Virusologiya

УЧРЕЖДЕНИЕ ОБРАЗОВАНИЯ ПОЛЕССКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

М.М.ВОРОБЬЁВА

ВИРУСОЛОГИЯ

специальность 1–31 01 01 – Биология (по направлениям)

Пояснительная записка ТЕОРЕТИЧЕСКИЙ РАЗДЕЛ ПРАКТИЧЕСКИЙ РАЗДЕЛ РАЗДЕЛ КОНТРОЛЯ ЗНАНИЙ ВСПОМОГАТЕЛЬНЫЙ РАЗДЕЛ

Пинск

ПолесГУ

2020

Вирусология

по курсу «Вирусология» представляет собой целостную совокупность разновидностей учебных материалов, необходимых для проведения лекционных и лабораторных занятий по данной дисциплине, являющейся базовой дисциплиной специального цикла образовательной программы при подготовке специалистов в области биологической науки, предназначенной для студентов специальности: 1-31 01 01 Биология (по направлениям).

Цель ЭУМК: систематизация материала, необходимого для реализации требований образовательных программ и образовательных стандартов высшего образования.

ЭУМК включает материалы, позволяющие организовать самостоятельную работы студентов. В нем обозначены основные вопросы по изучаемому курсу, указана литература, необходимая для углубления и расширения объема знаний, полученных на лекционных занятиях, представлены вопросы, которые могут быть использованы для выявления степени усвоения изучаемого материала.

В структуре ЭУМК представлены следующие основные разделы:

-теоретический;

-практический;

-контроля знаний;

-вспомогательный.

Первый раздел содержит материалы, предназначенные для теоретического изучения дисциплины «Вирусология», в объеме, установленном в соответствии с образовательным стандартом и типовым учебным планом подготовки студентов по специальности: 1-31 01 01 Биология (по направлениям).

Второй раздел комплекса содержит материалы, необходимые для проведения лабораторных занятий.

Третий раздел (контроля знаний) содержит тесты, вопросы к коллоквиуму и экзамену по данной дисциплине.

В четвертом разделе комплекса представлена учебная программа, составленная на основе типовой учебной программы по дисциплине «Вирусология», 13.08.2015, № ТД-G. 525/тип.

ТЕОРЕТИЧЕСКИЙ РАЗДЕЛ

Тема 1. ВВЕДЕНИЕ

План:

1.Вирусология как наука. Связь вирусологии с другими науками.

2.Основные этапы развития вирусологии.

3.Природа вирусов.

4.Основные методы исследования, применяемые в вирусологии.

1.Вирусология как наука. Связь вирусологии с другими науками

Вирусология – биологическая наука, которая изучает вирусы (ультрамикроорганизмы исключительно малых размеров, которые не имеют клеточного строения, имеют в своем составе только один тип нуклеиновой кислоты (РНК или ДНК) и не могут репродуцироваться вне живой клетки), их природу, морфологию, химический состав, взаимодействие с клеткой макроорганизма, диагностику вирусных болезней и их лечение.

Вирусология как наука делится на общую и частную. Общая вирусология изучает природу, происхождение, строение, химический состав, генетику вирусов, взаимодействие их с клеткой хозяина, противовирусный иммунитет и методы диагностики вирусных болезней. Частная − свойства возбудителей вирусных болезней животных, вопросы патогенеза, лабораторной диагностики, специфической профилактики и терапии вирусных заболеваний.

Вирусология тесно связана связана с другими биологическими науками – микробиологией, биохимией, генетикой, химией, гистологией, фармакологией и др.

Вирусология является базой для развития эпизоотологии и некоторых других наук. Вирусы являются уникальными объектами для изучения нуклеиновых кислот и других вопросов генетики.

