КР3

Геном дрожжей. Клетка дрожжей, по сравнению с клеткой кишечной палочки, содержит в 3,5 раза больше ДНК. Вместе с тем, в качестве экспериментального объекта дрожжи обладают многими из технических преимуществ: способность быстро размножаться, возможность манипулирования отдельными клетками дрожжей, легкость одновременного переноса множественных культур дрожжей на селективные среды и выделения мутантов, детальную изученность дрожжей как генетической системы, возможность разностороннего использования системы генетической трансформации дрожжей. В отличие от многих микроорганизмов клетки дрожжей могут сохранять жизнеспособность при наличии в их генотипе множественных генетических маркеров. Дрожжи не патогенны, поэтому работа с ними не требует чрезвычайных мер предосторожности. У дрожжей сахаромицетов стабильны как гаплоидное, так и диплоидное состояния. Благодаря этому, с одной стороны, легко изолировать рецессивные мутации, которые обеспечивают мутантный фенотип у гаплоидных штаммов, и, с другой стороны, можно использовать диплоиды для проведения теста на комплементацию. Геном включает в себя 4 основных вида ядерных и цитоплазматических генетических детерминантов, состоящих как из ДНК, так и из РНК. Почти во всех штаммах S. cerevisiae присутствуют вирусы, содержащие днРНК, на долю которых приходится приблизительно 0,1% тотальной массы нуклеиновых кислот. Имеются три семейства РНК-содержащих вирусов, которые содержат днРНК L-A, L-BC и M; еще два вида днРНК, T и W, реплицируются в клетках дрожжей. ДнРНК M кодирует токсин, а L-A кодирует главный белок оболочки и компоненты, необходимые для репликации вирусов и поддержания M. Мутанты KIL-0, лишенные днРНК M и не вырабатывающие киллер-токсин, легко могут быть индуцированы химическими и физическими агентами, а также выращиванием культур при повышенной температуре. Митохондриальная ДНК, кодирует компоненты аппарата митохондриальной трансляции и приблизительно 15% митохондриальных белков. Мутанты g0 полностью лишены митохондриальной ДНК и дефектны по дыхательным полипептидам, синтезируемым на митохондриальных рибосомах, но жизнеспособны и еще сохраняют митохондрии, которые, однако, морфологически аномальны. Третьим компонентом генома является кольцевая 2 мкм плазмида, которая обнаруживается у большинства штаммов дрожжей и функционирует, по-видимому, лишь для обеспечения собственной репликации. Гаплоидный набор S. cerevisiae содержит 16 хорошо охарактеризованных хромосом, размер которых варьирует от 230 до 2352 т.п.н. На долю повторяющихся последовательностей приходится около 10% генома дрожжей. Хромосомы содержат также подвижные элементы ДНК, ретротранспозоны. Для обозначения генов, обнаруженных при систематическом секвенировании генома используется общая форма YCRXXw. Y – первая буква слова yeast (дрожжи); С (или A, B и т.д.) – обозначает хромосому III (или I, II и т.д.): R (или L) обозначает правое (или левое) плечо хромосомы; XX обозначает относительное положение начала открытой рамки считывания по отношению к центромере, и w (или c) обозначает уотсоновскую или криковскую нить хромосомной ДНК.

