immunologia_N3-4_2010_block_210x297

НАУКОВО ПРАКТИЧНИЙ ЖУРНАЛ

В и х о д и т ь 4 р а з и н а р і к

РЕДАКЦІЙНА КОЛЕГІЯ

Медичні науки:

Бережна Н.М.

Бутенко Г.М. (науковий консультант) Білоглазов В.О.

Возіанова Ж.І.

Драннік Г.М. (головний редактор) Дріянська В.Є.

Курченко А.І. (заступник головного редактора) Лісяний М.І.

Малижев В.О. Мельніков О.Ф. Пухлик Б.М. Чернишова Л.І. Чернушенко К.Ф. Широбоков В.П.

Біологічні науки:

Бичкова Н.Г. Мінченко Ж.Д. Нікуліна Г.Г. Руденко А.В. Співак М.Я.

РЕДАКЦІЙНА РАДА

Бажора Ю.І. (Одеса), Господарський І.Я. (Тернопіль), Гріневич Ю.А. (Київ), Дзяк Г.В. (Дніпропетровськ), Дитятківська Є.М. (Дніпропетровськ), Заболотний Д.І. (Київ), Зайков С.В. (Вінниця), Кайдашев І.П. (Полтава), Лоскутова І.В. (Луганськ), Мазепа М.А. (Івано-Франківськ), Нікольський І.С. (Київ), Охотнікова О.М. (Київ), Прилуцький О.С. (Донецьк), Сидорчук І.Й. (Чернівці), Недельська С.М. (Запоріжжя), Фещенко Ю.І. (Київ), Фролов В.М. (Луганськ), Чернишов В.П. (Київ), Чоп»як В.В. (Львів), Чумак А.А. (Київ)

ЗАСНОВНИКИ

ДУ «Інститут Урології АМН України» Українське товариство фахівців з імунології, алергології та імунореабілітації

Свідотство про державну реєстрацію КВ № 15721-4193Р від 08.10.2009 р.

Атестовано Вищою атестаційною комісією України постанови Президії ВАК № 1-05/5 від 01.07.2010 р.

АДРЕСА РЕДАКЦІЇ

04053, м. Київ, вул. Ю. Коцюбинського, 9А Інститут Урології АМН України

Рекомендовано до друку Вченою Радою ДУ «Інститут Урології АМН України», протокол № 9 від 23.11.2010

Зверстано і надруковано в ТОВ«Поліграф плюс». 01004, м. Київ, вул. Горького, 95Б. тел. (044) 502L39L78; [phone]; факс (044) 427L03L75.

ELmail: [e-mail]

