сделан компьютером. Невозможно гарантировать, что он является ясным, точным, полным, верным или отвечает конкретным целям. Важные решения, такие как относящиеся к коммерции или финансовые решения, не должны основываться на продукте машинного перевода.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ US4006360A[]

Эта заявка относится к обнаружению мельчайших частиц и, в частности, к обнаружению мельчайших биологических материалов с помощью флуоресцентного излучения. This application relates to the detection of minute particles and more particularly to the detection of minute biological materials by fluorescent emission. Обычный метод обнаружения мельчайших биологических образцов, таких как клетки и т.п., заключается в дифференцированном окрашивании клеток красителями, которые при связывании с образцом излучают характерную флуоресценцию при соответствующем возбуждении. При окрашивании образца сравнительно разбавленным раствором красителя концентрация красителя, связанного с частицами, часто значительно превышает среднюю концентрацию красителя в растворе красителя. Более высокий уровень эмиссии от локальных концентраций красителя, вызванный связыванием, обычно позволяет отличить окрашенные образцы от фоновой эмиссии флуоресцентного красителя в окрашивающем растворе. A common method of detecting minute biological specimens such as cells and the like is to differentially dye the cells with stains which, when bound to the specimen, will emit a characteristic fluorescence upon appropriate excitation. When a sample is stained with a comparatively dilute solution of dye, the concentration of the stain bound to the particles is often considerably higher than the average concentration of stain in the dye solution. The higher level of emission from the local concentrations of stain caused by binding will ordinarily permit one to discriminate the dyed specimens from background emission from the fluorescing dye in the staining solution. Чтобы улучшить различение излучения связанного пятна и фонового излучения, можно, конечно, промыть образец, если образцы можно физически отделить от раствора красителя. Некоторые флуоресцентные красители не считаются полезными для окрашивания биологических образцов в ситуациях, когда краситель не может быть вымыт, потому что образцы не могут быть обнаружены на фоне обеспечиваемой интенсивной фоновой флуоресценции. Поскольку промывка не всегда осуществима, специалисты обратились к флуорохромным красителям, т. е. к красителям, которые слабо флуоресцируют (или не флуоресцируют вообще) при возбуждении, если только они не связаны с биологическим субстратом. In order to enhance the discrimination between the emission from the bound stain and the background emission, one can of course wash the specimen if the specimens can be physically separated from the dye solution. A number of fluorescent dyes have not been considered useful for staining biological samples in situations where the dye could not be washed out because the specimens could not be detected against the intense background fluorescence provided. Because washing is not always feasible the art has turned to fluorochrome dyes, i.e. dyes which will fluoresce weakly (or not at all) under excitation unless they are bound to the biological substrate. Однако там, где размер образца очень мал (например, нуклеиновые кислоты и т.п.), проблема различения становится серьезной. Например, минимальный объем образца, который можно просмотреть, ограничен дифракцией. Следовательно, образцы, намного меньшие, чем этот минимальный объем, имеют худшее отношение сигнал/шум по отношению к фону. Where however, the specimen size is very small (e.g. nucleic acids and the like) the problem of discrimination becomes severe. For example, the minimum volume of sample that can be viewed is diffraction limited. Hence, specimens much smaller than that minimum volume have poorer signal-to-noise ratios with respect to background. Другие факторы, не обязательно связанные с размером образца, также могут затруднить различение сигнала и фона для образцов. Например, коэффициент распределения (то есть отношение концентрации красителя в образцах к концентрации красителя на фоне) может быть низким. Кроме того, увеличение квантовой эффективности флуорохромных красителей при связывании с биологическим субстратом может быть небольшим. Other factors, not necessarily related to specimen size, may also make the signal-to-background discrimination for specimens difficult. For example, the partition ratio (i.e. the ratio of concentration of dye in the specimens to the concentration of dye in the background) may be low. Also, the increase in quantum efficiency of fluorochrome dyes on becoming bound to a biological substrate may not be large. Таким образом, основной целью настоящего изобретения является создание системы для различения флуоресцирующих окрашенных образцов от фона флуоресценции, вызванного молекулами красителя, диспергированными в жидкой среде. С этой целью система по настоящему изобретению содержит источник излучения, который может стимулировать флуоресцентное излучение молекул красителя, связанных с образцами, и свободных молекул красителя, диспергированных в окрашивающей среде. Предусмотрены средства для модуляции интенсивности излучения источника. Предпочтительно последняя представляет собой систему