Иллюстрационное пособие по общей микробиологии

181

Дают постоять 2 суток, после чего фильтруют.

10. Кристаллический фиолетовый (по Хукеру):

Раствор I.

Кристаллический фиолетовый	2 г
Этанол (96%)	20 мл
Раствор 2.
Аммоний щавелевокислый	0,8 г
Вода дистиллированная	80 мл

Растворы смешивают и выдерживают перед использованием 2 суток.

11. Раствор эритрозина:

Эритрозин	3 г
Вода дистиллированная	200 мл
Фенол	5 г

После растворения эритрозина и фенола смеси дают отстояться сутки.

12.Жидкую натуральную тушь разводят водопроводной водой в десять раз (1 мл туши в 9 мл воды), разливают в пробирки по 3-5 мл, автоклавируют при 0,5 ати. После этого суспензии дают отстояться 2 недели и используют для окраски некоторых компонентов клетки, в частности – капсул.

13.Сафранин. 2 г краски растворяют в 100 мл смеси спирта этилового 96%- ного и дистиллированной воды поровну или в 100 мл кипящей дистиллированной воды. Фильтруют.

14.Малахитовый зеленый (водный раствор). 1 г краски растворяют в 100 мл дистиллированной воды. Фильтруют.

15.Конго красный: 3 г краски растворяют в 100 мл дистиллированной воды.

16.Раствор Люголя. 2 г калия йодида растворяют в 25 мл дистиллированной воды. Затем к раствору добавляют 1 г йода кристаллического, доводят до 300 мл дистиллированной водой, фильтруют.

17.Раствор везувина:

Везувин	2 г
Спирт (96%)	60 мл
Дистиллированная вода	40 мл

Смесь кипятят, после охлаждения – фильтруют.

Приложение 5.2. Методы окрашивания микробов

1.Метод Ольта. Используется для выявления капсулы бактерий. Мазок окрашивают 2-3%-ным раствором сафранина. Краситель готовят перед употреблением, растворяя его в горячей воде с последующим фильтрованием. Окрашивают при легком нагревании в течение 1-3 минут и быстро промывают водой. Препарат не высушивают, на нем должна быть вода, накрывают покровным стеклом и рассматривают под иммерсионной системой микроскопа. Световые лучи, проходя через слой воды, усиливают разницу в преломлении лучей от капсулы и тела микробной клетки. В поле зрения микроскопа видно, что тела микробных клеток окрашены в красный цвет, капсулы - в желтый.

2.Метод Михина. Используется также для выявления капсулы бактерий.

182

Фиксированный мазок окрашивают метиленовым голубым Лёффлера в течение 2- 3 минут при подогревании. Краситель быстро смывают водой, мазок высушивают.

При микроскопировании тела микробных клеток выглядят темно-синими, капсулы - светло-розовыми.

3.Окрашивание зерен волютина по методу Нейссера. Для этого фиксированный мазок окрашивают уксуснокислой синькой в течение 1 минуты. Затем краску сливают, препарат промывают водой и обрабатывают раствором Люголя в течение 20-30 секунд. Не промывая водой, мазок окрашивают везувином в течение 10-15 секунд. Затем препарат промывают водой, высушивают и исследуют с иммерсионной системой. Тела бактерий окрашиваются в нежный светлокоричневый цвет, зерна волютина - в темно-синий, почти черный цвет.

4.Окрашивание спор по методу Златогорова. Мазок фиксируют над пламенем горелки. Затем на поверхность мазка помещают полоску фильтровальной бумаги, окрашенной основным феноловым фуксином Циля. Бумагу смачивают 3-5 каплями воды. Препарат подогревают в течение 5-7 минут, обесцвечивают 3%-ным водным раствором серной кислоты в течение 5-10 секунд и промывают водой. Дополнительное окрашивание проводят метиленовым голубым в течение 2-3 минут, после чего мазок промывают водой и высушивают. Споры окрашиваются в красный цвет, а вегетативные клетки - в синий.

5.Окрашивание спор по Пешкову. После фиксации препарата над пламенем горелки мазок окрашивают метиленовым голубым Лёффлера в течение 15-20 секунд, подогревая над пламенем спиртовки. Препарат промывают водой. Дополнительное окрашивание проводят 0,5%-ным водным раствором нейтрального красного в течение 30 секунд. Затем препарат промывают водой и высушивают. При этом методе споры окрашиваются в голубой или синий цвет, а вегетативные формы

–в розовый.