ІМУНОЛОГІЯ ТА АЛЕРГОЛОГІЯ: НАУКА І ПРАКТИКА. 3-4’2010

— ЗМІСТ —

ВЛИЯНИЕ ЕЖЕДНЕВНОГО ПРИЕМА ПРОБИОТИЧЕСКОГО ПРОДУКТА АКТИМЕЛЬ
НА ПОКАЗАТЕЛИ СИСТЕМНОГО ИММУНИТЕТА У СТУДЕНТОВ МЕДИЦИНСКИХ ФАКУЛЬТЕТОВ
Дранник Г.Н., Курченко А.И., Савченко В.С., Тарасова И.И. ..............................................................	4
ИММУНОЛОГИЧЕCКИЕ АСПЕКТЫ БОЛЕЗНЕЙ ПАРОДОНТА И ВНУТРЕННИХ ОРГАНОВ:
ПАТОГЕНЕЗ, ПРОФИЛАКТИКА, ЛЕЧЕНИЕ
Гришанин Г.Г., Перешивайлова И.А., Холодная Е.В., Кожин М.И., Шумова Н.В.,
Шушляпин О.И., Кононенко Л.Г., Тучинская М.А., Сапричёва Л.В. ..................................................	15
ЗВ’ЯЗОК ПРОДУКЦІЇ ХЕМОКІНОВОГО РЕЦЕПТОРУ CCR4 ЦИТОТОКСИЧНИМИ Т-ЛІМФОЦИТАМИ
ТА Т-ЛІМФОЦИТАМИ-ХЕЛПЕРАМИ З РІВНЯМИ РЕГУЛЯТОРНИХ Т-ЛІМФОЦИТІВ У ДІТЕЙ ХВОРИХ
НА АТОПІЧНИЙ ДЕРМАТИТ
Чернишов П. В. .............................................................................................................................	24
ОСОБЛИВОСТІ ПОКАЗНИКІВ Т-КЛІТИННОЇ ЛАНКИ ІМУНІТЕТУ У ПАЦІЄНТІВ
З ТЕРМІНАЛЬНОЮ СТАДІЄЮ ХРОНІЧНОЇ НИРКОВОЇ НЕДОСТАТНОСТІ,
ЯКІ ЛІКУЮТЬСЯ ПРОГРАМНИМ ГЕМОДІАЛІЗОМ
Зограб’ян Р. О. ..............................................................................................................................	28
К МЕХАНИЗМУ ИММУНОТРОПНОГО ДЕЙСТВИЯ ГИРУДОТЕРАПИИ
Фролов А. К., Прилуцкий А.С., Копейка В. В., Федотов Е. Р., Литвиненко Р. А. ................................	32
ВПЛИВ ПОЛІОКСИДОНІЮ НА ДИНАМІКУ ПОКАЗНИКІВ МІКРОГЕМОЦИРКУЛЯЦІЇ
ТА ПЕРЕКИСНОГО ОКИСЛЕННЯ ЛІПІДІВ У ХВОРИХ НА БРОНХІАЛЬНУ АСТМУ
З СИНДРОМОМ ХРОНІЧНОЇ ВТОМИ НА ТЛІ ХРОНІЧНОГО БЕЗКАМ’ЯНОГО ХОЛЕЦИСТИТУ
Фролов В.М., Пілецький А.М., Пересадін М.О., Кузнецова Л.В.......................................................	35
СТАН ІМУНІТЕТУ У ХВОРИХ НА ХРОНІЧНЕ ОБСТРУКТИВНЕ ЗАХВОРЮВАННЯ ЛЕГЕНЬ
НА ФОНІ ХРОНІЧНОГО НЕКАЛЬКУЛЕЗНОГО ХОЛЕЦИСТИТУУ КОМПЛЕКСНІЙ ТЕРАПІЇ ХВОРИХ
Назаренко О. П. , Бабаджан В.Д. ...................................................................................................	41
ВЛИЯНИЕ ДОЛГОСРОЧНОЙ МИКРОМЕРКУРИАЛИЗАЦИИНА ГУМОРАЛЬНЫЙ
ОТВЕТ К ЛПС Е.COLI, СОДЕРЖАНИЕ ЦИК И КЛЕТОЧНЫЙ СОСТАВ КРОВИ
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ
Литус В.И. ....................................................................................................................................47
КОНЦЕНТРАЦІЯ ПРОЗАПАЛЬНИХ ЦИТОКІНІВ (IL-1 , TNF )У СИРОВАТЦІ КРОВІ ХВОРИХ
НА НЕАЛКОГОЛЬНИЙ СТЕАТОГЕПАТИТ
Єлізарова Т.О., Кузнєцова Л.В. ......................................................................................................	49
МЕТОДИКА ДОСЛІДЖЕННЯ ЦИТОТОКСИЧНОЇ АКТИВНОСТІ ІМУНОКОМПЕТЕНТНИХ
КЛІТИН МТТ-КОЛОРИМЕТРИЧНИМ МЕТОДОМ
Лісяний М.І., Любич Л.Д.................................................................................................................	54
СТАН ІМУННОЇ СИСТЕМИ ТА ЦИТОКІНОВОГО СТАТУСУ У ХВОРИХ ПІСЛЯ ПЕРЕНЕСЕНОГО
ГОСТРОГО ПОРУШЕННЯ МОЗКОВОГОКРОВООБІГУ ЗА ІШЕМІЧНИМ ТИПОМ
Бичкова Н.Г. ..................................................................................................................................	60
ФЕНОТИПІЧНІ ТА ЦИТОКІНОВІ ХАРАКТЕРИСТИКИ ЛІМФОЦИТІВУ ХВОРИХ НА ХОЗЛ
ІЗ СУПУТНІМ МЕТАБОЛІЧНИМ СИНДРОМОМ
Бичкова С. А. .................................................................................................................................	64
ВПЛИВ СУЧАСНОГО ІМУНОАКТИВНОГО ПРЕПАРАТУ НУКЛЕЇНАТУ НА ІНТЕРФЕРОНОВИЙ СТАТУС
ХВОРИХ З СИНДРОМОМ ХРОНІЧНОЇ ВТОМИ
Фролов В.М., Лоскутова І.В. .........................................................................................................	69