переключения, так что время нарастания и затухания стимулирующего излучения очень короткое. Наконец, в системе по настоящему изобретению после воздействия стимулирующего излучения на окрашенные образцы и фоновый краситель определяют амплитуду флуоресцентного излучения, начиная с заданного интервала времени после того, как стимулирующее излучение было смодулировано «выключено», и флуоресцентное излучение после этого контролируется в течение заданного периода времени, в течение которого стимулирующее излучение остается модулированным «выключенным». A principal object of the present invention is therefore to provide a system for discriminating fluorescing dyed specimens from a background of fluorescence due to dye molecules dispersed in a liquid medium. To this end, the system of the present invention comprises a source of radiation which can stimulate fluorescent emission from dye molecules bound to specimens and from the free dye molecules dispersed in the staining medium. Means are provided for modulating the intensity of radiation from the source. Preferably the latter is a switching system so that the rise and decay times of the stimulating radiation are very short. Lastly, in the system of the present invention, following exposure of dyed specimens and background dye to stimulating radiation, the amplitude of fluorescent emission is determined starting at a predetermined time interval after the stimulating emission has been modulated "off", and the fluorescent emission is thereafter monitored for a predetermined period during which the stimulating radiation remains modulated "off". Другие цели изобретения будут частично очевидны и частично появятся далее. Изобретение, соответственно, включает устройство, имеющее конструкцию, комбинацию элементов и расположение частей, а также способ, включающий несколько этапов и их порядок, все из которых проиллюстрированы в следующем подробном раскрытии, и объем применения которого будет быть указаны в исковых требованиях. Other objects of the invention will in part be obvious and will in part appear hereinafter. The invention accordingly comprises the apparatus possessing the construction, combination of elements, and arrangement of parts, and the method comprising the several steps and order thereof, all of which are exemplified in the following detailed disclosure, and the scope of the application of which will be indicated in the claims. Для более полного понимания сущности и задач настоящего изобретения следует обратиться к следующему подробному описанию, взятому в связи с прилагаемыми чертежами, на которых: For a fuller understanding of the nature and objects of the present invention, reference should be had to the following detailed description taken in connection with the accompanying drawings wherein: ИНЖИР. 1 представляет собой блок-схему, показывающую примерную систему, воплощающую принципы настоящего изобретения; а также FIG. 1 is a block diagram showing an exemplary system embodying the principles of the present invention; and ИНЖИР. 2 представляет собой временную диаграмму, показывающую работу системы по фиг. 1. FIG. 2 is a timing diagram showing the operation of the system of FIG. 1. Во многих случаях квантовая эффективность (Q.sub. E) флуоресцентного красителя (то есть отношение испущенных квантов к поглощенным) различается в зависимости от того, связан или не связан краситель с субстратом. Особенно это касается флуорохромных красителей. Таким образом, если КЭ двух одинаковых молекул красителя различны, то и времена жизни их возбужденных состояний различны. В настоящем изобретении эта разница в статистическом времени жизни возбужденных состояний используется для различения соответствующих множеств связанных и несвязанных молекул красителя, и эта разница преувеличивается или усиливается за счет использования временного стробирования. In many instances, the quantum efficiency (Q.sub. E) of a fluorescent dye (i.e. the ratio of emitted quanta to absorbed quanta) differs depending upon whether the dye is bound or not bound to a substrate. This is particularly true with respect to fluorochrome dyes. If the QE of two identical dye molecules thus differs, the lifetimes of their excited states are different. The present invention employs this difference in the statistical lifetime of excited states to discriminate between respective pluralities of bound and unbound dye molecules, and the difference is exaggerated or amplified by the use of time-gating. В частности, когда возбужденные состояния двух видов частиц (например, связанных и несвязанных красителей) статистически затухают с соответственно разными скоростями, определяется интенсивность флуоресцентного излучения в течение заданного интервала времени после задержки, следующей за одновременным началом затухания излучения обоих веществ. видов, задержка которых порядка времени жизни распада 1/e (или больше) видов, имеющих меньшее время жизни излучения. Такое определение обеспечивает как обнаружение присутствия, так и количественную оценку видов с более длительным временем жизни эмиссии, резко отличающихся от эффектов других видов. Термин «статистическое затухание», используемый здесь, предназначен для обозначения экспоненциального затухания интенсивности флуоресценции, характерного для популяции частиц, первоначально находящихся в возбужденном состоянии, после