Трансформация у дрожжей: метод, использующий сферопласты, метод, использующий обработку клеток солями лития, и метод, основанный на использовании электропорации. Сферопласты для трансформации получают в результате действия гидролитических ферментов, частично удаляющих клеточную стенку, в присутствии осмотических стабилизаторов, типичным примером которых может служить 1 M сорбит. Клеточную стенку разрушают экстрактом из пищеварительных органов улиток, обычно именуемым глюзулазой. Трансформирующую ДНК добавляют к сферопластам и проводят соосаждение смеси раствором полиэтиленгликоля (ПЭГ), содержащим ионы Ca2+. Вслед за этим клетки ресуспендируют в растворе сорбита, смешивают с еще не застывшим агаром и затем выливают на поверхность чашки с селективной средой, содержащей сорбит - 10⁴ трансформантов на 1 мкг ДНК. Большинство исследователей используют для трансформации клетки, обработанные солями лития. После обработки клеток ацетатом лития, который увеличивает проницаемость клеточной стенки, добавляют ДНК и клетки соосаждают ПЭГ. Клетки подвергают непродолжительному тепловому шоку, отмывают от ПЭГ и ацетата лития и распределяют по поверхности обычной селективной среды. Широко используемый метод трансформации различных видов клеток, основан на индукции проницаемости клеток для ДНК под действием электрических полей. Свежевыращенные культуры дрожжей отмывают, суспендируют в растворе сорбита, добавляют ДНК и суспензии клеток сообщают импульс с помощью прибора для электропорации. Затем клетки распределяют по поверхности селективной среды.

Векторы дрожжей. Наиболее распространенные векторы дрожжей являются производными известной плазмиды pBR322 и содержат ориджин репликации (ori), обеспечивающий высокую копийность плазмиды в клетках кишечной палочки, и селективные маркеры устойчивости к антибиотикам – ген bla, определяющий устойчивость к ампициллину, и иногда ген tet – ген резистентности к тетрациклину. Наиболее часто в качестве таких селективных маркеров используются гены URA3, HIS3, LYS2, которые комплементируют специфические мутации ауксотрофности. Гены дрожжей URA3 и LYS2 в качестве маркеров для векторов дрожжей обладают дополнительным преимуществом, поскольку при их использовании возможна как позитивная, так и негативная селекция, т.е. отбор как клеток, содержащих плазмиду, так и клеток, утративших ее. Позитивная селекция основана на комплементации ауксотрофности, определяемой, соответственно, мутациями ura3 и lys2, тогда как для негативной селекции используют специфические ингибиторы, соответственно, которые подавляют размножение прототрофных штаммов, но не препятствуют росту мутантов, соответственно, ura3 и lys2. Биосинтез аденина у дрожжей контролируют, по меньшей мере, 8 неаллельных генов, но только мутации ade1 и ade2 вызывают образование красного пигмента мутантными клетками. Пигмент образуется в результате полимеризации промежуточного продукта биосинтеза аденина AIR. Мутации в генах, контролирующих более ранние этапы биосинтеза, по сравнению с генами ADE1 и ADE2, блокируют синтез AIR. Например, мутанты ade2 накапливают пигмент и образуют красные колонии, мутанты ade3 пигмента не накапливают и дают белые колонии, двойные мутанты ade2 ade3 не накапливают пигмент, поскольку синтез AIR блокирован, пигменту образовываться не из чего; соответственно колонии двойных мутантов будут белыми. В действительности колонии будут более или менее розоватыми, поскольку происходит потеря плазмиды и благодаря этому на поверхности колонии образуется множество мельчайших красных крапинок пигмента, накопленного клетками, которые потеряли плазмиду на последних стадиях роста колонии. Промотор GAL1. От двух регуляторных белков, Gal4p и Gal80p, зависит транскрипция галактозных структурных генов. После добавления галактозы в культуру клеток, растущих на несбраживаемом субстрате, PGAL1 может обеспечить быструю индукцию экспрессии присоединенных к нему нижележащих генов, вплоть до тысячекратной. Добавлением глюкозы в среду, содержащую галактозу, PGAL1 можно выключить. Сильная глюкозная репрессия PGAL1 позволяет определять терминальный фенотип жизненно важных генов. Этот промотор используется также для исследования явлений супрессии генетических дефектов или ингибирования роста при сверхпродуцировании определенных белков. lacZ и другие репортерные гены. Репортерные гены можно использовать для определения уровня транскрипции или уровня трансляции транскрипта при различных физиологических условиях. Наиболее общим применением репортерных генов оказалась идентификация цис-активных элементов, необходимых для транскрипции. С этой целью проводился систематический анализ серий мутаций в промоторных областях. Сходным образом репортерные гены использовались для идентификации трансактивных факторов, модулирующих экспрессию, т.