2

ІМУНОЛОГІЯ ТА АЛЕРГОЛОГІЯ: НАУКА І ПРАКТИКА. 3-4’2010

ИЗУЧЕНИЕ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ МОНОНУКЛЕАРОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ
КРОВИ ПО ПРОДУКЦИИ ЦИТОКИНОВ (IL-10, TNF- И IFN- ) ПОД ВОЗДЕЙСТВИЕМ
СТАФИЛОКОККОВОГО ТОКСИНА (SEB) В УСЛОВИЯХ IN VITRO У БОЛЬНЫХ ПСОРИАЗОМ
С ГЕНЕРАЛИЗОВАННЫМ ПАРОДОНТИТОМ
Алиева Л.Т., Борисенко А.В., Курченко А.И.....................................................................................	76
ОСОБЛИВОСТІ РОЗПОДІЛУ HLA-A, B, DR У ХВОРИХНА ХРОНІЧНУ ХВОРОБУ НИРОК,
ГЛОМЕРУЛОНЕФРИТЗ НЕФРОТИЧНИМ СИНДРОМОМ І-ІІ ТА V СТАДІЙ
Петрина О. П., Драннік Г. М., Дріянська В. Є., Величко М. Б............................................................	81
ЦИТОКІНОВИЙ ПРОФІЛЬ РОТОГЛОТОЧНОГО СЕКРЕТУ У ХВОРИХ З ГЕНЕРАЛІЗОВАНИМ
ПАРОДОНТИТОМ
Копельян Н.М. ...............................................................................................................................	88
КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ СПЕЦИФИЧЕСКИХ IGE АНТИТЕЛ К СОЕ
В ДИАГНОСТИКЕ ПИЩЕВОЙ АЛЛЕРГИИ
Прилуцкий А.С., Филатова Л.А., Лесниченко Д.А. ..........................................................................	91
АКТИВНОСТЬ МАТРИКСНЫХ МЕТАЛЛОПРОТЕИНАЗ -2 И -9 В СЫВОРОТКЕ КРОВИ
ПРИ ХРОНИЧЕСКОЙ КРАПИВНИЦЕ
А.С. Прилуцкий, О.М.Кущ, Д.А Лесниченко. ...................................................................................	94
СОСТОЯНИЕ ИММУННОГО ВОСПАЛЕНИЯ И ФУНКЦИИ ЭНДОТЕЛИЯ У БОЛЬНЫХ
ИШЕМИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНЬЮ СЕРДЦА СО СТАБИЛЬНОЙ СТЕНОКАРДИЕЙ
Гавриленко Т.И., Лутай М.И., Ломаковский А.Н., Подгайная Е.А.,
Рыжкова Н.А., Якушко Л.В., Мигалина О.А. ....................................................................................	96
ДИНАМІКА ІМУННОЇ ВІДПОВІДІ НА АЛОТА ТКАНИННІ АНТИГЕНИ ФЕТАЛЬНИХ
НЕЙРОКЛІТИН В ЕКСПЕРИМЕНТІ
Лісяний М.І., Любич Л.Д...............................................................................................................	104
ГЕНЕТИЧНІ АСПЕКТИ АТОПІЧНОГО ДЕРМАТИТУ
Плахотна Д.В., Савчук Г.М., Гуменюк Н.О. ....................................................................................	111
ВЛИЯНИЕ ПРИМЕНЕНИЕ ПРОБИОТИКОВ НА КАЧЕСТВО ЖИЗНИ, ЛЕЧЕНИЯ, ДИСБАЛАНС
АНТИЭНДОТОКСИНОВОГО ИММУНИТЕТА И УРОВЕНЬ С-РЕАКТИВНОГО БЕЛКА
У БОЛЬНЫХ САХАРНЫМ ДИАБЕТОМ 2 ТИПА
Сульская Ю.В. .............................................................................................................................	119
ЗНАЧЕННЯ ІМУНОКОМПЛЕКСНИХ РЕАКЦІЙ У ФОРМУВАННІ РЕЦИДИВНИХ ФОРМ
ГЕНЕРАЛІЗОВАНОГО ПАРОДОНТИТУ
Копельян Н.М., Лоскутова І.В. .....................................................................................................	124
ПОРІВНЯННЯ ЕФЕКТИВНОСТІ ІНДУКТОРІВ ІНТЕРФЕРОНОУТВОРЕННЯ ПРИ
ЦИТОМЕГАЛОВІРУСНІЙ ІНФЕКЦІЇ У ЖІНОК З НЕВИНОШУВАННЯМ ВАГІТНОСТІ
Господарська Х.О. .......................................................................................................................	128
ХАРАКТЕРИСТИКА ТИТРІВ АНТИТІЛ ДО ТКАНИНИ ЩИТОПОДІБНОЇ ЗАЛОЗИ, ПОКАЗНИКІВ
ТИРЕОЇДНОГО ГОМЕОСТАЗУ, ПРО-ТА АНТИОКСИДАНТНОЇ СИСТЕМ КРОВІ У ХВОРИХ
НА ХРОНІЧНІ ДИФУЗНІ ЗАХВОРЮВАННЯ ПЕЧІНКИ ЗАЛЕЖНО ВІД ПОЛІМОРФІЗМУ ГЕНІВ
Чимпой К.А., Пашковська Н.В., Курченко А.І.................................................................................	131
КЛИНИКО-ИММУНОЛОГИЧЕСКОЕ И АЛЛЕРГОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ
ЭФФЕКТИВНОСТИ ПРИМЕНЕНИЯ ПРЕПАРАТА ЭНТЕРОСГЕЛЬ ПРИ ПИЩЕВОЙ АЛЛЕРГИИ
Мельников О.Ф., Забродская Л.В., Тимченко М.Д.,Семенов В.Г.,
Сидоренко Т.В., Наумова О.А.......................................................................................................	137
ОСОБЛИВОСТІ ЛОКАЛЬНОЇ ПРОДУКЦІЇ ІНТЕРЛЕЙКІНІВ - 6, -17, -23 І ТРАНСФОРМУЮЧОГО
ФАКТОРУ РОСТУ - 1 У ХВОРИХ НА ХРОНІЧНИЙ АБАКТЕРІАЛЬНИЙ ПРОСТАТИТ,
УСКЛАДНЕНИЙ БЕЗПЛІДДЯМ
Драннік Г.М., Порошина Т.В. ........................................................................................................	140
АВТОРАМ ЖУРНАЛЬНИХ ПУБЛІКАЦІЙ....................................................................................	146

3

ІМУНОЛОГІЯ ТА АЛЕРГОЛОГІЯ: НАУКА І ПРАКТИКА. 3-4’2010

ВЛИЯНИЕ ЕЖЕДНЕВНОГО ПРИЕМА ПРОБИОТИЧЕСКОГО ПРОДУКТА АКТИМЕЛЬ НА ПОКАЗАТЕЛИ СИСТЕМНОГО ИММУНИТЕТА У СТУДЕНТОВ

ДРАННИК Г.Н.1,2, КУРЧЕНКО А.И.2, САВЧЕНКО В.С.1, ТАРАСОВА И.И.1

1ГУ «Институт урологии АМН Украины»

2Киевский Национальный медицинский университет им. О.О.Богомольца

ВВЕДЕНИЕ

Согласно современным эпидемиологическим исследованиям дисбиозом кишечника страдает около 90% всего населения земного шара. Дисбиоз кишечной микрофлоры является не только причиной, способствующей развитию различных патологических процессов в организме, но и в дальнейшем становится одним из факторов, обуславливающим тяжесть и продолжительность заболевания. Изменение количественного состава и качественного соотношения микроорганизмов в кишечнике чаще всего проявляется развитием синдрома пищеварительной недостаточности, который характеризуется диареей, неустойчивым стулом, запорами, желудочной и кишечной диспепсией, астеническим синдромом, протекающими на фоне формирующегося иммунодефицитного состояния, способствующего повышенной склонности индивидуумов к аллергическим и инфекционным заболеваниям [1].