прекращения их входной энергии возбуждения. Specifically, where the excited states of two species of particles (e.g. bound and unbound dyes) statistically decay at respectively different rates, a determination is made of fluorescent emission intensity during a predetermined interval following a delay subsequent to the simultaneous onset of emission decay of both species, which delay is on the order of the 1/e decay life (or longer) of the species having the shorter emission lifetime. Such determination provides both detection of the presence and a quantitative measure of the species having the longer emission lifetime, sharply discriminated from the effects of the other species. The term "statistical decay" as used herein is intended to mean the exponential fluorescent intensity decay characteristic of a population of particles initially in an excited state, following cessation of their input excitation energy. Два вида частиц могут быть, как уже отмечалось, одними и теми же молекулами красителя в связанном и несвязанном состояниях или даже разными молекулярными видами флуоресцентных материалов, при условии, что частицы демонстрируют разную квантовую эффективность. The two species of particles can be, as noted, the same dye molecules in bound and unbound states, or even different molecular species of fluorescent materials, provided that the species exhibit different quantum efficiencies. Когда виды представляют собой флуоресцентные красители или красители, которые будут связываться с органическими соединениями, огромное их количество хорошо известно специалистам в данной области. Например, в качестве красителей, которые предпочтительно окрашивают белки, такие как цитоплазма лейкоцитов или гранулы в гранулоцитах, можно использовать ряд сульфированных триазинильных производных, таких как диаминостильбен, каждая аминогруппа которого находится в каждом из фенильных колец молекулы стильбена. Типичным примером такого красителя является 4,4'-бис(4-(3-сульфоанилино)-6(бис(2-гидроксиэтил)-амино)-1,3,5,триазин-2ил)аминостильбен 2,2. тетранатриевая соль '-дисульфоновой кислоты (далее LN). Where the species are fluorescent stains or dyes which will bind to organic compounds, a huge number are well known to those skilled in the art. For example, as dyes which preferentially stain proteins such as leucocyte cytoplasm or the granules in granulocytes, one can employ a number of sulfonated triazinyl derivatives such as a diamino stilbene having each amino group in each of the phenyl rings of the stilbene molecule. A typical example of such dye is 4,4'-bis (4-(3 sulfoanilino)-6(bis (2-hydroxy-ethyl)-amino)-1,3,5, triazin-2yl) amino stilbene 2,2'-disulfonic acid tetrasodium salt (hereinafter referred to as LN). Предполагается, что структура LN выглядит следующим образом: ##STR1## The structure of LN is believed to be as follows: ##STR1## Флуоресцентные красители, подходящие для специфического окрашивания гранул эозинофилов, представляют собой анилино- или толуидино-нафталинсульфокислоты и их алкил-, алкокси- или галогензамещенные производные; 4,4'-диаминостильбен, 2,2'-дисульфокислота, N,N,N',N'-тетрауксусная кислота и ее алкильные, алкокси- или галогензамещенные производные; сульфированные флуоресцентные производные 1,8-нафталимида, такие как бриллиантовый сульфафлавин и его алкил-, алкокси- или галогензамещенные производные; 8-п-толуидино-1-нафталинсульфокислота и ее алкил-, алкокси- или галогензамещенные производные; и 8-гидрокси-1,3,6-пирентрисульфоновую кислоту и ее алкильные, алкокси- и галогенпроизводные. Эти красители сильно окрашивают гранулы эозинофилов в зелено-голубую или зеленую флуоресценцию. Fluorescent dyes suitable for specifically dyeing eosinophil granules are the anilino or toluidino naphthalene sulfonic acids and their alkyl, alkoxy or halogen substituted derivatives; 4,4' diamino stilbene 2,2' disulfonic acid, N, N, N', N' tetraacetic acid and its alkyl, alkoxy or halogen substitutes derivatives; sulfonated fluorescent derivatives of 1,8 naphthalimide, such as brilliant sulfaflavine and its alkyl, alkoxy or halogen substituted derivatives; 8-p-toluidino-1 naphthalene sulfonic acid and its alkyl, alkoxy or halogen substituted derivatives; and 8-hydroxy-1, 3, 6 pyrene trisulfonic acid and its alkyl, alkoxy and halogen derivatives. These dyes strongly stain the eosinophil granules with a green-blue or green fluorescence. Красители, придающие нуклеиновым кислотам сильную флуоресценцию, предпочтительно представляют собой катионные красители, например фенантридиниевые красители, такие как галогенид этидия (2,7-диамино-10-этил-9-фенилфенантридинийбромид, далее именуемый ЕВ) и его алкил, алкокси или производные галогена; в сухих мазках — акридиновый оранжевый; и родулин оранжевый. Предполагается, что структура ЭБ выглядит следующим образом: ##STR2## Dyes which impart a strong fluorescence to nucleic acids preferably are cationic dyes, for example the phenanthridinium dyes such as an ethidium halide, (2,7 diamino - 10 ethyl-9 phenyl phenanthridinium bromide, hereinafter referred to as EB) and its alkyl, alkoxy or halogen derivatives; and in dry smears, acridine orange; and rhoduline orange. The structure of EB is believed to be as follows: ##STR2## Приведенный выше список ни в коем случае не следует рассматривать как исчерпывающий для красителей, подходящих