л6 особенности культивирования клеток млекопитающих
.docxОсобенности аппаратурного оформления процессов культивирования клеток млекопитающих
Культивирование клеток представляет собой процесс, посредством которого in vitro отдельные клетки или единственная клетка прокариот или эукариот искусственно выращивается в контролируемых условиях. На практике термин культура клеток относится в основном к выращиванию клеток, относящихся к одной ткани, полученных от многоклеточных эукариот и чаще всего животных. Клетки млекопитающих во многом отличаются от прокариотических и грибных клеток, они медленнее растут, у них большая чувствительность к хранению и пузырькам воздуха. Эти свойства клеток оказывают влияние на конструкцию биореактора, на особенности системы перемешивания и аэрации, которые при работе не должны создавать стрессовых условий для культуры.
Монослойные (адгезивные) могут расти только прикреплённые к какому-нибудь субстрату
-Стационарные
-Роллерные
Суспензионные растут в виде суспензии одиночных клеток в жидкой питательной среде
Псевдосуспензионное культивирование-комбинация двух способов культивирования (поверхностно-зависимые клетки выращивают с помощью технологии суспензионных культур)
Преимущества монослойных култур:
Легко провести полную замену среды и промыть клетки перед добавлением свежей питательной среды
Позволяют обеспечить высокую плотность клеток (для размножения вирусов требуются тесные межклеточные контакты)
У многих клеток экспрессия требуемого продукта идёт эффективнее, если они прикреплены к субстрату
Монослойные культуры могут быть использованы для большинства типов клеток, что обеспечивает наибольшую гибкость исследований
Монослойные культуры широко используются:
Производство вакцин (клетки Веро и MDCK)
Использование недифференцированных клеток (клеточная терапия, вирусная терапия, биоанализы, многопрофильные исследования)
Субстраты для монослойной культуры:
Пластик-полистирол, поликарбонат, поливинилхлорид, тефлон
Стекло-пирекс (алюмоборосиликатное стекло, потому что натрийсиликатное может подщелачивать среду)
Металлы-нержавеющая сталь, титан (инертны и обладают высоким отрицательным поверхностным зарядом)
Для того чтобы клетки лучше прикреплялись к субстрату, поверхность субстратов необходимо модифицировать
Способы модификации поверхности:
Химическая обработка окисляющими агентами (смесью концентрированной серной кислоты и бихромата калия (хромовая смесь))
Физические воздействия (высоковольтовый разряд, УФ-свет, бомбардировка высокоэнергетическими электронами)
Обработка веществом, облегчающим прикрепление клеток (факторы адгезии)
Факторы адгезии помогают клетке связаться с субстратом, к ним относятся
Фибронектин-белок, которые содержится на поверхности нормальных клетов в плазме и сыворотке
Коллаген
Поли-L-лизин
Хондронектин (адгезия хондроцитов)
Ламинин (адгезия эпителиальных, нервных клеток)
Процесс адгезии включает две стадии:
Прикрепление клеток в субстрату
Распластывание клеток на субстрате
После того как клетка расплосталась начинается её размножение в питательной среде.
Монослойные культуры делятся на два способа их выращивания:
Стационарные культуры растут в неподвижных культуральных сосудах
Роллерные культуры-культуры, растущие в сосудах, вращаемых вдоль свей продольной оси
Посуда для выращивания монослойных культур адгезвных клеток
Выращивание стационарных культур происходит при соответствующих постоянных температурах, клетки млекопитающих культивируются при 37 градусах и поддерживается она в термостатах или в СО2 инкубаторах (в них поддерживается определенная концентрация углекислого газа).
Роллерное культивирование
Когда бутыли крутятся ПС распределяется по всей площади, следовательно площадь поверхности при культивировании увеличивается
Ребристые бутыли позволяют получить большее количество клеток
Роллер-инкубатор=шкаф в котором находится некое количество бутылей, расположенных на таких полочках, внутри роллера-инкубатора поддерживается необходимая температура, может поддерживаться необходимый уровень СО2 и др. условия.
1-роллер-инкубатор
2-роллер на колёсах перемещаются и могут быть поставлены либо в СО2-инкубатор, либо в отдельную термостатирующую комнату
3-барабанная роллерная установка
Недостатки монослойных культур:
Требования большого пространства
Возрастание стоимости и трудоёмкости при увеличении масштаба
Недостаточно эффективный контроль, обусловленный сложностями в определении и контролировании рН, концентрации кислорода
Данные недостатки можно устранить использованием псевдосуспензионным культивированием или культивированием клеток на микроносителях
На микроноситель прикрепляются поверхностно-зависимые клеточки и эти микроносители могут помещаться и суспензироваться в жидкую питательную среду, происходит выращивание как в глубинной культуре
Требования к материалу для микроносителей:
Нетоксичность для клеток
Невысокая впитываемость компонентов среды
Возможность повторного использования (возможность стерилизации)
Универсальность (возможность использования для разных клеток)
Материалы для микроносителей: поперечно-сшитые агароза и декстран, поливинилпирролидон, полиакрилнитрит, пористый силикагель, капрон, нейлон, полистирол, алюмосиликат, коллаген, желатин
Микроноситель помещают в ПС, суспензируют там перемешивая, далее засевают аппарат клетками млекопитающих, клетки прикрепляются к поверхности микроносителя, и размножаясь образуют монослой на каждой отдельной частичке микроносителя. По окончании культивирования, чтобы освободить микроносители от клеток, их обрабатывают специальными растворами с ферментами, которые позволяют клеткам отделиться.