Как стало известно, наиболее частым проявлением иммунодефицита, развившегося на фоне дисбиоза кишечника, являются проявления вирусной инфекции [2]. В этой связи интересным представляется изучение характера влияния пищевых пробиотических продуктов, содержащих Lacto- и Bifidum бактерии на иммунологический статус здоровых лиц с целью выработки дальнейшей тактики лечения и иммунореабилитации больных с проявлением иммунодефицита [3].

Выяснилось, что дисбиоз кишечника может приводить к функциональному сдвигу системного клеточного иммунитета в сторону продукции цитокинов Th2 профиля и связанное с этим подавление функции Th1 клеток [4]. Как известно, сдвиг в сторону цитокинов Th2 профиля приводит к снижению продукции IFN- и снижению противовирусной и противоопухолевой защиты организма, а также способствует аллергизации [5]. Назначение диеты с дополнительным употреблением в пищу продуктов, содержащих Lacto- и Bifidum бактерии, приводит к снижению вредной микробной нагрузки на кишечник и создает условия для переключения синтеза цитокинов с Th2 на Th1профиль, что приводит к усилению резистентности организма к вирусной инфекции [6].

Патогенетическим обоснованием исчезновения иммунодефицитного состояния при нормализации биоценоза кишечника может служить также нормализация функционального взаимодействия между дендритными клетками (DC) и натуральными киллерными клетками (NК) в слизистой оболочке кишечника посредством регуляции синтеза цитокинов IL-12, IL-15 и IL-18 [7].

Появились новые данные, позволяющие предположить, что нормализация кишечной флоры приводит к повышению функциональной активности DC, расположенных в слизистой оболочке кишечника и способствует усилению активационных сигналов для NК клеток, под действием которых NК клетки активируют свою цитотоксическую функцию [8]. В последние годы это предположение все больше подтверждается новыми данными о роли таких активационных сигналов, которую способны исполнять IL-12, IL-15 и IL-18 в контексте взаимодействия между DC и NК клетками [9].

Однако остается непонятным факт влияния состава микрофлоры кишечника на характер локального и системного межклеточного взаимодействия.

В связи с этим, на кафедре клинической иммунологии и аллергологии с секцией медицинской генетики Национального медицинского университета были проведены исследования влияния ежедневного приема пробиотического продукта Актимель на основные показатели иммунного статуса и функциональной активности мононуклеаров периферической крови у студентов в период интенсивного учебного процесса.

Цель исследования:

Основная цель работы состояла в том, чтобы подтвердить имеющиеся в литературе научные данные относительно положительного влияния пробиотического кисломолочного продукта питания Актимель на показатели врожденного иммунитета.

Задачи исследования:

1.Изучить кислород-зависимую (НСТ-тест) и NO-зависимуюфункциюклетокмоноцитарно- макрофагального ряда у студентов до и после употребления продукта Актимель.

4

ІМУНОЛОГІЯ ТА АЛЕРГОЛОГІЯ: НАУКА І ПРАКТИКА. 3-4’2010

2.Исследовать функциональную активность NK клеток периферической крови студентов по способности экспрессировать перфорин до и после употребления продукта Актимель.

3.Оценить динамику изменений цитокинового профиля (IL-12, IL-15 и IL-18) периферической крови у студентов под воздействием приема пробиотического продукта Актимель.

4.Изучить показатели системного иммунитета у студентов до и после употребления продукта Актимель.

ПЛАН ИССЛЕДОВАНИЯ

Общий дизайн исследования

Исследование проводилось по ограниченной программе как открытое, сравнительное исследование влияния на состояние системного иммунитета студентов в условиях ежедневного приема продукта Актимель на протяжении 6 недель. Продукт принимался по 100 мл (2 бут.) в сутки. Эффект от приема исследуемого продукта оценивался по основным показателям состояния клеточного и гуморального иммунитета у студентов до и после приема.

Набор испытуемых

Из 200 студентов, добровольно изъявивших желание принять участие в исследовании, были отобраны 50 человек для формирования исследуемой группы.

Критерии включения в исследование

Студенты (поровну мужского и женского пола) с хорошим общим состоянием здоровья после ознакомления с условиями исследования и подписания информированного согласия

Критерии исключения

Прием препаратов обладающих иммуностимулирующим эффектом на протяжении 6 недель до начала исследования.

Регулярный прием Актимель и других пробиотических продуктов на протяжении 6 недель до начала исследования.

Хронические заболевания. Документально подтвержденная аллергия на

лактозу.

Прохождение стационарного лечения за 6 недель до начала исследования.

Критерии оценки Основные критерии:

–Общее состояние, аппетит и результаты академической успеваемости

Дополнительные критерии:

–Динамика системных иммунологических показателей: показатели иммунограммы (количество клеток CD3, CD4, CD8, CD19; концентрация sIgА и Ig Е;

–Функциональные показатели клеток моноцитарно-макрофагального ряда: NO и NST.