2. Основные этапы развития вирусологии

История вирусологии довольна необычна. Первые упоминания о самой грозной инфекции прошлого – натуральной оспе – найдены в древнегреческих папирусах за 12 веков до н.э. На коже мумии фараона Рамзеса V (1085 г. до н.э.) обнаружены типичные оспенные поражения. Другую вирусную болезнь описал основоположник научной медицины древнегреческий врач Гиппократ (160−370 гг. до н.э.). Эта болезнь приводила к укорочению и деформации ног и пожизненной хромоте. В 1874 году она получила современное название – полиомие-

Вирусология

лит. Почти за 100 лет до открытия вирусов английский врач Э.Дженнер (1794 г.) впервые использовал вакцину для предупреждения вирусной инфекции – оспы.

Дженнер обратил внимание на тот факт, что молочницы, ухаживающие за больными животными, иногда заболевали в крайне слабой форме оспой коров, но при этом никогда не болели натуральной оспой. В 1796 г. через 30 лет после начала своих изысканий Э. Дженнер решился на испытание метода вакцинации коровьей оспой на человеке. Эксперимент прошел успешно, и с тех пор способ вакцинации по Э. Дженнеру нашел широкое применение во всем мире.

Несмотря на большой практический вклад Э. Дженнера в борьбу с оспой, его исследования носили частный характер и касались лишь одного конкретного заболевания.

В1879 г. Луи Пастер наблюдал патогенность возбудителя куриной холеры. Одна из пробирок с возбудителем была забыта в термостате перед уходом на летний отдых. По возвращении из отпуска ученый возобновил опыты с куриной холерой. Ни одна из птиц, зараженных состарившейся культурой, не заболела. Более того, введение таким птицам свежеприготовленного возбудителя также не вызывало инфекционного процесса. Из этого простого наблюдения Пастер делает вывод: состарившаяся культура, потеряв свою патогенность, остается способной создавать устойчивость к инфекции. Этот случай определил на многие десятилетия принцип получения вакцинного материала – тем или иным способом добиваться снижения вирулентности патогенна при сохранении его иммуногенных свойств.

В1886 году – за семь лет до открытия вирусов Луи Пастер испробовал вакцину на человеке против бешенства (вторая вакцина – антирабическая).

Открытие вирусов по праву принадлежит нашему соотечественнику Дмитрию Иосифовичу Ивановскому. 12 февраля 1892 никому неизвестный 28 летний выпускник кафедры физиологии растений Петербурского университета доложил на заседании Ученого Совета Академии наук о своих наблюдениях, в ходе которых им экспериментально было доказано, что болезнь табака – табачная мозаика – вызывается некоторым агентом, легко проходящим по так называемые бактериальные фильтры. Д.И.Ивановский вводил сок пораженного растения, освобожденный от бактерий, здоровому растению и оно заболевало. Культивировать возбудителя на питательных средах оказалось не возможным. Отсюда Д.И.Ивановский пришел к выводу, что возбу-

Вирусология

дитель имеет необычную природу: он фильтруется через бактериальные фильтры и не способен расти на искусственных питательных средах. Новый тип возбудителя автор назвал «фильтрующиеся бактерии». Опыты Д.И.Ивановского через шесть лет в 1898 году повторил голландский ученый Мартинус Бейеринк и пришел к аналогичному заключению. Он выяснил:

во-первых, что инфекционный агент не просто фильтруется, а диффундирует через слой агарового геля;

во-вторых, что заражаются только растущие ткани растения, и инфекционный агент размножается в клетках, но не in vitro;

в-третьих, что инфекционный агент сохраняет активность после замораживания или высушивания, однако инактивируется при кипячении.

Витоге Бейеринк пришел к выводу, что возбудитель табачной мозаики представляет собой «заразную живую жидкость» в отличие от бактериального, или «корпускулярного», инфекционного начала. Иными словами, он считал этот возбудитель молекула, которого диффундирует в агаре, теряет активность даже при таком слабом воздействии, как нагрев до точки кипения воды (тогда еще не знали, что биологические макромолекулы подвержены температурной денатурации); обладает инфекционностью и патогенностью, а главное молекулой, которая размножается в живой клетке.