6.Окрашивание жгутиков бактерий по методу Леффлера. Взвесь бактерий вносят в каплю воды (не размазывая ее петлей), нанесенную на предметное стекло, и дают высохнуть. Для обеспечения сохранности жгутиков необходимо чрезвычайно осторожное обращение с мазком во время всех манипуляций. Обрабатывают 15-20 минут при комнатной температуре протравой следующего состава: 1 мл насыщенного спиртового раствора фуксина и смесь из 10 мл 25% водного раствора танина с 5 мл насыщенного водного раствора сернокислого железа (протраву готовят за несколько суток до употребления; перед употреблением ее отфильтровывают). Препарат тщательно промывают водой, высушивают на воздухе. Докрашивают фуксином Циля в течение 3-4 минут при легком подогревании (без образования паров). Затем препарат промывают водой, высушивают над пламенем горелки.

7.Окрашивание микробов по Романовскому-Гимзе. Краска Романовского-

Гимза – это смесь азура, эозина и метиленовой синьки. Раствор этой краски синефиолетового цвета. Она окрашивает клеточную цитоплазму в голубой цвет, а ядра клеток, зернистость, слизь, капсулы бактерий - в красно-фиолетовый цвет. Окрашивание по Романовскому-Гимзе позволяет обнаружить различные структурные компоненты клеток. Непосредственно перед окрашиванием бактерий к 10 мл дистиллированной воды добавляют 10 капель краски Романовского-Гимзы и тотчас же наливают на фиксированный препарат (или погружают препарат в ста-

183

канчик с краской). Через 1 час краску сливают, препарат промывают водой, высушивают на воздухе и микроскопируют.

8.Окрашивание гликогена проводится путем добавления к капле культуры такого же количества раствора Люголя. При соединении с раствором Люголя гликоген приобретает красно-бурую окраску.

9.Окрашивание гранулезы осуществляется следующим образом. К капле микробной культуры добавляют каплю раствора Люголя и накрывают покровным стеклом. Под иммерсионной системой микроскопа видны микробные клетки и окрашенные в синий цвет зерна гранулезы.

10.Окрашивание жира. Жир окрашивают спиртовым раствором Судана III (0,05 г Судана III в 100 мл 96%-ного этилового спирта). С этой целью к капле культуры добавляют краситель и тщательно перемешивают. Препарат высушивают

имикроскопируют. Капли жира окрашиваются в красный цвет, а цитоплазма бактерий остается неокрашенной.

11.Окрашивание зерен волютина. Волютин в микробных клетках встречается в виде гранул, которые состоят из полифосфатов. Гранулы волютина в микробной клетке обнаруживаются при окрашивании препарата по Омелянскому. С этой целью приготовленный мазок фиксируют над пламенем горелки и окрашивают в течение 30 секунд карболовым фуксином Циля. После промывания мазок обесцвечивают 1%-ным раствором серной кислоты в течение 20-30 секунд. Затем мазок вновь промывают водой и дополнительно окрашивают слабым раствором метиленового голубого (1:40) в течение 15-20 секунд. Микроскопическая картина: гранулы волютина красные, цитоплазма синяя.

5.11.Вопросы для контроля усвоения материала

1.Расскажите об устройстве механической части светового микроскопа.

2.Расскажите об устройстве оптической части светового микроскопа.

3.Расскажите об устройстве осветительной части светового микроскопа.

4.Расскажите о принципиальном устройстве электронного микроскопа.

5.Что представляет собой микроскопия в светлом поле зрения?

6.Что такое иммерсионная микроскопия?

7.Расскажите об использовании фазово-контрастной микроскопии.

8.Что такое темнопольная микроскопия?

9.Что такое люминесцентная микроскопия и в чем ее преимущества?

10.Расскажите о правилах приготовления препаратов для микроскопии микробов в живом состоянии.

11.Расскажите о правилах приготовления препаратов для микроскопии микробов в окрашенном состоянии.

12.Что представляют собой простые методы окрашивания микробов?

13.Что такое сложные методы окрашивания микробов, какие сложные методы окрашивания микробов Вы знаете?

14.Сущность окраски по Граму.

15.Какие методы окрашивания применяют для выявления капсул, спор и жгутиков бактерий?