–Показатели количественных (CD16, CD56) и качественных (Perforin+) характеристик функциональной активности натуральных киллерных клеток (NK)

–Определение уровня цитокинов (IL-12, IL-15 и IL-18 ) в сыворотке крови

–Определение уровня кортизола в периферической крови

Критерии выбывания из исследования

Для каждого конкретного участника условиями прекращения приема продукта и выбывания из исследования являлись:

индивидуальная непереносимость продукта; возникновение в ходе исследования тяжелых

и/или неожиданных побочных явлений; клинически значимые отклонения лабора-

торных показателей; значительное ухудшение общего состояния

в период исследования; отказ от участия в исследовании.

График исследования

Исследование включало следующие этапы: 1й этап - скрининг 7 дней (период набора участников исследования, сдача анализов), 2й этап - период приема продукта - 42 дня, 3й этап – 50й день – повторная сдача анализов.

Регистрация данных проводилась по следующей схеме приведенной в таблице 1.

Таблица 1.

Схема регистрации данных исследования

	Скрининг		Прием продукта		Наблюдение
Дни исследования	-1	0	7	49	50
Визиты (точки наблюдения)	1	2	3	4	5
Сбор анамнеза и предварительная оценка соответствия
критериям включения/исключения
Получение письменного Информированного Согласия
Лабораторное обследование:
общий анализ крови
иммунологические исследования
Выявление и регистрация возможных побочных реакций

5

ІМУНОЛОГІЯ ТА АЛЕРГОЛОГІЯ: НАУКА І ПРАКТИКА. 3-4’2010

В период набора участников проводилось клинико-лабораторное обследование каждого потенциального субъекта исследования (скрининг), включающее:

демографические данные (возраст, пол); анамнез; клиническое обследование (АД, ЧСС, темпе-

ратура тела); общий анализ крови (эритроциты, гемо-

глобин, цветной показатель, лейкоциты, тромбоциты, СОЭ);

Все участники имели хорошее здоровье, что подтверждалось их анкетами, физическими данными и общими гематологическими анализами. Все студенты дали официальное письменное согласие на участие в данном экспериментальном исследовании, которое предварительно было одобрено местным Комитетом по медицинской этике.

Студенты, включенные в исследование, были распределены в основную исследуемую (50 человек) группу. Каждому субъекту исследования был присвоен порядковый номер, который соответствовал последовательности включения данного пациента в исследование. Порядковый номер был внесен в Индивидуальную регистрационную форму.

Схема приема продукта Актимель

Студенты (50человек) получали продукт Актимель содержащий специальный пробиотический штамм Lactobacillus casei DN-114 001 (108 КОЕ/мл) — коммерческое название casei DEFENSIS и две стандартные йогуртовые культуры Lactobacillus bulgaricus (107 КОЕ/мл) и Streptococcus thermophilus (108 КОЕ/мл) в дозировке 100 мл два раза в день до еды. Участников исследования опрашивали, как они выполняют требования исследования, и нет ли проблем со здоровьем, которые могли бы быть связаны с потреблением продукта. Потребление продукта Актимель в рационе питания контролировалось с целью оценки специфического влияния пробиотика именно на иммунную систему. Лабораторные и иммунологические показатели оценивались до начала исследования (7-й день) и по окончании 6-й недели приема пробиотического продукта (на 50-й день).

При проведении исследования исключалось назначение:

средств, обладающих иммуностимулирующим действием, иммунодепрессантов;

глюкокортикостероидов; препаратов, содержащих спирт.

Условия возможного прекращения исследования

Для каждого конкретного участника условиями прекращения исследования были: ин-

дивидуальная непереносимость исследуемого продукта, возникновение в ходе исследования тяжелых и/или неожиданных побочных явлений, значительное ухудшение общего состояния в период исследования, отказ от участия в исследовании.

Исследование должно было быть прервано в случае возникновения выраженных побочных эффектов в первые дни или часы испытания. О приостановке испытания исследователь должен был известить Заказчика.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Иммунофенотипирование мононуклеаров периферической крови методом лазерной проточной цитофлуорометрии.

Мононуклеары периферической крови каждого участника исследования были выделены, используя стандартное центрифугирование в градиенте фиколл-изопак. Клетки промывали 3 раза буферным фосфатно-солевым раствором, ресуспендировали в фосфатном буфере, содержащем 2%-ную человеческую сыворотку и использовались для дальнейшего анализа.

Полученные мононуклеары периферической крови окрашивали в прямом одно и двухцветном иммунофлюоресцентном тесте. Использовали моноклональные антитела (МКА) из набора фирмы Becton Dickinson (CD3, CD4, CD8, CD16 и CD19), меченые флюоресцеинизотиоцианатом (FITC) и фикоэритрином (PE). Для контроля уровня неспецифического связывания коньюгатов МКА образцы окрашивали мышиными МКА против гемоцианина фиссуреллы (Keyhole limpet) субклассов IgG1 и IgG2а, мечеными соответственно FITC и PE. Иммунофенотипический профиль клеток изучали на проточном лазерном цитофлюориметре FACScan (Becton Dickinson, USA). Сбор данных и статистическую обработку полученных результатов проводили с помощью программного обеспечения LYSYSII Ver. 1.1 (Becton Dickinson), WinMDI 2.8 (Joseph Trotter, Scripps Institute, La Jolla, CA) и Microsoft Excel 2000 из пакета Microsoft Office 2000.