е. транскрипцию или трансляцию. Ген lacZ Escherichia coli, кодирует β-галактозидазу. Активность этого гена допускает полуколичественную оценку при высеве клеток на чашку и вполне количественную оценку посредством определения ферментативной активности в жидких культурах. Используя искусственный субстрат X-gal, при расщеплении которого β-галактозидазой образуется продукт голубого цвета, можно по дифференциальному окрашиванию колоний определить редкие события, вызывающие изменения экспрессии репортерного гена. Векторы YIp. Интегративные векторы YIp неспособны реплицироваться автономно, но с низкой частотой интегрируются в геном посредством гомологичной рекомбинации. Рекомбинационная интеграция кольцевой плазмидной ДНК приводит к тому, что копия векторной последовательности фланкируется прямым повтором последовательности дрожжей. Сайт интеграции намечают, разрезая дрожжевой сегмент плазмиды YIp рестрикционной эндонуклеазой, и трансформируют дрожжевые клетки линеаризованной плазмидой. Линейные концы рекомбинагеннны и обеспечивают непосредственную интеграцию плазмиды в сайт генома, гомологичный этим концам. Вдобавок линеаризация приводит к повышению эффективности трансформации в 10–50 раз. Для векторов YIp обычно характерна однокопийная интеграция. Штаммы, сконструированные с использованием плазмид YIp, нужно проверять с помощью ПЦР или другими методами для подтверждения сайта интеграции. Существенной характеристикой трансформантов вообще и, в частности, трансформантов, полученных при использовании интегративных векторов, является митотическая стабильность – стабильны даже в отсутствие селективного давления. Однако интегрированная плазмида все-таки может теряться с частотой приблизительно 10^-3–10^-4 благодаря гомологичной рекомбинации между тандемными повторами. Векторы YEp. Эписомные плазмидные векторы YEp могут автономно реплицироваться в клетках дрожжей благодаря присутствию сегмента 2 мкм плазмиды, служащего ориджином репликации. Этот ориджин обеспечивает высокую частоту трансформации и присутствие множественных копий плазмиды в клетке. YEp относительно нестабильны. Темп их потери составляет от одного до нескольких процентов. При размножении в неселективных условиях митотическая стабильность таких плазмид обычно не превышает 40%, в селективных условиях она повышается до 60–95%. Копийность колеблется в пределах от 10 до 40, но плазмиды распределяются между клетками не поровну, и число копий на клетку в разных популяциях сильно варьирует. Имеются несколько систем, обеспечивающих очень высокую копийность плазмид YEp. Одна из таких систем использует мутацию leu2-d, определяющую частичную дефектность клеток по биосинтезу лейцина. Копийность векторов YEp-leu2-d составляет от 200 до 300, и после размножения в среде с дефицитом лейцина эта высокая копийность сохраняется на протяжении многих генераций уже при размножении в неселективных условиях. Векторы YEp-leu2-d применимы при больших объемах культур, выращиваемых на полноценных средах, на которых селекция плазмид невозможна. Чаще всего векторы YEp используют в тех случаях, когда необходима сверхпродукция какого-либо генного продукта. Векторы YCp. Центромерные плазмидные векторы YCp способны автономно реплицироваться и содержат центромерные последовательности CEN и автономно реплицирующиеся последовательности ARS. Копийность от 1 до 3; чаще всего вообще рассматриваются как однокопийные. Темп потери таких плазмид в неселективных условиях составляет приблизительно 1% на генерацию. В тетрадах, полученных от скрещивания трансформанта с YCp и нормального штамма, достаточно часто наблюдается расщепление 2:2 по наличию/отсутствию плазмиды. Эти векторы называют еще кольцевыми минихромосомами. Последовательности ARS либо просто соответствуют природным ориджинам репликации хромосом дрожжей, либо имеют с этими ориджинами существенные черты сходства. Функция центромерной последовательности CEN зависит от трех консервативных доменов, обозначаемых I, II и III; для митотической стабилизации векторов YCp необходимы все эти три элемента. Векторы YRp, содержащие ARS, но лишенные функциональных элементов CEN, трансформируют клетки дрожжей с высокой эффективностью, но слишком легко утрачиваются, темп их потери составляет 10% и выше. Соответственно их применение в качестве векторов ограничено. Приемлемая митотическая стабильность и низкая копийность векторов YCp делают предпочтительным их использование в качестве векторов для клонирования, конструирования библиотек геномных ДНК, исследования функций генов.