для использования в настоящем изобретении. Действительно, большое количество других флуоресцентных красителей, которые можно использовать, описано в Biological Stains, R.D. Lillie, the Williams & Wilkens Co., Baltimore, 1969. The foregoing listing is not to be considered in any sense exhaustive of the dyes which are suitable for use in the present invention. Indeed, a large number of other fluorescent dyes which can be used are described in Biological Stains, R. D. Lillie, the Williams & Wilkens Co., Baltimore, 1969. Обратимся теперь к системам изобретения, показанным на фиг. 1 можно увидеть в блок-схеме образец 20 мельчайших образцов (не показаны) в жидкой среде, причем такие образцы связывают с собой молекулы соответствующего флуоресцентного красителя, образуя первый вид флуоресцентных частиц. Второй вид состоит, например, из того же красителя, присутствующего в свободной или несвязанной форме в жидкой среде. Настоящее изобретение включает источник света 22, который может быть любым из ряда источников возбуждающего излучения, которые будут стимулировать или индуцировать флуоресцентное излучение молекул красителей обоих видов в образце 20. Referring now to the systems of the invention shown in FIG. 1, there will be seen, in block schematic form, a sample 20 of minute specimens (not shown) in a liquid medium, such specimens having bound thereto molecules of an appropriate fluorescent dye so as to form a first species of fluorescent particles. A second species is, for example, constituted of the same dye present in free or unbound form in the liquid medium. The present invention comprises light source 22 which can be any of a number of sources of excitation radiation which will stimulate or induce fluorescent emission from the dye molecules of both species in sample 20. Источник 22 света сам по себе может быть узкополосным источником света, соответствующим полосе длин волн возбуждения флуоресценции красителя, или может быть широкополосным источником света вместе с соответствующей фильтрацией. Используемый здесь термин «свет» включает не только видимое излучение, но также и излучение, в частности, в ультрафиолетовой области. Таким образом, источником 22 света может быть любой из ряда лазеров, выбранных в соответствии с характером полосы выходных длин волн, или, как правило, может быть широкополосный источник высокой интенсивности, например угольная дуга и т.п. вместе с соответствующей фильтрацией полосы пропускания, которая может быть обеспечена интерференционным фильтром. Например, при использовании LN в качестве красителя следует использовать источник света, имеющий высокую интенсивность в диапазоне длин волн в диапазоне от 320 до 390 мкм. Для анилино- и толуидино-нафталинсульфокислот источник света 22 следует выбирать так, чтобы он обеспечивал сильную выходную интенсивность в диапазоне от 320 до 410 мкм. Точно так же выход источника света 20 при использовании блестящего сульфафлавина в качестве красителя должен находиться в диапазоне от 360 до 450 мкМ, а когда в качестве красителя используется бромид этидия, источник света 20 должен обеспечивать высокую интенсивность излучения в диапазон от 480 до 550 мкм. Light source 22 may itself be a narrow band source of light matched to the fluorescence excitation wavelength band of dye, or can be a broad band source of light together with appropriate filtering. The term "light" as used herein is intended to include not only visible radiation but radiation particularly in the ultra-violet region as well. Thus, light source 22 can be any of a number of lasers selected according to the nature of the output wavelength band or typically can be a high intensity, broadband source e.g. a carbon arc or the like, together with appropriate passband filtering such as can be provided by an interference filter. For example, when using LN as the dye, one would employ a light source having high intensities in the wavelength band in the range of 320 to 390 m.mu.. For anilino and toluidino naphthalene sulfonic acids, light source 22 should be selected to provide a strong output intensity in the range of 320 to 410 m.mu.. Similarly, the output of light source 20 when using brilliant sulfaflavine as the dye should be in the range of 360 to 450 m.mu., and when ethidium bromide is employed as the dye, light source 20 should provide a strong output intensity in the range of 480 to 550 m.mu.. Флуорохромные красители особенно проявляют более высокую квантовую эффективность, когда они связаны с органическим субстратом, чем когда они несвязаны. Что касается красителей, которые имеют такие разные квантовые эффективности в зависимости от связанного или несвязанного состояния, то свободные или несвязанные молекулы в фоновой жидкости при стимуляции будут демонстрировать флуоресценцию, которая статистически затухает гораздо быстрее, чем молекулы красителя, связанные с органическим веществом. подложка. Чтобы оптимально использовать разницу в скоростях затухания для различения источников флуоресценции, предусмотрены временные стробирующие средства, такие как модулятор 24, для модуляции интенсивности выходного излучения источника 22. Предпочтительно такая модуляция работает так, что свет от источника 22, направленный на образец 20, периодически облучает образец между некоторым минимальным или темным уровнем (предпочтительно нулевым