Определение иммунофенотипа NKклеток, экспрессирующих перфорин, методом лазерной проточной цитофлуорометрии.

Для определения специфических маркеров натуральных киллерных клеток, мононуклеары периферической крови здоровых доноров окрашивали в прямом одно- и двуцветном иммунофлуоресцентном тесте. В исследовании использовали моноклональные антитела (мкАТ) (anti-CD56), меченные флюоресцеином (FITC) и (anti-perforin) , меченные фикоэритрином (РЕ).

Сбор данных и статистическую обработку полученных результатов проводили с помощью программного обеспечения LYSYS-II Ver.I.I.

6

ІМУНОЛОГІЯ ТА АЛЕРГОЛОГІЯ: НАУКА І ПРАКТИКА. 3-4’2010

(Becton Dickinson), Win MDI 2.8 (Joseph Trotter, Scripps Institute, LA Jolla, CA, USA) и Microsoft Excel 2000 из пакета Microsoft Office 2000.

Иммуноферментный метод исследования концентрации цитокинов, иммуноглобулинов (sIg A, IgE) и кортизола в сыворотке

Концентрацию цитокинов, sIgA, IgE и кортизола в сыворотке крови исследуемых определяли при помощи иммуноферментного метода. Для определения содержания цитокинов использовали тест систему “INVITROGEN” (США), “Bender Medsystems” (США) и “Biosource” (США).

Тестирование проводилось при помощи иммуноферментного анализатора Stat Fax 303 Plus (США).

Определение содержания цитокинов, иммуноглобулинов (sIgA, IgE) и кортизола. В 96-луночные планшеты добавляли: по 100 мкл стандартов в соответствующие лунки для построения калибровочной кривой. В остальные лунки вносили по 100 мкл исследуемой сыворотки. Во все лунки добавляли по 50 мкл соответствующих антител. Планшеты инкубировали при комнатной температуре в течение 2 часов, потом лунки 5 раз тщательно промывали буфером и удаляли остатки жидкости. Затем, в каждую лунку вносили по 100 мкл коньюгата (стрептавидин-пероксидазу), включая и “нулевую” пробу. После этого пробы инкубировали при комнатной температуре в течение 30 минут. Повторяли промывку планшеты 5 раз и вносили во все лунки по 100 мкл TMB-субстрата хромогена. После инкубации в течение 12-15 минут останавливали ферментативно-субстратную реакцию, добавляя в каждую лунку по 100 мкл H2SO4. По окончании реакции проводили определение оптической плотности стандартов и образцов исследуемой сыворотки при длине волны 450 нанометров.

Для достоверной оценки результатов калибруется стандартная кривая, которая при построении должна быть линейной и указывать на прямо пропорциональный характер между уровнем концентрации цитокина, Ig G, M, A, E и кортизола в сыворотке и оптической плотностью. Данные анализа концентрации исследуемых веществ определяли путем их интерполяции с полученной кривой.

Тест восстановления нитросинего тетразолия (НСТ) для определения кислородзависимой функциональной активности мононуклеарных клеток

0,15% раствор НСТ готовим на изотоническом буфере, который содержит 100 мкг НСТ. Лейкоконцентрат получаем при помощи выделения на градиенте фиколл-верографин. Для

проведения теста используем несколько проб лейкоконцентрата по 1,5х106 кл/мл в каждой. Все пробы центрифугируем 10 мин. при 1500 об/мин. Надосадочная жидкость отбирается и к клеткам добавляется по 1 мл 0,15% раствора НСТ в каждую пробирку. Пробы инкубируются 1 час при 37°С, потом центрифугируются 10 мин. при 1500 об/мин. Отбирается супернатант и для травмирования клеток применяется 3-кратное замораживание-оттаивание. После оттаивания пробы центрифугируются 15 мин. при 3000 об/мин. (для осаждения диформазана). Результат учитывается на аппарате Stat Fax 303 Plus (США). Метод позволяет оценить кислород-зависимую функциональную активность мононуклеарных клеток (Пастушенков В.Л. и соавт. 1989) [10].

Определение уровня продукции NO для оценки активности моноцитарных клеток.

Для определения в лимфоцитах стабильного метаболита NO – нитрит иона – (NO2-) к 100 мкл супернатанта добавляли Greiss-реактив в аналогичном объеме (1:1) в качестве цветообразующего агента для оценки реакции. Greissреактив состоит из 1 части 1% сульфаниламида, 1 части 0,1% нафтилетиленамида и равной им по объему 5% фосфорной кислоты. После 10-минутной инкубации проводили определение оптической плотности стандартов (раститровка нитрита азота в культуральной среде) и образцов супернатанта на спектрофотометре при длине волны 492-630 нанометров.

Для достоверной оценки результатов стандартная кривая при построении должна быть линейной и указывать на прямопропорциональный характер зависимости между уровнем концентрации NO в супернатанте и единицами оптической плотности. Данные анализа проб относительно уровня синтеза оксида азота определяли путем их интерполяции с полученной кривой [11; 12].

Метод статистической обработки результатов.