184

5.12.Тренировочные тесты

1.К механической части микроскопа относится (один правильный ответ):

1.1.объектив

1.2.окуляр

1.3.штатив

1.4.зеркало

1.5.конденсор

2.К оптической части микроскопа относятся (несколько правильных ответов):

2.1.объективы

2.2.тубус

2.3.окуляр

2.4.микровинт

2.5.осветитель

3.К осветительной части светового микроскопа относятся (несколько правильных ответов):

3.1.макровинт

3.2.конденсор

3.3.зеркало

3.4.предметный столик

3.5.револьвер

4.К простым методам окрашивания микробов относится окрашивание (несколько правильных ответов):

4.1.по Граму

4.2.по Цилю-Нельсену

4.3.метиленовым синим

4.4.по Пешкову

4.5.фуксином

5.К сложным методам окрашивания микробов относятся окрашивание (несколько правильных ответов):

5.1.по Граму

5.2.по Цилю-Нельсену

5.3.фуксином

5.4.метиленовым синим

5.5.по Ожешко

6.Назовите сложные методы окраски (несколько правильных ответов):

6.1.генцианвиолетом

6.2.Циля-Нельсена

6.3.Бурри-Гинса

6.4.метиленовым синим

6.5.фуксином

185

7.Окрашивание грамотрицательных бактерий в красный цвет объясняется (один правильный ответ):

7.1.образованием в клетке нерастворимого в спирте комплекса веществ

7.2.химической реакцией между йодом и фуксином

7.3.химической реакцией между раствором Люголя и генцианвиолетом

7.4.химической реакцией между фуксином и генцианвиолетом

7.5.обесцвечиванием клеточной стенки спиртом

8.Окрашивание грамположительных бактерий в фиолетовый цвет объясняется (несколько правильных ответов):

8.1.высоким содержанием в клеточной стенке липидов

8.2.высоким содержанием в клеточной стенке пептидогликана

8.3.наличием в клеточной стенке тейхоевых кислот

8.4.высокой концентрацией в клетке углеводов

8.5.наличием капсулы

9.Жгутики выявляют при окраске мазка (один правильный ответ):

9.1.по Граму

9.2.по Бурри-Гинсу

9.3.по Ожешко

9.4.серебрением по Морозову

9.5.по Цилю-Нельсену

10. Капсула у бактерий выявляется с помощью (несколько правильных ответов):

10.1.окраски по методу Бурри-Гинса

10.2.электронной микроскопии

10.3.окраски по методу Грама

10.4.окраски по методу Циля-Нельсена

10.5.окраски по методу Лёффлера

11. Кислотоустойчивые бактерии окрашивают с помощью (один правильный ответ):

11.1.метода Грама

11.2.метода Циля-Нельсена

11.3.метода Лёффлера

11.4.метода Бурри-Гинса

11.5.раствора Люголя

Правильные ответы: 1.3, 2.1, 2.3, 3.2, 3.3, 4.3, 4.5, 5.1, 5.2, 5.5, 6.2, 6.3, 7.5, 8.2, 8.3, 9.4, 10.1, 10.2, 11.2.

186

6. Строение и репродукция вирусов

6.1. Форма и размеры вирусов

Вирусы - это мельчайшие формы жизни, не имеющие клеточного строения. Вирусы образуют отдельное царство (Vira). От других микробов вирусы отличаются характерными для них уникальными свойствами.

1. Ультрамикроскопические размеры вирусов. Вирусы измеряются в нанометрах (1 мм = 1000 мкм, 1 мкм = 1000 нм). По размерам вирусы подразделяются на мелкие (например, вирус полиомиелита) - размер вирусных частиц 10-25 нм, средние (например, вирусы гриппа) - размер вирионов составляет 100-120 нм, крупные (например, вирус натуральной оспы) - размер вирусных частиц около 350 нм (рисунок 6.1).

Рисунок 6.1 – Сравнительная характеристика размеров клеток и вирусных частиц.

2.Наличие только одного типа нуклеиновой кислоты - ДНК или РНК. По этому признаку все вирусы разделены на два класса - ДНК-содержащие вирусы и РНК-содержащие вирусы.

3.Облигатный внутриклеточный паразитизм. Вирусы способны реплицироваться (размножаться) только внутри живых клеток, так как у них отсутствуют собственные системы, синтезирующие белок и генерирующие энергию.

4.Простое строение вириона (вирусной частицы). Вирион состоит из генома (ДНК или РНК), покрытого одной (капсидом) или двумя (капсидом и суперкапсидом) оболочками. У вирусов отсутствуют такие клеточные элементы как цитоплазма, клеточные мембраны, рибосомы и др.

5.Дизъюнктивной (разобщенной) способ репродукции внутри клетки. При репродукции вирусов в разных частях инфицированной клетки синтезируются

187

нуклеиновые кислоты и белки, которые затем объединяются в дочерние вирусные частицы. Синтез компонентов вирусных частиц происходит либо в цитоплазме, либо в цитоплазме и ядре клетки.