Таким образом, Бейеринк гениально угадал небактериальную природу возбудителя табачной мозаики, хотя ошибочно принял внеклеточную форму вируса за молекулу (в действительности вирусная частица является надмолекулярным образованием). Заслуга Бейеринка состоит в том, что он фактически предложил концепцию неклеточной формы жизни.

Вэтот же период немецкие микробиологи Фридрих Лефлер и Пауль Фрош (1898 г.) установили, что ящур, инфекционная болезнь крупного рогатого скота, симптомами которой служат эрозия межкопытной щели и спазм дыхательных мышц, передается с фильтратом через свечу Шамберлана. Поскольку возбудитель ящура не выявлялся микроскопированием и не размножался на питательных средах, Лефлер пришел к выводу, что этот возбудитель не бактерия, а токсин. Так как, эффективность воздействия фильтрата лимфы больного животного при многократных пассажах не уменьшалась, Лефлер предположил, что этот гипотетический токсин либо имеет необыкновенно высокую активность (даже при разведении 1:1010), либо раз-

Вирусология

множается в теле жертвы.

Концепция Бейеринка о неклеточной жизни обрела мощную поддержку в результате открытия феномена бактериофагии в начале XX в. В 1915 г. английский врач-патолог Фредерик Туорт описал «стекловидную трансформацию» колоний бактерии Micrococcus sp., вызванную трансмиссивным литическим агентом. Пытаясь объяснить этот феномен, Туорт предположил, что его вызывает вирус (в том смысле, который вкладывал в данный термин Бейеринк).

Вскоре после этого (1917) канадский микробиолог Феликс д’Эррель описал феномен спонтанного лизиса жидкой культуры дизентерийной палочки, Shigella dysenteriae.В отличие от Ф.Туорта, который сомневался в вирусной природе литического агента и упорно пытался размножить его на синтетических средах, он был убежден, что имеет дело с молекулой, способной не только разрушать бактерий, но и предварительно использовать их для собственного размножения.

Для обозначения агента, вызывающего лизис бактерий, д’Эррель предложил ныне общепризнанный термин бактериофаг (англ. bacteriophage, от греч. bacteria палка; в данном случае бактерия, и phagos прожорливый; здесь поедающий бактерий). Широко используется и редуцированный вариант этого термина фаг (англ. phage).

Таким образом, уже вначале века были открыты три основные группы вирусов. Поражающие растения, животных и бактерий.

Само слово вирус означает «яд», и этот термин впервые был использован Л.Пастером для обозначения заразного материала.

Периоды развития вирусологии.

Развитие вирусологии как науки прошло со времени обнаружения вирусов несколько периодов. Первый период (рождение вирусологии) был связан с открытием вирусов и доказательством того, что его особый многообразный мир самых примитивных существ. В этот период были разработаны методы выделения, накопления и идентификации вирусов с использованием в качестве основной экспериментальной модели лабораторных животных.

Второй период (становление вирусологии) характеризуется открытием основных групп вирусов. Именно в этот период советскими вирусологами З.А. Зильбером. А.А.Смородинцевым, М.П.Чумаковым, В.Д. Соловьевым были изучены продольно очаговые заболевания – эпидемические энцефалиты, и выделен их возбудитель – вирус кле-

Вирусология

щевого энцефалита, а также изучены вирусные геморрагические лихорадки. В начале 30-х годов века австралийский вирусолог и иммунолог Ф.М.Бернет предложил в качестве экспериментальной модели использовать куриные эмбрионы для размножения вирусов гриппа и др. В 40-х годах американский вирусолог Херст открыл феномен гемагглютинации, что позволило подойти к изучению взаимодействия вируса и клетки. Именно эта реакция легла в основу первых методов очистки и концентрации вируса гриппа.