излучением) и максимальной интенсивностью с очень коротким временем нарастания и спада. Время спада возбуждающего излучения источника 22 при модуляции модулятором 24 должно быть не более того же порядка и желательно меньше времени спада флуоресцентного излучения несвязанных молекул красителя. Fluorochrome dyes particularly exhibit higher quantum efficiencies when bound to an organic substrate than when unbound. With regard to dyes which have such differential quantum efficiencies depending upon the bound or unbound state, free or unbound molecules in the background liquid will exhibit, when stimulated, a fluorescence which statistically decays much more quickly than the dye molecules which are bound to an organic substrate. To take optimal advantage of the difference in decay rates to discriminate between the sources of the fluorescence, time gating means such as modulator 24 are provided for modulating the intensity of the radiant output from source 22. Preferably, such modulation operates so that light from source 22 directed onto sample 20 irradiates the sample periodically between some minimal or dark level (preferably zero radiation), and a maximum intensity, with very short rise and fall times. The fall time of the exciting radiation from source 22 as modulated by modulator 24 should be not more than the same order of magnitude and preferably shorter than the decay time of the fluorescent emission from the unbound dye molecules. Конечно, «время затухания» — это время, необходимое для того, чтобы интенсивность флуоресценции уменьшилась до доли, равной 1/e от ее исходной интенсивности. The "decay time", of course, is the time requires for the intensity of fluorescence to decay to a fraction, 1/e of its original intensity. Таким образом, модуляция источника 22 света может быть достигнута, например, путем синхронизации мод последнего, в случае, когда источником 20 света является импульсный лазер известного типа, например лазер модели 165, коммерчески доступный от Spectraphysics Co., Mountain. Вид, Калифорния. В таком случае модулятор 24 будет управлять синхронизацией мод, например, пьезоэлектрический синхронизатор мод модели 361 Spectraphysics, управляемый генератором с частотой 70 МГц. В качестве альтернативы источник 22 света может быть источником непрерывной волны, а модуляция источника может быть обеспечена путем вставки чрезвычайно высокоскоростного прерывателя, такого как устройство на эффекте Поккельса, между источником непрерывной волны и образцом 20. В этом последнем случае модулятор 24 будет содержать как устройство на эффекте Поккельса, так и генератор импульсного поля, который обеспечивает необходимое электрическое поле. В любом случае модулятор 24 может обеспечивать электрический сигнал, который управляет или синхронизируется с модуляцией света от источника 22. Thus, modulation of light source 22 can be achieved for example by mode-locking the latter, in the case where light source 20 is a known-type of pulsed laser, for example, a Model 165 laser commercially available from Spectraphysics Co., Mountain View, California. In such case, modulator 24 would be the mode locking control, such as Spectraphysics' piezoelectric Model 361 mode locker driven by a 70 MHz oscillator. Alternatively, light source 22 could be a continuous wave source and modulation of the source can be provided by insertion of an extremely high-speed chopper such as a Pockels effect device between the continuous wave source and sample 20. In this latter instance, modulator 24 would comprise both the Pockels effect device and the pulse field generator which provides the requisite electrical field. In either case, modulator 24 can provide an electrical signal which controls or is synchronous with the modulation of light from source 22. Модулированный свет от источника 22 направляется на образец 20, содержащий взвесь окрашенных образцов в жидкости. Энергия, облучающая молекулы флуоресцентного материала, не должна быть достаточно интенсивной, чтобы вызвать обесцвечивание. Отбеливание может быть определено как склонность многих молекул, поднятых в сильно возбужденное состояние за счет подвода энергии, к фоторазложению или быстрой химической реакции с другими материалами, такими как растворенный кислород и т.п., тем самым изменяя молекулу настолько, что она теряет свою способность флуоресцировать. The modulated light from source 22 is directed onto sample 20 containing a suspension of dyed specimens in liquid. The energy irradiating the molecules of fluorescent material should not be intense enough to cause bleaching. Bleaching can be defined as the tendency of many molecules, when raised to a highly excited state by energy input, to photodecompose or readily react chemically with other materials such as dissolved oxygen or the like, thereby so altering the molecule that it loses its ability to fluoresce. Свет, излучаемый облучаемым образцом, фильтруется фильтром длин волн 26. Полоса пропускания последнего выбирается таким образом, чтобы различать свет от источника 22 и рассеянное излучение, с одной стороны, и характерные длины волн флуоресценции от молекул конкретного красителя, используемого для окрашивания частиц в образце 20. Обычно фильтр 26 представляет собой интерференционный фильтр или фильтр другого известного типа, характеристики полосы пропускания которого