КР 4

Вариант 1.

Гаплоидная клетка дрожжей S. cerevisiae содержит 16 линейных хромосом, каждая из которых представлена индивидуальной молекулой ДНК, упакованной в нуклеосомы. Размер хромосом у дрожжей-сахаромицетов находится в интервале от 250 до 2200 тпн. Суммарное содержание ДНК в гаплоидном ядре дрожжей (около 12 млн пн). Размер генома объясняется низким содержанием повторяющихся последовательностей. Основным классом многократно повторяющихся последовательностей ДНК у S. Cerevisiae является кластер генов рибосомной РНК, локализованный на хромосоме XII. На гаплоидную клетку приходится 100–140 копий тандемно повторяющихся единиц генов рРНК. В состав каждой такой единицы длиной 9 тпн входят четыре гена, кодирующих 25S, 18S, 5,8S и 5S рРНК. В повторяющейся единице генов рРНК присутствует область начала репликации ДНК. Клетки дрожжей могут сохранять жизнеспособность при наличии в их генотипе множественных генетических маркеров, у дрожжей сахаромицетов стабильны как гаплоидное, так и диплоидное состояния. Почти во всех штаммах присутствуют вирусы, содержащие днРНК, на долю которых приходится приблизительно 0,1% тотальной массы нуклеиновых кислот. Митохондриальная ДНК кодирует компоненты аппарата митохондриальной трансляции и приблизительно 15% митохондриальных белков. Мутанты g0 полностью лишены митохондриальной ДНК и дефектны по дыхательным полипептидам. Кольцевая 2 мкм плазмида, которая обнаруживается у большинства штаммов дрожжей и функционирует, по-видимому, лишь для обеспечения собственной репликации. Данная плазмида содержит два инвертированных повтора IR1 и IR2, которые разделены уникальными протяженными сегментами ДНК: большим – L (large) и малым – S (small).

Плазмида SCP2 штамма S. Coelicolor A3 – половая низкокопийная плазмида размером 30 тпн. Спонтанно был выделен вариант данной плазмиды SCP2*, обеспечивающий значительно большую эффективность хромосомной рекомбинации и более интенсивное проявление клетками фенотипа Ltz+. SCP2 и SCP2* имеют одинаковую копийность в клетках (1–5 копий на бактериальную хромосому). На основе SCP2* получен ряд векторных плазмид, содержащих разные гены устойчивости к антибиотикам, в том числе к тиострептону – tsr, неомицдну – aph, а также ген mel, направляющий синтез тирозиназы – фермента, превращающего тирозин в меланиновый пигмент. Последняя детерминанта обусловливает черную окраску колоний Streptomyces на среде, содержащей триптон и ионы меди. При инактивации гена mel за счет встройки чужеродных последовательностей колонии трансформантов оказываются бесцветными, что обеспечивает возможность прямого фенотипического отбора клонов, несущих гибридные плазмиды. Векторные производные SCP2* способны трансформировать большое число разных штаммов Streptomyces. На основе плазмиды pIJl01 –конъюгативной половой плазмиды небольшого размера (8,9 тпн), имеющей широкий круг хозяев среди представителей рода Streptomyces и детерминирующей фенотип Ltz+. У S. Lividans число копий этой плазмиды варьирует в зависимости от штамма от 40 до 300 на бактериальную хромосому. На основе pIJlOl и ее делеционных производных in vitro сконструированы векторы, маркированные рядом детерминант лекарственной устойчивости. рIJ350 обеспечивает устойчивость к тиострептону – антибиотику, к которому чувствительно большинство стрептомицетов. Она высококопийна, имеет широкий круг хозяев среди стрептомицетов и неконъюгативна. Для клонирования фрагментов ДНК может использоваться лишь сайт Pstl. Более удобный вектор (pIJ702) в результате встройки в рIJ350 фрагмента ДНК, содержащего ген mel S. antibioticus. Данная плазмида содержит уже два маркера, причем ген mel легко выявляется фенотипически. Для молекулярного клонирования в стрептомицетах также были разработаны векторы на основе умеренного актинофага фС31, имеющих размер 41 тпн и представляет собой двухцепочечную линейную молекулу ДНК с липкими концами (cos). Фаг может лизогенизировать клетки стрептомицетов, интегрируя свой геном по участку att в бактериальную хромосому. В ДНК фС31 1 имеется непрерывная область размером 8 тпн, несущественная для литического развития фага. Построены рестрикционные карты ДНК фС31 и получены различные векторные производные.