Искусственные хромосомы дрожжей. Для клонирования фрагментов длиной 200–800 т.п.н. используют искусственные хромосомы дрожжей (YAC). Разработаны методы переноса YAC в культивируемые эукариотические клетки, а также в клетки зародышевой линии экспериментальных животных. Кольцевой вектор pYAC4, способен реплицироваться в клетках E. coli и, подобно векторам YCp, содержит элементы ARS и CEN. Кроме того, он содержит маркерные гены TRP1 и URA3, а также ген HIS3, фланкированный инвертированным повтором теломерной последовательности инфузории, и ген-супрессор SUP4-o. В нуклеотидной последовательности этого гена присутствует сайт рестрикции EcoRI. Вектор сначала амплифицируют в бактериальных клетках, затем расщепляют рестриктазой BamHI. При этом вырезается ген HIS3 и получается линейная конструкция с элементами ARS и CEN, селективными маркерами и теломерными последовательностями на концах. Такая линейная структура (линейная минихромосома) может эффективно трансформировать дрожжевые клетки, но трансформанты получаются нестабильные. Несмотря на присутствие в минихромосомах элемента CEN, они мультикопийны и теряются с высокой частотой. Высокая частота их потери обусловлена малыми размерами; увеличение размеров линейных минихромосом сопровождается повышением их стабильности, а также снижением копийности до величины, близкой к единице. Искусственная хромосома дрожжей с клонированным фрагментом гетерологичной ДНК, например ДНК человека, "конструируется" in vivo за счет актов гомологичной рекомбинации между повторяющимися элементами ДНК человека (например, последовательностями Alu) и теми же повторами, включенными в состав вектора. Для клонирования таким методом используют векторы, которые образуют в процессе трансформации линейные и кольцевые YAC. Для получения линейных YAC трансформацию сферопластов дрожжей проводят одновременно тремя видами ДНК: клонируемой ДНК и ДНК двух линеаризованных векторных плазмид – плечей YAC. Рекомбинация между Alu последовательностями на фланге каждого из плеч и геномной ДНК приводит к образованию линейного YAC, регулярную сегрегацию которого обеспечивает центромера. Клонирование ДНК с помощью вектора, не содержащего ни одной теломеры, приводит к образованию кольцевого YAC. Искусственные хромосомы дрожжей не только служат инструментом клонирования, но также могут использоваться для манипуляций с клонированными последовательностями. Например, в клонированную последовательность можно встроить селективный маркер посредством рекомбинации между YAC и кольцевой плазмидой дрожжей. Можно также осуществлять рекомбинацию между перекрывающимися различными YAC и получать укрупненные клоны, содержащие в себе более протяженные области клонированной ДНК. Созданы специальные YAC, позволяющие получать терминальные и внутренние делеции в клонированных вставках ДНК. Искусственные хромосомы дрожжей использованы для клонирования не только генов, но также теломерных и центромерных областей геномовмлекопитающих и хромосомных ориджинов репликации.