Морфологию и структуру вирусов изучают в основном с помощью электронной микроскопии. Препараты для электронной микроскопии готовят специальными методами:

-методом напыления (на подложку из чистого углерода или коллодия наносят вируссодержащий материал, лиофильно высушивают и напыляют тяжелые металлы - в частности, палладий);

-методом реплик (вируссодержащий материал заливают тонким слоем пластмассы и микроскопируют);

-методом негативного контрастирования (вируссодержащий материал помещают на подложку, добавляют раствор уранилацетата, который попадает во все углубления вириона и создает для электронов непроницаемый фон).

Размеры вирионов определяют с помощью ультрафильтрации через фильтры

сизвестным диаметром пор в нм или методом ультрацентрифугирования. Крупные вирионы можно увидеть в световом микроскопе в виде мелких внутриклеточных образований - включений (например, тельца Пашена при оспе, тельца БабешаНегри при бешенстве).

Вирусная частица называется вирионом. Выделяют следующие формы

вирионов:

-палочковидная форма (рисунок 6.2) характерна для вируса табачной мозаики;

-пулевидная форма (рисунок 6.3) присуща вирусу бешенства;

-сферическая форма (рисунок 6.4) отмечается у многих вирусов, в частности, у герпесвирусов, вируса иммунодефицита человека;

-нитевидная форма (рисунок 6.5) наблюдается у филовирусов;

-овальная форма (рисунок 6.6) характерна для вируса натуральной оспы;

-сперматозоидная форма (рисунок 6.7) отмечается у большинства вирусов бактерий (бактериофагов).

а б Рисунок 6.2 - Палочковидная форма вирионов. Компьютерная визуализация (а) и

электронная микроскопия (б). Заимствовано из Интернет-ресурсов.

188

а б Рисунок 6.3 - Пулевидная форма вирионов. Компьютерная визуализация (а) и

электронная микроскопия (б). Заимствовано из Интернет-ресурсов.

Рисунок 6.4 - Сферическая форма вирионов. Электронная микроскопия. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

а б Рисунок 6.5 - Нитевидная форма вирионов. Компьютерная визуализация (а) и

электронная микроскопия (б). Заимствовано из Интернет-ресурсов.

а б Рисунок 6.6 - Овальная форма вирионов. Компьютерная визуализация (а) и

электронная микроскопия (б). Заимствовано из Интернет-ресурсов.

189

Рисунок 6.7 - Сперматозоидная форма вирионов. Электронная микроскопия бактериофагов. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

6.2. Структура вирусов

По своей структуре вирусы представляют собой геометрически правильные образования, состоящие из центральной части (генома) и одной или двух оболочек.

Взависимости от количества оболочек вирусы подразделяются на 2 типа:

-простые вирусы (просто устроенные, безоболочечные, “голые”), состоящие из нуклеиновой кислоты и одной белковой оболочки - капсида;

-сложные вирусы (сложно устроенные, оболочечные, “одетые”), содержащие кроме нуклеиновой кислоты и капсида внешнюю липопротеиновую оболочку (суперкапсид).

Сравнительное схематическое изображение простого и сложного вирусов представлено на рисунках 6.8 и 6.9.

Нуклеиновая кислота

Капсид

Рисунок 6.8 - Схематическое изображение простого (безоболочечного) вируса. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

190

Суперкапсид

Нуклеиновая
кислота	Капсид

Рисунок 6.9 - Схематическое изображение сложного (оболочечного) вируса. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

В центре вириона располагается нуклеиновая кислота (вирусный геном).

Снаружи нуклеиновая кислота покрыта белковой оболочкой - капсидом (лат. capsa

– футляр, коробка). Капсид как чехлом окружает вирусную нуклеиновую кислоту. Вирусный геном и капсид вместе образуют нуклеокапсид. Капсид состоит из повторяющихся морфологических субъединиц - капсомеров. Простые вирусы могут быть как РНК-содержащими, так и ДНК-содержащими (рисунок 6.10).

а б Рисунок 6.10 - Просто устроенные (безоболочечные) РНК-содержащий (а) и ДНК-

содержащий (б) вирусы. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

Каждый капсомер построен из одной или нескольких полипептидных цепей, соединенных друг с другом дисульфидной связью. Каждый капсомер может быть мономерным (содержать один полипептид) либо полимерным (включать несколько полипептидов). Например, у вируса табачной мозаики 2130 одинаковых капсомеров.

У сложных вирусов наряду с капсидом имеется дополнительная оболочка - суперкапсид (пеплос, покрывало). Суперкапсид состоит из двойного слоя липидов и специфических вирусных белков. Суперкапсидная оболочка вируса является модифицированной цитоплазматической мембраной клетки, в которой репродуцировался данный вирус. Модификация происходит путем встраивания вирусных белков в участки цитоплазматической мембраны инфицированной клетки. Сложные вирусы также могут быть как РНК-содержащими, так и ДНКсодержащими (рисунок 6.11).