могут быть точно и узко адаптированы к конкретным центральным длинам волн. Свет, пропускаемый фильтром 26, предпочтительно далее передается через смотровую оптику 28 на детектор 30. Оптика 28 обычно представляет собой либо отражающую, либо преломляющую, либо катадиоптрическую систему, которая служит для сбора света и его концентрации в фокусной точке. Детектором 30 может быть любая из большого количества фотоэлектрических систем, таких как известные фотоумножители, которые обеспечивают на выходной клемме 32 электрический выходной сигнал, имеющий такой параметр, как амплитуда, пропорциональная интенсивности падающего на нее света. Light emitted from the irradiated sample is filtered by wavelength filter 26. The passband of the latter is selected so as to discriminate between light from source 22 and stray radiation on the one hand, and characteristic wavelengths of the fluorescence from the molecules of the particular dye used to stain the particles in sample 20. Typically filter 26 is an interference filter or other known type of filter, the passband characteristics of which can be precisely and narrowly tailored around specific central wavelengths. Light transmitted by filter 26 is preferably further transmitted through viewing optics 28 to detector 30. Optics 28 are typically either reflective, refractive or catadioptric systems which serve to collect light and concentrate same to a focal point. Detector 30 can be any of a large number of photoelectric systems, such as known photomultipliers, which provide at an output terminal 32 an electrical output signal having a parameter, such as amplitude, proportional to the intensity of light incident thereon. Как правило, можно использовать сфокусированный фотоумножитель, такой как модель VPM-153a производства Varian Associates, Пало-Альто, Калифорния, который обеспечивает коэффициент усиления около 10% и время нарастания и спада около 150 пикосекунд или меньше. Typically, one can employ a focussed photomultiplier such as the Model VPM-153a made by Varian Associates, Palo Alto, California which provides a gain of about 10@5 and exhibits rise and fall times of about 150 picoseconds or less. Как уже отмечалось, предусмотрены средства для определения после экспонирования частиц в образце 20 амплитуды флуоресцентного излучения связанных молекул красителя, но только после того, как интенсивность флуоресцентного излучения несвязанных молекул красителя в суспендирующей жидкости в образце 20 упадет ниже заданный уровень, например, до доли 1/e его исходной интенсивности. Это достигается за счет прямой или косвенной выборки флуоресцентного излучения в задержанном синхронизме с модуляцией возбуждающего излучения. В варианте осуществления по фиг. 1, например, выходной сигнал детектора исследуется, начиная с заданного времени после того, как свет от источника 22 модулируется до его минимальной или «выключенной» интенсивности. Таким образом, электронное стробирующее или переключающее средство 34, обычно полевой транзистор, диод или другой быстродействующий известный затвор, расположено для соединения и развязки выходного вывода 32 детектора 30 и входного вывода усилителя 36 в соответствии с электрическими сигналами, полученными от устройство фазовой задержки 38. As noted, means are provided for determining, following exposure of particles in sample 20, the amplitude of fluorescent emission from bound dye molecules, but only after the intensity of fluorescent emission from unbound dye molecules in the suspending liquid in sample 20 has decayed below a preset level, for example to the fraction 1/e of its original intensity. This is accomplished by sampling, either directly or indirectly, the fluorescent emission in delayed synchronism with the modulation of the exciting radiation. In the embodiment of FIG. 1 for example, the output of the detector is examined starting a predetermined time after the light from source 22 has been modulated to its minimum or "off" intensity. Thus, electronic gating or switching means 34, typically a field-effect transistor, diode or other fast known gate, is disposed for coupling and decoupling the output terminal 32 of detector 30 and the input terminal of amplifier 36 in accordance with electrical signals received from phase delay device 38. Последняя, которая может быть любой из ряда известных линий задержки или т.п., подключена, например, к формирователю частоты модулятора 24, чтобы обеспечить выходной электрический сигнал, фаза которого отстает от линейной частоты модулятора на заданное время или фазовая задержка определяется, например, в соответствии с известным временем затухания несвязанного красителя. Выход устройства задержки 38 соединен с затвором 34 для управления переключением последнего. Наконец, выход усилителя 36 соединен с входом средства 40, которым обычно является электронно-лучевой осциллограф, цифровое устройство отображения или любая другая из большого числа известных систем для отображения или хранения электрических сигналов. В этой системе детектор непрерывно регистрирует флуоресценцию, и отбирается только выбранная часть выходного электрического сигнала детектора. Вместо этого отбор проб может быть сделан непосредственно из самой флуоресценции путем запуска или стробирования работы детектора, то есть включения и выключения последнего в нужное время. The latter