Векторы для клонирования в растениях. Технология рекомбинантных ДНК позволяет выделять гены как прокариотического, так и эукариотического происхождения, переносить их в хромосомы реципиентных растений и обеспечивать экспрессию генов. Применение технологий генной инженерии делает поиск более целенаправленным изначально, расширяет возможности манипулирования генетическим аппаратом. Важным преимуществом растений по сравнению с животными является возможность получения целого растения из одной клетки, основанная на ее способности к тотипотентности-регенерации целого организма из одной клетки. Технология генетической инженерии состоит из следующих основных этапов получения трансгенных растений: поиск, идентификация, выбор гена и его клонирование; подбор генотипа растения-реципиента; введение гена в геном клеток растения-реципиента; регенерация трансформированных клеток и отбор трансгенных растений; тестирование экспрессии гена в геноме трансгенного растения. Выбор гена определяется необходимостью передачи растению определенного хозяйственно-полезного признака – устойчивость к гербицидам и пестицидам, устойчивость к некоторым другим видам стрессов. Большинство генов, определяющих эти признаки, выделены из бактериальных геномов. В последнее время в качестве доноров генов, определяющих признаки устойчивости, выбирают геномы диких видов. Такие гены не могут быть введены в геном растений-реципиентов путем половой гибридизации из-за биологической несовместимости растений. В качестве реципиента подбираются растения такого сорта или линии, которые отвечали бы требованиям производства по урожайности, качеству плодов, устойчивости к биотическим и абиотическим стрессам, но имели бы лишь одно отрицательное свойство, например неустойчивость к насекомым. Тогда введение в геном растений этого сорта, например, бактериального гена bt2, экспрессирующего белок прототоксин, вызывающий гибель насекомых, приводил бы к значительному улучшению выбранного сорта. Выбор генотипа растения-реципиента определяется способностью его клеток к регенерации в целое фертильное растение, так как показано, что это свойство значительно зависит от генотипа. Проблема переноса чужеродных генов в геном растений существенно облегчается в связи с обнаружением Ti-плазмид почвенных агробактерий.

Введение чужеродных генов в растительную клетку при помощи агробактериальных векторов. Некоторые виды почвенных бактерий могут заражать двудольные растения и вызывать при этом образование специфических опухолей – корончатых галлов. Опухоли состоят из дедифференцированных клеток, интенсивно делящихся и растущих в месте заражения. При культивировании in vitro клетки опухоли могут расти в отсутствие гормонов, необходимых для роста нормальных растительных клеток. Помимо повышенного синтеза фитогормонов, опухолевые клетки корончатых галлов начинают синтезировать необычные для растения соединения – опины, которые используются агробактериями в качестве источника азота и углерода. Агробактерии сами синтезировать опины не могут, так как промежуточные продукты синтеза ингибируют рост бактериальной клетки и используют растительные клетки как «фабрики» по производству опинов. При заражении растения агробактерией происходит перестройка метаболизма трансформированных растительных клеток, и они начинают синтезировать соединения, необходимые только для бактерий. Опины не могут утилизироваться растительной клеткой и выделяются в межклетники, где и поглощаются агробактерией. Ti-плазмиды имеют сходное строение и содержат последовательности, которые можно поделить на две группы: необходимые для метаболизма самой агробактерии (гены катаболизма опинов, точка начала репликации плазмиды и т. д.); необходимые для трансформации растительной клетки. Гены первой группы могут функционировать только в бактериальной клетке, а второй группы – могут экспрессироваться в эукариотической растительной клетке. Ко второй группе относятся гены, ответственные за индукцию опухоли и синтез опиновых аминокислот. Трансформация растения в результате агробактериального заражения происходит в несколько этапов. Сама агробактерия не входит в растительную клетку, она располагается в межклетниках. Не входит в клетку растений и Ti-плазмида, но часть Ti-плазмиды переносится в ядро растительной клетки и может встраиваться в растительный геном. Этот фрагмент Ti-плазмиды был назван Т-ДНК (трансформирующая ДНК). На концах Т-ДНК находятся прямые высоко консервативные повторы (25 н.п.), составляющие – левый и правый пограничные районы, которые необходимы для вырезания ее из состава плазмиды и интеграции в геном растений. Непосредственно границы области Т-ДНК, а также последовательности, примыкающие к этим районам, оказывают влияние на результативность трансформации. При этом, именно последовательность правой границы необходима для интеграции Т-ДНК в геном растения. Деления левой границы не оказывала существенного эффекта на перенос Т-ДНК. Также рядом с правой границей внутри области Т-ДНК располагается специфическая область, влияющая на вирулентность Ti-плазмиды. Деления этой области приводит к тому, что такие Ti-плазмиды не способны индуцировать опухолеобразование.