Третий период (клеточный) начинается с 1949 г. после открытия Д.Эндерсом, Т.Уоллером и Ф.Роббинсом возможности культивировать клетки in vitro и поддерживать в них репродукцию вируса полиомиелита. Это открытие возвестило о приходе эры современной вирусологии и послужило толчком к выделению многих неизвестных ранее вирусов, вызывающих серьезные заболевания у человека: энтеровирусов, респираторных заболеваний. Использование культур клеток и тканей в вирусологии позволило не только успешно начать изучение фундаментальных закономерностей строения и биосинтеза вирусов, но и определило качественный скачок в ряде прикладных аспектов вирусологии, в частности в получении культуральных вакцин. Так, в содружестве с американскими учеными Дж.Солком, А.Сейбином, Дж.Эндерсоном, советскими вирусологами А.А.Смородинцевым и М.И.Чумаковым были разработаны, апробированы и внедрены в практику убитая и живая вакцины против полиомиелита и живая коревая вакцина. Были созданы также и культуральные вакцины против энцефалитов, ящура, бешенства.

Четвертый период в развитии вирусологии может быть назван молекулярно-биологическим. Он начался с 60-х годов века и продолжается до настоящего времени. Изучение вирусов стало проводиться на уровне, соответствующем их строению. Вирусы представляют собой целостную, сохраняющуюся единицу, отличную от подобных ей структур клетки, что позволяет изучать судьбу вирусного генетического материала в клетке. Это сделало вирусы основной моделью для исследования фундаментальных проблем биологии. Здесь можно говорить о позитивных свойствах вирусов, ибо благодаря их сравнительной простоте и автономности они стали играть роль тончайших инструментов для исследования таких общебиологических проблем, как структура гена, генетический код, передача генетической информации, закономерности синтеза белков и нуклеиновых кислот и др.

Вирусология

В1972 году Т.О.Дайнера, открыл вироиды, представляющие собой «голые» (лишенные белка) суперспирализованные кольцевые молекулы РНК, вызывающие заболевания у растений.

В1982 году группа американских ученых из Калифарнийского университета (США), работающих под руководством Прузинера открыла, и им удалось выяснить белковую природу прионов. Изучение очищенного инфекционного материала показало, что его основной компонент – белок с молекулярной массой 27-30 кДа (кило Дальтона), обозначаемый как Pr 27-30.

3. Природа вирусов

Природа вирусов, несмотря на большие успехи вирусологии, остается вопросом, далеким от полного разрешения. Относительно природы вирусов имеется два диаметрально противоположных суждения.

Вирусы – не живые организмы утверждают сторонники лауреата Нобелевской премии А.Львова (Львов Андре Мишель род. 1902, французский генетик и вирусолог, иностранный член АМН СССР

(1967). Внес существенный вклад в развитие учения от латентных вирусных инфекциях, объяснил явление лизогении. Исследования Львова легли в основу регуляции синтеза белка Ф.Жакоба и Ж.Л.Моно. Нобелевская премия – 1965 год совместно с Жакобом и Моно), так как не являются, как все существа, «независимыми единицами взаимосвязанных структур и функций». С учетом этого наиболее важного, по их мнению, критерия жизни вирусы нельзя считать живыми. Доказывая, что вирусы нельзя отнести к живым существам они приводят следующие аргументы:

1)у вирусов нет никакого обмена веществ (динамичности): они не способны ни синтезировать, ни разлагать сложные соединения, у них нет собственной энергетики;

2)одна из важнейших характеристик динамизма живого – приспособляемость, и свойственна она только живому. Она обеспечивается ответными реакциями организма на любые воздействия внешней среды;

3)следующим признаком, живого является инвариантность воспроизводства, то есть передача от поколения к поколению наследственной информации, соответствующей первичной структуре организма.

Вирусология

Львов дает следующее определение вирусам: вирусы – строго внутриклеточные, потенциально патогенные агенты, обладающие инфекционной фазой, содержащие лишь один тип нуклеиновой кислоты, репродуцирующийся лишь в форме генетического материала, неспособные к росту и делению.