which may be any of a number of known delay lines or the like, is connected for example to the frequency driver of modulator 24 so as to provide an output electrical signal which phase lags the line frequency of the modulator by a predetermined time or phase delay determined for example, in accordance by the known decay time of the unbound dye. The output of delay device 38 is coupled to gating means 34 for controlling the switching of the latter. Lastly, the output of amplifier 36 is connected to the input of means 40 which is typically a cathode ray oscilliscope, a digital display device or any other of a large number of known systems for displaying or storing electrical signals. In this system then, the detector continuously detects the fluorescence and only a selected portion of the electrical output signal from the detector is sampled. Sampling can be instead made directly of the fluorescence itself by triggering or gating the operation of the detector, i.e. turning the latter on and off at the proper times. В качестве альтернативы, вместо дискретизации входных или выходных сигналов детектора можно дискретизировать усиленный сигнал от усилителя 36 путем выборочной модуляции дисплея 40. Alternatively, instead of sampling either the detector input or output signals, one can sample the amplified signal from amplifier 36 by selective modulation of display 40. Работа системы по фиг. 1 можно с успехом описать в связи с идеализированной формой сигнала на временной диаграмме фиг. 2, на которой показаны три формы волны, обозначенные А, В и С, все на общей временной основе или по оси абсцисс. Ордината каждой формы волны является образцом амплитуды. На фиг. 2А показана амплитуда света от источника 22, модулированного модулятором 24 в режиме включения-выключения, с началом в момент времени Т, с резким (или в идеале мгновенным) временем нарастания и по меньшей мере столь же резким прекращением в момент времени Т2, что обеспечивает идеализированный импульс прямоугольной амплитуды шириной w. Предпочтительно источник 22 модулируется модулятором 24, чтобы обеспечить множество одинаковых импульсов, каждый шириной w, с частотой повторения, имеющей период R. Когда образец 20 подвергается воздействию модулированного импульса, показанного на фиг. 2А, молекулы красителя в образце (импульс, содержащий длины волн в пределах полос поглощения молекул красителя и интенсивность, достаточную для возбуждения флуоресценции) затем начинают излучать с характерными для них флуоресцентными длинами волн. The operation of the system of FIG. 1 can be advantageously described in connection with the idealized waveform in the timing diagram of FIG. 2 wherein there are shown three wave forms, designated A, B and C, all on a common time base or abscissa. The ordinate of each wave form is exemplary of amplitude. In FIG. 2A, there is shown the amplitude of light from source 22 modulated by modulator 24 in an on-off mode to commence at time T, with an abrupt (or ideally instantaneous) rise time and at least an equally abrupt cessation at time T2 thereby providing an idealized rectangular amplitude pulse of width w. Preferably, source 22 is modulated by modulator 24 to provide a plurality of like pulses each of width w at a repetition rate having a period R. Where sample 20 is exposed to the modulated pulse of FIG. 2A, the dye molecules in the sample will (the pulse containing wavelengths within the absorption bands of the dye molecules and of intensity sufficient to excite fluorescence) then commence to radiate at their characteristic fluorescent wavelengths. ИНЖИР. На фиг.2В показан пример формы сигнала флуоресценции, характерной для несвязанных молекул красителя в течение периода R, возрастающей до максимума в интервале от Т1 до Т2 и экспоненциально и очень быстро затухающей с момента времени Т2 (когда амплитуда импульса на фиг.2А стала минимальный) до уровня 1/е в момент времени Т3. FIG. 2B shows a waveform exemplary of the fluorescence characteristic of unbound dye molecules during the period R, rising to a maximum during the interval T1 to T2, and decaying exponentially and very quickly from the time T2 (when the pulse amplitude in FIG. 2A has become minimal) to the level of 1/e at time T3. Предпочтительно задержка, вводимая в сигнал от модулятора 24 устройством задержки 38, представляет собой временной интервал между моментами времени Т2 и Т3, так что усилитель 36 наблюдает сигнал от детектора 30 только начиная с момента времени Т3. Preferably, the delay introduced into the signal from modulator 24 by delay device 38 is the time interval between time T2 and T3 so that amplifier 36 observes the signal from detector 30 only beginning at time T3. Форма волны на фиг. 2C иллюстрирует характеристику флуоресцентного излучения популяции связанных молекул красителя в образце 20 и, таким образом, обычно достигает максимума между моментами времени T1 и T2 таким же образом, что и несвязанные молекулы красителя, представленные на фиг. 2Б. Однако будет видно, что на фиг. 2С, хотя затухание флуоресценции связанных молекул красителя также является экспоненциальным, время затухания значительно больше. Следовательно, в момент времени Т3, когда несвязанная молекула красителя флуоресцирует, как показано на фиг. 2В, затухает до очень низкой или номинальной амплитуды, амплитуда флуоресценции связанных