Структура Т-ДНК. В области Т-ДНК картировано не менее шести генов, отвечающих за морфологию опухоли и синтез фитогормонов. Гены, совместная деятельность которых обусловливает обусловливает появление в растениях несвойственного им пути образования природного ауксина, что в целом приводит к изменению количества ауксина в клетках растения. Гены-онкогены, которые индуцируют деление клеток. Ген превращения ауксина – антиауксиновый эффект. Ген величины опухоли; ген чувствительности растительных тканей к цитокинину и сохранения клеток в недифференцированном состоянии. Четыре-пять генов подавляют дифференцировку опухолевых клеток и переводят их в состояние деления, а еще один ген кодирует фермент, катализирующий синтез опинов.

Молекулярно-генетические механизмы агробактериальной трансформации. Процесс трансформации можно разделить на четыре этапа: прикрепление бактерии к стенке растительной клетки, проникновение Т-ДНК внутрь клетки растения, интеграция Т-ДНК в геном растения и экспрессия Т-ДНК. Индукция начальных этапов трансформации может происходить только в месте раневого повреждения растения, где выделяются низкомолекулярные фенольные соединения, углеводы и где образуется кислый рН. Весь процесс вырезания и интеграции Т-ДНК в растительную хромосому осуществляют продукты генов, локализованных в vir-области. Индукция vir-генов обратима, что очень важно для патогена: в случае, если хозяин – больной и нежизнеспособный организм, перенос Т-ДНК не осуществляется. Перенос Т-ДНК из бактерии в цитоплазму растительной клетки осуществляется за 30 мин. Внедрение Т-ДНК в растительный геном является многоступенчатым процессом. В геном растения могут встраиваться несколько копий Т-ДНК. После встраивания в хромосому Т-ДНК становится обычной частью генома растения. Т-ДНК транскрибируется в растительных клетках РНК-полимеразой II растения-хозяина. Сама бактерия в клетку не проникает, а остается в межклеточном пространстве и использует растительные клетки со встроенной Т-ДНК как фабрику, продуцирующую опины – источник азота и углерода.