Преимущества исползования микроносителей
Возможность эффективно контролировать параметры культивирования (рН, СО2)
Получение высокой плотности клеточной популяции- до 5-6 млн.кл/мл
Культивирование одновременно большого количества клеток
Ведение постоянного контроля за динамикой роста клеток
Снижение возможности контаминации
Экономия ПС
Возможность искусственно создавать различные концентрации микроносителей с выросшими на них клетками
Возможность пассирования культур без применения трипсина путём добавления свежей порции микроносителей
Культивирование клеток на микроносителях проводят в обычных биореакторах, но внутренняя поверхность должна быть без выступов или каких-либо карманов, чтобы предотвратить скопление микроносителей вот в этих застойных зонах(должно быть круглое днище и гладкие стенки, внутреннюю поверхность рекомендуется силиконизировать, чтобы предотвратить прилипание к поверхности микроносителей). Скорость перемешивания должна быть не более 40-60 оборотов в минуту.
В настоящее время можно культивировать суспензионные культуры в биореакторах, но должны соблюдаться некие условия: гомогенность перемешивания, перемешивание осуществляется при низких скоростях, пневматическое перемешивание или гидравлическое перемешивание может решить проблемы, связанные с раневым стрессом клеток. Для предотвращения пенообразования и повреждения клеток пузырьками воздуха можно уменьшить объём подаваемой газовой смеси, можно использовать поверхностную продувку или без пузырьковую аэрация через мембрану. При сокращении объёма подаваемого газа необходимо увеличить концентрацию кислорода. Оптимальное снабжение кислородом и азотом, воздухом и углекислым газом раздаётся с помощью систем перемешивания газа, такие системы тоже должны быть предусмотрены, потому что в отличие от культивирования микроорганизмов, когда аэрация осуществляется путём подачи стерильного воздуха и кислород поступает к клеткам из воздуха, при культивировании клеток млекопитающих аэрацию проводят смесью отдельных газов, то есть идёт отдельно чистый кислород, чистый азот, чистый СО2.
При стационарном способе культивировани клетки растут без добавления субстрата после посева культуры, но недостаток питательных веществ и образования токсичных продуктов метаболизма может снизить продуктивность клеток, чтобы избежать этих проблем используют стационарный с подпиткой. Питательне вещеста добавляются порциями в биореактор.
При непрерывном способе культивирования продукты метаболизма, которые могут ингибировать рост клеток, их удаляют добавляя компенсирующий объём свежей ПС, чтобы избежать недостатка субстрата для роста. Предпочтителен непрерывный способ культивирования с задержанием клеток.
Аппараты, которые используют для суспензионного культивирования
Особый вид мешалки! И скорость вращения меньше
Система аэрации тоже может отличаться. Барботёры не очень подходят, потому что когда пузырёк воздуха выходит из барботёра и двигается по столбу жидкости, то в какой-то момент этот пузырёк лопается и у рядом находящихся клеточек может возникнуть эффект контузии (стресс для клеток млекопитающих). Используется или поверхностная аэрация или пузырьковая продувка с использованием силиконовых трубочек, которые расположены в биореакторе
В этих биореакторах клетки могут культивироваться суспензионно и на микроносителях, поверхностно-зависимые клетки. Клетки захватываются в закреплённую подложку и не подвергаются раневому стрессу
Импеллеры-перемешивающее устройство
Перемешивание жидкости осуществляется воздушным вихрем без мешалки. (картинка слева). Сверху есть электродвигатель, который приводит в движение лопасти находящиеся над поверхностью жидкости, таким образом создаётся воздушный вихрь, он обеспечивает очень мягкое и экономичное 3д перемешивание жидкости, при этом перемешивание не травматичное. В бт используются для стандартизированной наработки стволовых клеток, для производства вакцин. Они есть 100 л и лабораторные. Преимущества мягкое 3д перемешивания, высокая скорость массообмена, очень малое энергопотребление, не меняет своих характеристик при разных коэффициентах наполнения, хорошо перемешиваются вязкие жидкости и жидкости, которые изменяют свою вязкость в процессе культивирования