молекул по-прежнему очень высока, а отношение сигнала (флуоресценция связанного красителя) к фону или шуму (флуоресценция несвязанного красителя) значительно лучше. в момент времени T2, чем в любой момент между T1 и T3. Считывание сигнала с детектора 30 усилителем 36 предпочтительно продолжается в течение некоторого интервала времени до времени Т4 до следующего импульса от источника 22, и пока амплитуда сигнала на фиг. 2C остается примерно на столько же больше, чем форма сигнала на фиг. 2B по состоянию на момент времени T3. The waveform of FIG. 2C is exemplary of the fluorescence emission characteristic of a population of bound dye molecules in sample 20 and typically thus reaches a maximum between times T1 and T2 in the same manner as the unbound dye molecules typified by FIG. 2B. However, it will be seen that in FIG. 2C although the decay of fluorescence from the bound dye molecules is also exponential, the decay time is considerably longer. Hence at time T3, when the unbound dye molecule fluorescence, as exemplified by FIG. 2B, has decayed to a very low or nominal amplitude the amplitude of the fluorescence from the bound molecules is still very high and the ratio of signal (fluorescence from the bound dye) to background or noise (fluorescence from the unbound dye) is considerably better at time T2 than at any time between T1 and T3. Reading of the signal from detector 30 by amplifier 36 preferably continues for some time interval to time T4 prior to the next pulse from source 22 and while the amplitude of the waveform of FIG. 2C has remains approximately as much greater than the waveform of FIG. 2B as at time T3. Таким образом, будет видно, что использование временного стробирования позволяет очень четко различать излучение двух популяций молекул флуоресцентного красителя, которые демонстрируют соответственно разное время жизни в возбужденном состоянии, например, просто из-за разницы в состоянии связывания. Этот метод особенно применим к молекулам, которые флуоресцируют не за счет прямого поглощения возбуждающего излучения, а за счет передачи энергии (например, путем туннелирования) от соседних молекул, которые служат поглотителями. Излучение таких флуоресцентных материалов с переносом энергии (ETF) имеет тенденцию достигать пика только после некоторой задержки, вызванной явлением переноса. Таким образом, в случае, когда одним из видов частиц является такой материал ETF, задержка перед определением флуоресцентной эмиссии не обязательно основывается на времени затухания 1/e частиц, имеющих более короткое время эмиссии. Вместо этого можно обеспечить импульс стимулирующего излучения, который практически мгновенно поднимает интенсивность излучения одного вида до полной за счет прямого поглощения, но настолько короткий, что импульс модулируется «выключено» задолго до того, как материал ETF достигает пика излучения. It will therefore be seen that the use of time-gating permits one to discriminate very sharply between emissions from two populations of fluorescent dye molecules which exhibit respectively different excited-state lifetimes, such as may be simply due to the difference in binding state. This technique is particularly applicable to molecules which fluoresce, not by direct absorption of exciting radiation, but by energy transfer (such as by tunnelling) from adjacent molecules which serve as absorbers. The emission from such energy transfer fluorescing (ETF) materials tends to reach a peak only after some delay occasioned by the transfer phenomenon. Thus in the case where one of the species of particles is such an ETF material, the delay prior to determination of fluorescent emission is then not necessarily based on the 1/e decay life of the species having the shorter emission time. Instead, one can provide a pulse of stimulating radiation which raises one species to full emission intensity substantially instantaneously by direct absorption, but which is so short that the pulse has been modulated "off" well before the ETF material has reached peak emission. Даже если оба вида имеют одинаковую скорость затухания, если отложить определение эмиссии до тех пор, пока не будет достигнут пик эмиссии материала ETF, очевидно, что настоящий метод может обеспечить превосходную технику для различения типа переноса энергии флуоресценции от фона и других выбросы. Even if both species have the same decay rate, if one delays determination of emission until peak emission of the ETF material has been reached, it is apparent that the present method can provide a superior technique for discriminating energy transfer type of fluorescence from background and other emissions. Поскольку в вышеприведенное устройство и способ могут быть внесены определенные изменения, не выходя за рамки настоящего изобретения, подразумевается, что все материалы, содержащиеся в приведенном выше описании или показанные на сопроводительном чертеже, должны интерпретироваться в иллюстративном, а не в прямом смысле. ограничивающий смысл. Since certain changes may be made in the above apparatus and method without departing from the scope of the invention herein involved, it is intended that all matter contained in the above description or shown in the accompanying drawing shall be interpreted in an illustrative and not in a limiting sense.

Please, introduce the following text in the box below