Векторы для трансформации растений на основе Ti-плазмид. Tra – гены отвечающие за передачу Ti-плазмиды между клетками. Rep – гены связанные с репликацией. Vir – отдельно; гены вирулентности – их продукты отвечают за образование опухоли, т. е. они стимулируют синтез ИУК (индолилуксусная кислота). Около 10% тела Ti-плазмиды – Т-ДНК – этот фрагмент способен передаваться растительной клетке и случайным образом встраиваться в одну из хромосом. Важным для вырезывания Ti-плазмид является наличие на концах Т-ДНК коротких последовательностей размером 25 пар оснований. За счет активности продуктов vir генов в пределах этих последовательностей происходит вырезание Т-ДНК и перенос ее в растительную клетку. Ti-Плазмида имеет широкий круг хозяев, встраивает Т-ДНК в хромосомы растений, где она может реплицироваться, и ее гены транслируются с образованием белка. После трансформации растений природной Ti-плазмидой трансформированные клетки не будут способны к регенерации, поскольку в них подавлена дифференцировка за счет активности шести генов Т-ДНК области, кодирующих признаки опухолеобразования. Если же последовательности генов, блокирующих дифференцировку, вырезать из Т-ДНК, трансформированные клетки обретут способность к регенерации. Поэтому при использовании Ti-плазмид для получения векторных конструкций последовательности генов, ответственных за опухолеобразование и синтез опинов, вырезают, оставляя только фрагменты Т-ДНК, необходимые для ее переноса в растительный геном (прежде всего последовательности левого и правого пограничного повторов). В область Т-ДНК в дальнейшем и встраиваются чужеродные гены, которые желательно ввести в геном растения. Векторы для трансформации растений на основе Tiплазмид агробактерий должны содержать следующие структурные элементы: последовательности правой и левой границы Т-ДНК, а также последовательности, необходимые для переноса и встраивания области Т-ДНК в геном растительной клетки; последовательность гена селективного маркера, что позволит проводить селективный отбор трансгенных растений. В качестве селективного маркера могут использоваться гены устойчивости к антибиотикам; последовательности, облегчающие встраивание целевого гена (полилинкерные последовательности, промоторные и терминаторные последовательности); сайты инициации для репликации в бактериальных клетках.

Коинтегративный вектор. Весь процесс введения чужеродного гена в геном растений делится на два этапа: клонирование гена, который следует встроить в растительный геном, и собственно трансформация растительной клетки. Эти два этапа осуществляются с помощью различных векторов. В качестве вспомогательного (промежуточного) вектора, в котором проводят клонирование нужного гена, используют векторы на основе плазмиды Е. coli, в которые вставляют фрагмент Т-ДНК с пограничными последовательностями Т-ДНК и ген селективного маркера (обычно ген, кодирующий устойчивость к антибиотику. С помощью конъюгации такой промежуточный вектор переносят в клетки специальных штаммов A. lumefaciens, содержащих другой вектор, несущий гены, необходимые для интеграции области Т-ДНК в геном растения. Этот вектор имеет значительные размеры и представляет собой фрагмент Ti-плазмиды, несущей v/r-область, пограничные последовательности Т-ДНК и фрагменты плазмиды, аналогичные промежуточному вектору.После конъюгации происходит рекомбинация между гомологичными участками двух векторов, в результате фрагмент промежуточного вектора, содержащий нужный ген и селективный маркер, переносятся во второй вектор с v/r-областью и пограничными последовательностями Т-ДНК. Таким образом, в результате рекомбинации между двумя плазмидами получается коинтегративный вектор. Клетки агробактерий, содержащие такой коинтегративный вектор, отбираются на селективных средах и используются в дальнейшем для трансформации растений.

Бинарный вектор. Система бинарных векторов основана на том, что в агробактериальной клетке, используемой для трасформации растений, одновременно находятся две плазмиды. Одна содержит область пограничных повторов Т-ДНК, а другая – vir-область. Обе плазмиды могут независимо реплицироваться в клетках агробактерии, однако, поодиночке не могут приводить к трансформации растений. При этом плазмида, несущая Т-ДНК, содержит в своем составе фрагменты плазмиды Е.соli (в том числе и точку начала репликации), что позволяет проводить все манипуляции по клонированию в клетках Е. coli и намного упрощает весь процесс. Аналогично коинтегративному вектору целевой ген и ген селективного маркера встраиваются в область Т-ДНК, и затем такая рекомбинантная плазмида вводится в клетки агробактерии, которые уже несут другую плазмиду с vir-областью. В отличие от коинтегративных векторов не происходит гомологичной рекомбинации между двумя плазмидами и их объединения в единую векторную молекулу. Белки, экспрессируемые vir-генами одной плазмиды, вырезают и встраивают в растительный геном области Т-ДНК с чужеродными генами другой плазмиды. В настоящее время такие бинарные векторы наиболее часто используются для трансформации растительных клеток.