Полученные данные обработаны статистически на персональном компьютере с помощью пакета программ “SPSS for Windows. Версия 11”. Математическая обработка полученных результатов проводилась с учетом проверки показателей на нормальное распределение за тестом Колмогорова-Смирнова. Для статистической обработки использовались параметрические критерии статистики - тест Стьюдента, а также критерий Манна-Уитни с поправкой Бонферони. Обработка данных проводилась с помощью программы Excel. Для сравнения двух зависимых выборок использовали традиционный непараметрический тест Уилкоксона. Достоверной считали разницу при р<0,05.

7

ІМУНОЛОГІЯ ТА АЛЕРГОЛОГІЯ: НАУКА І ПРАКТИКА. 3-4’2010

ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ

1. Оценка состояния показателей врожденного иммунитета с помощью изучения кислород-зависимой (НСТ-тест) и NOзависимой функции клеток моноцитарномакрофагального ряда у студентов до и после употребления продукта Актимель.

Прогрессивное снижение иммунной функции, развивающееся на фоне стрессовых ситуаций, связано со снижением уровня сопротивляемости заболеваниям. По результатам различных исследований предлагается использование некоторых пробиотиков, тормозящих снижение иммунного статуса, связанное с присутствием хронического стресса. Продукты, содержащие пробиотики, оказывают несомненную пользу для здоровья людей. Примером может служить способность штаммов лактобактерий Lactobacillus casei к иммунномодуляции, проверенная на животных. Тем не менее необходимо проведение клинических испытаний, которые должны определить, как именно пробиотики влияют на неспецифические факторы защиты.

Ранее было отмечено, что при стрессовых ситуациях развивается дисфункция иммунной системы, которая, в общем, отражается на концентрациях иммуноцитов. Врожденная иммунная система проходит через эти изменения, отчасти обусловленные износом сигнальной межклеточной системы, связанным с хронической стрессовой нагрузкой. Исходя из этого, макрофаги теряют способность способностью к разрушению бактерий, а естественные киллеры

уже не могут так легко уничтожать опухолевые клетки и клетки зараженные вирусами.

Несмотря на то что некоторые люди имеют, несомненно, хорошее здоровье с высоким иммунным статусом, иммунная система многих людей вследствие воздействия хронического стресса реагирует на инфекции иначе. На основании этого положения проверено воздействие ежедневного потребления йогурта, ферментированного лактобактериями L. casei DN114001, на «респираторный взрыв» моноцитов и противоопухолевую активность естественных киллеров. Наблюдаемый в ходе эксперимента эффект от потребления пробиотика в обоих случаях оказался положительным.

В этой связи остается интересным изучение кислород-зависимой (НСТ-тест) и NOзависимой функции клеток моноцитарномакрофагального ряда до и после употребления продукта Актимель у студентов находящихся в условиях интенсивного учебного процесса.

1.1. Оценка динамика изменений показателей оксида азота до и после приема пробиотического продукта Актимель.

Установлено, что способность синтезировать NO из аминокислоты L-аргинин с помощью фермента NO-синтазы присуща макрофагам в ответ на бактериальные эндотоксины или провоспалительные цитокины.

На рис.1 представлена динамика изменения показателей оксида азота до и после приема пробиотического продукта Актимель.

90

80

70

60

50

40
30
20
10
0	ФГА	ЛПС
CП

До приема Актимель

После приема Актимель

Рис. 1. Динамика изменений показателей оксида азота до и после приема пробиотического продукта Актимель.

8

ІМУНОЛОГІЯ ТА АЛЕРГОЛОГІЯ: НАУКА І ПРАКТИКА. 3-4’2010

Как видно из рисунка 1, у студентов до приема пробиотического продукта Актимель спонтанная секреция NO составляла в среднем 22,67±2,5 пкг/мл. Стимулирование стандартными митогенами ФГА и ЛПС повышало секрецию клетками NO и составляло 69,4±5,2 и 43,6±3,9 пкг/мл соответственно (р<0,001). После приема пробиотического продукта Актимель спонтанная секреция NO достоверно повышалась и составляла в среднем 38,1±2,9 пкг/мл.

Стимулирование стандартными митогенами ФГА и ЛПС достоверно приводило к более выраженному усилению секреции NO клетками и составляло 85,7±4,2 и 81,05±16,9 пкг/мл соответственно (р<0,001).

Резюме

Анализ данных позволяет заключить, что по окончанию приема пробиотического продукта Актимель происходит достоверное усиление продукции NO клетками у студентов исследуемой группы, превышающее продукцию NO до приема пробиотического продукта, что может косвенно подтверждать усиление NOзависимой функциональной активности клеток фагоцитирующего ряда.

1.2. Оценка динамика изменений показателей НСТ-теста до и после приема пробиотического продукта Актимель.

Оценка показателей активности окисли- тельно-восстановительных процессов во время фагоцитоза (НСТ-тест) представляет важную характеристику клеточного звена врожденного иммунитета.

На Рис 2. представлены результаты исследования клеток в НСТ-тесте до и после приема пробиотического продукта Актимель.

NST
0,16
0,14
0,12
0,1
0,08
0,06
0,04
0,02
0	после приема
до приема
Актимель	Актимель
Рис. 2. Динамика изменений показателей
НСТ-теста до и после приема пробиотического
продукта Актимель (ед. опт. пл.).
Как видно из рисунка 2, до приема пробио-
тического продукта Актимель показатели НСТ-
теста составляли 0,118±0,001(ед. опт. пл.). По-
сле приема пробиотического продукта Актимель
показатели НСТ-теста достоверно повышались

и составляли в среднем 0,145±0,02(ед. опт. пл.) (р<0,05).