Вирусы – живые – говорят сторонники лауреата Нобелевской премии С.Лурия (Лурия Сальвадор Эдуард (1912-91), американский вирусолог и генетик. Одни из основоположников генетики микроорганизмов. Исследовал структуру и механизм воспроизведения бактериофагов, открыл эффект их множественной реактивации. Нобелевская премия совместно с А.Д.Херши и М.Дельбрюком в 1969 году). Доказывая, что вирусы можно отнести к живым существам они приводят следующие аргументы:

1)эволюционирование вирусов во времени (прогрессивного или регрессивного характера) – несомненный атрибут полноценной жизни;

2)каждое семейство вирусов, каждый род, каждый вид борются за свое существование. Например, вирусы – возбудители гриппа. Этот вид вируса легко ускользает и от естественной защиты ранее переболевших людей, и от попыток, его уничтожить с помощью вакцин и сывороток. «Делает» он это с помощью классического биологического приема – изменчивости своих основных свойств, в результате чего появляются новые разновидности вируса, к которому становятся восприимчивыми даже переболевшие особи;

3)свою генетическую индивидуальность вирусы пронесли через тысячелетия точно так же, как это сделал, например, человек. Хотя, за пять тысяч лет сменилось всего 200 поколений людей (если считать по четыре поколения в один век), а вирусов полиомиелита или оспы – примерно в 100 тысяч раз больше (учитывая, что срок жизни одной генерации вирусов исчисляется несколькими часами). Тем не менее, достоверно известно, что египетские фараоны болели тем же самым полиомиелитом, что и президент США Франклин Л.Рузвельт, а оспины на лицах спартанских воинов ничем не отличались от такого же рода «украшений» у некоторых современников наших прадедов.

Как видно вирусы, с одной стороны, стойко пронесли свою индивидуальность, а с другой – постоянно её меняли. В самом главном вирусные семейства, известные с древнейших времен, остались такими же, но вместе с тем в мире вирусов произошли и происходят постоянные изменения.Таким образом, вирусам присуща не только наследственность, но и изменчивость. Сегодня мы знаем, что в основе по-

Вирусология

следней лежат те же механизмы, что и других живых существ: мутации, рекомбинации и отбор в популяции, то есть все то, что характеризует любую генетическую регуляцию в любой системе.

Исходя из вышеизложенной аргументации, С.Лурия и его сторонники утверждают, что: вирусы не менее живые, чем все существа, не просто организмы, а «сверхорганизмы», так как только их «голая» нуклеиновая кислота активно проникает в клетки (инфицирует их), реплицируется (размножается) в них и продуцирует вирионы.

4. Основные методы исследования, применяемые в вирусологии

Методы исследования, применяемые в вирусологии аналогичны методам микробиологии:

1.Вирусоскопический. Этот метод исследования основан на использовании различных видов микроскопов: световой, люминесцентный (МИФ – метод иммунофлуоресценции, метод флуорохромирования), электронный (изучение морфологии вирусов). Световая вирусоскопия позволяет выявлять крупные вирусы (вирусы оспы, эктимы овец), обнаруживать внутриклеточные включения, а также регистрировать цитопатическое действие вирусов на чувствительных тестобъектах. Метод флуорохромирования люминесцентной вирусоскопии основан на свечении (люминесценции) вирусов после обработки их веществами – флуорохромами. Этот метод позволяет решать все те же задачи, что и световая вирусоскопия, однако за счет различного свечения двух типов нуклеиновых кислот вирусов дает возможность дифференцировать вирусы по содержанию нуклеиновой кислоты. Метод иммунофлуоресценции люминесцентной вирусоскопии основан на специфическом взаимодействии вирусного антигена с антителами, меченными флуорохромами. Этот метод позволяет идентифицировать вирусы. Электронная вирусоскопия позволяет визуально наблюдать вирусные частицы за счет формирования изображения в электронном микроскопе потоком электронов. При этом становится возможным изучать морфологию вирионов, что позволяет дифференцировать вирусы по семействам (прямая электронная вирусоскопия), либо наблюдать взаимодействие вирусов и антител, что позволяет проводить дифференциацию вирусов по видам (непрямая иммунная вирусоскопия).

2.Выделение и культивирование вирусов. Этот метод исследования основан на способности вирусов репродуцироваться (культивироваться) в живых клетках. В вирусологической практике нашли широ-