л2 особенности стерилизации ПС

Особенности стерилизации питательных сред, содержащих твёрдые нерастворимые агломераты. Оценка эффективности процесса стерилизации.

Группы питательых сред с точки зрения стерилизуемости:

1 группа – однофазные жидкие среды – растворы

2 группа – двухфазные среды – жидкие среды, содержащие твердые, полностью увлажненные агломераты (комочки)

3 группа – трехфазные среды – жидкие среды, содержащие агломераты, не полностью увлажненные

Для однофазных сред при расчете времени выдержки справедливо уравнение:

При изотермической стерилизации вначале выбирают температуру стерилизации, далее для этой температуры по таблице определяют удельную скорость гибели, экспериментально или расчётом определяют общую обсемененность исходного раствора и задаются величиной N и рассчитывают время выдержки

Однофазные питательные среды-частный случай биосинтеза

Наиболее распространены в технологии биосинтеза двухфазные среды

Стерилизация питательных сред с полностью увлажнёнными агломератами (двухфазные среды)

Большинство промышленных питательных сред включают нерастворимые компоненты такие как: мука(кукурузная, соевая, пшеничная), крахмал, мел и некоторые другие. При суспензировании этих материалов, в то время как готовят питательную среду, могут образовываться агломераты (комочки), внутри которых будут микроорганизмы(их споры), часть этих микроорганизмов может остаться жизнеспособной при стерилизации среды и в последствии вызвать контаминацию питательной среды и содержимого биореактора. Для того чтобы все споры в комочке погибли весь комочек в начале должен быть прогрет до температуры стерилизации, а затем его нужно выдержать определённое время при этой температуре, пока не отомрут все микроорганизмы, содержащиеся внутри комочка

Время выдержки для твердой фазы:

- длительность нагрева комочка до температуры стерилизации, мин

- длительность отмирания микроорганизмов в комочке, мин

Для жидкой фазы:

=

Чтобы получить среду хорошего качества нужно чтобы микроорганизмы в жидкой и твёрдой фазе погибли за одно и тоже время. Если время выдержки жидкой фазы будет меньше, чем время выдержки твёрдой фазы, то в жидкости отмирание микроорганизмов произойдёт быстрее, чем в комочках, то в комочках могут остаться неотмершие микроорганизмы, что приведёт к контаминации содержимого биореактора. Если время выдержки жидкой фазы будет больше, чем время выдержки твёрдой фазы, то споры, находящие внутри комочка отомрут, но среда окажется передержанной, то есть снизится биологическая ценность питательной среды

Для сохранения биологической ценности питательной среды и гарантированной стерильности:

Длительность отмирания микроорганизмов в жидкой фазе:

- содержание микроорганизмов в жидкой фазе

Длительность отмирания микроорганизмов в твердой фазе (комочке):

- содержание микроорганизмов в твердой фазе (комочке).

Время нагрева твёрдого агломерата

Предполагаем, что комочек имеет форму шара с радиусом R.

Длительность нагрева комочка:

R – радиус комочка, м

– коэффициент температуропроводности, м²/сек – справочная величина

- выбранная температура стерилизации, ⁰С

- исходная температура внутри комочка, ⁰С

При периодической стерилизации принимают равной начальной температуре ПС (~ 18-20 ⁰С)

При непрерывной стерилизации - это температура в центре комочка, с которой он выходит из нагревателя и входит в выдерживатель УНС(установка непрерывной стерилизации). Обычно принимают 60-70 ⁰С

Подставим в (1)

(1)

Это уравнение описывает оптимальное соотношение длительности выдержки жидкой фазы, длительности нагрева и длительности отмирания микроорганизмов в твёрдой фазе.

При выбранной температуре стерилизации будут простерилизованы комочки радиуса R и меньше.

Комочки с радиусом больше R не прогреются до температуры стерилизации.

Такие комочки необходимо удалить из среды!!!

Расчёт радиуса ячейки сетки-фильтра

Для того чтобы из среды удалить комочки после смесителя, аппарата в котором готовят питательную среду ставят сетку-фильтр с размером отверстий равным тому радиусу, который посчитан, большие комочки задерживаются на сетке и не проходят на стерилизацию, обеспечивая биологическую ценность питательной среды

Радиус ячейки определяют по уравнению:

Стерилизация питательных сред с не полностью увлажненной твёрдой фазой

Особенности стерилизации трехфазных сред

Трехфазные питательные среды содержат не полностью увлажненные твердые агломераты (комочки).

Влажность спор в сухой зоне такого комочка – от 20 до 100%. Это зависит от размера агломерата; проницаемости оболочки, окружающей сухую зону в агломерате; скорости нагрева питательной среды.

Периодическая стерилизация –идёт медленный нагрев примерно 30 минут, что способствует увлажнению спор до 100%.

Непрерывная стерилизация –идёт быстрый нагрев среды, буквально за несколько секунд, прогрев комочка отстает от нагрева всей среды, особенно в начале выдержки. Влажность спор низкая, следовательно, маленькая удельная скорость гибели.

Было экспериментально определено, что если споры имеют влажность от 20 до 40%, то при температурах стерилизации 120-130 С, эти споры отмирают в 100-1000 раз медленнее, чем полностью увлажнённые

При непрерывной стерилизации невозможно добиться одновременной гибели спор в агломерате и в жидкой фазе. Стерильности трёхфазных сред можно достичь только если увеличить время выдержки, но это может негативно сказаться на биологической ценности ПС.

Всё это можно отнести к средам, которые содержат жировые компоненты (жировые пеногасители). Удельная скорость гибели в жировой фазе в несколько раз меньше, чем в жидкой фазе. В спору, окруженной оболочкой из этой жировой фазы очень тяжело проникает вода и таким образом удельная скорость отмирания очень низкая, поэтому жировые пеногасители и жировые компоненты нельзя стерилизовать с питательной средой вместе, их нужно стерилизовать отдельно и при жёстком режиме

Критерий стерилизации

Для количественной оценки эффективности стерилизации используют критерий стерилизации (критерий Дейндорфера): (набла).

Численное значение критерия стерилизации показывает, стерилен объект или нет.

Критерий стерилизации является мерой работы, которая должна быть совершена для уменьшения количества микроорганизмов в стерилизуемом объекте от N₀ до N.

Для процессов стерилизации питательных сред на биотехнологических производствах величина критерия стерилизации должна быть в пределах 40-100.

При < 40 – процесс стерилизации неэффективен (объект нестерилен)

Принимать > 100 нецелесообразно (очень жесткий режим стерилизации или перерасход пара)

Расчёт критерия стерилизации

Для изотермических процессов стерилизации (непрерывная стерилизация):

При периодической стерилизации температура меняется, меняется и удельная скорость отмирания (К) в зависимости от температуры по уравнению Арениуса. Тогда

Методом графического интегрирования

На графике выделены на оси времени-время нагрева,выдержки и охлаждения.

Построен температурный график процесса, это вот прямые, далее плато это выдержка при постоянной температуре, затем охлаждение от температуры стерилизации до некой другой температуры

Кривые на графики-зависимости удельной скорости отмирания в зависимости от температуры

Во время проведения периодической стерилизации исходное количество микроорганизмов в питательной среде нулевое, соответствует нулевой точке начала стерилизации среды или началу отмирания. При периодической температурный график начинает строится от 100 градусов, потому что при температуре ниже 100 градусов отмирает всего 2% микроорганизмов

За период нагрева при периодической стерилизации какое-то количество микроорганизмов уже отомрёт и на момент начала стерилизации количество микроорганизмов в среде уменьшится и станет некой величиной

Во врем выдержки отмирает основная часть микроорганизмов, а оставшиеся микроорганизмы отмирают в процессе охлаждения

Таким образом эту площадь под кривой можно разбить на три части:

-критерий нагрева

-критерий выдержки

-критерий охлаждения

период нагрева:

период выдержки:

период охлаждения:

+ +

Площадь под кривой – это и есть общий критерий стерилизации, включающий период нагрева, выдержки и охлаждения

Алгоритм расчета критерия стерилизации методом графического интегрирования

1. Строим температурный график процесса стерилизации. Точка отсчета на оси температуры – 100⁰С (т.к. до этой температуры отмирает всего 2% микроорганизмов). Скорость нагрева принимается по экспериментальным данным. Линия выдержки – это время выдержки по данным завода. Линия охлаждения также строится по экспериментальным данным скорости охлаждения, до 100⁰С.

2. На этом же графике строим кривую зависимости К от Т. На оси К наносим 2 контрольные точки: значение К при 100⁰С и значение К при температуре стерилизации (напротив значения t_стер на температурной оси).

3. На оси температуры произвольно выбираем температуры t₁ и t₂ (в интервале от 100⁰С до t_стер ), находим по графику, в какое время будут достигнуты эти температуры (τ₁ и τ₂).

4. По таблице зависимости К от t находим значения К₁ и К₂ для температур соответственно t₁ и t₂. На оси К отмечаем эти значения с учетом масштаба оси. Находим по графику точку пересечения К₁ при времени τ₁, К₂ при времени τ₂. Полученные точки соединяем кривой. Площадь под этой кривой – критерий нагрева.

5. Разбиваем площадь под кривой на геометрические фигуры (2 трапеции и 1 треугольник). Находим площадь этих фигур:

6) Аналогично строится кривая зависимости К от t для процесса охлаждения, определяем площадь под кривой и находим критерий охлаждения.

7) Критерий выдержки -

8) Общий критерий стерилизации + + . Сравниваем рассчитанное значение с рекомендуемым (40…100).

Если критерий стерилизации меньше 40, то увеличиваем время выдержки или температуру стерилизации (по возможности).

Если критерий стерилизации больше 100, то уменьшаем время выдержки.