Резюме

Проведенный анализ полученных данных позволяет заключить, что по окончанию приема пробиотического продукта Актимель происходит достоверное усиление показателей НСТтеста у студентов исследуемой группы, превышающее аналогичные показатели, зафиксированные до приема пробиотического продукта, что говорит об усилении кислород-зависимой функциональной активности клеток фагоцитарного ряда.

2. Исследование функциональной активности NK клеток периферической крови студентов по способности экспрессировать перфорин до и после употребления продукта Актимель.

Естественные киллерные клетки или натуральные киллеры (NК) представляют собой неоднородную субпопуляцию, которая в процессе эволюции приобрела большое значение для формирования врожденного и приобретенного иммунитета. Эти клетки занимают важное место

вподдержании иммунологического гомеостаза, непосредственно участвуя в уничтожении инфицированных вирусом клеток и опухолей. Как стало известно, основной путь уничтожения пораженных клеток связан с литической способностью ферментов (гранзимов), содержащихся

вгранулах NК. Однако для проникновения гранзимов в клетку-мишень необходимо наличие в гранулах NК перфорина, фермента, который нарушает мембрану клетки-мишени, что влечет за собой проникновение гранзимов и включение механизма апоптоза. В настоящее время одним из показателей активности NК-клеток служит экспрессия ими перфорина.

Известно, что стрессовые ситуации сопровождаются функциональными нарушениями клеточного иммунитета. При этом NK клетки, обеспечивающие противовирусный и противоопухолевый иммунитет у лиц, находящихся в состоянии хронического стресса заметно снижают свою функциональную активность. Было замечено, что употребление в пищу Lactobacillus rhamnosus или Bifidobacterium lactis в течение 3-х недель приводит к повышению количества NK -клеток и выраженному усилению их противоопухолевой активности. Существует предположение, что характер иммунного ответа и наличие дефицита функции NK клеток у соответствующих индивидуумов может быть скорректировано при помощи комплексной терапии с использованием пробиотических продуктов питания.

Вэтой связи представлялось интересным изучение влияния ежедневного приема пробио-

9

ІМУНОЛОГІЯ ТА АЛЕРГОЛОГІЯ: НАУКА І ПРАКТИКА. 3-4’2010

тического продукта Актимель на количество и функциональную активность NK клеток периферической крови по способности экспрессировать перфорин у студентов находящихся в условиях интенсивного учебного процесса.

Полученные изменения в показателях количества мононуклеаров периферической крови, способных экспрессировать маркер NK клеток CD16, CD56 и перфорин у студентов до и после приема продукта Актимель представлены на Рисунках 3 и 4.

CD16+56+
абс. число
400
350
300
250
200
150
100
50
0
до приема Актимель	после приема Актимель

Рис. 3. Уровень экспресии клетками маркера CD16+CD56+ NK клеток в крови у студентов до и после приема продукта Актимель по данным лазерной проточной цитометрии (в % Кл).

CD16+56+
абс. число
400
350
300
250
200
150
100
50
0
до приема Актимель	после приема Актимель

Рис. 4. Уровень экспресии перфорина CD56+ NK клетками крови у студентов до и после приема продукта Актимель по данным лазерной проточной цитометрии (в % Кл).

Исходя из данных приведенных на Рис.3, при проведении проточной цитофлуорометрии в крови студентов общая численность CD16+CD56+ NK клеток до приема продукта Актимель равнялась (17,06±0,88%) и достоверно не отличалась от аналогичных показателей, которые были получены после приема пробиотического продукта (15,2±0,6%).

Как видно из Рис. 4, в крови студентов исследуемой группы после приема продукта Акимель общая численность CD56+ натуральных киллерных клеток, экспрессирующих Перфорин равнялась (82,98±1,25%) и почти не отличалась от аналогичных показателей, которые наблюдались к концу приема прбиотического продукта (85,12±0,69%).

Резюме

Шестинедельный курс приема пробитического продукта Актимель не привел к достоверному изменению в периферической крови общей численности CD16+CD56+ NK клеток и количества CD56+ NK клеток экспрессирующих Перфорин у студентов находящихся в условиях интенсивного учебного процесса. Уровень указанных клеток колебался в пределах возрастной нормы.

3. Исследование динамики изменений цитокинового профиля (IL-12, IL-15 и IL-18) периферической крови у студентов под воздействием приема пробиотического продукта Актимель.

3.1. Оценка изменения показателя фонового уровня IL-12 в периферической крови у студентов принимающих пробиотический продукт Актимель.

Ключевую роль в иммунной системе слизистых играют дендритные клетки, которые относятся к так называемым «профессиональным» антиген-презентирующим клеткам и представлены во всех отделах желудочно-кишечного тракта. Они первые отвечают на внедрение патогенна в организм, активируя врожденный иммунитет, а затем регулируют развитие адаптивного Т-клеточного ответа, и в особенности поляризацию Тh1/ Th2 клеток.

IL-12 - один из важных цитокинов, продуцируемых макрофагами, дендритными клетками, от которого зависит форма специфического иммунного ответа. В его присутствии CD4+ Т-лимфоциты дифференцируются в воспалительные Т-клетки хелперы 1 типа (Тh1), которые начинают продуцировать и секретировать IL-2 и-ИНФ. Биологические эффекты IL-12 многообразны: от усиления пролиферации лимфоцитов и потенцирования действия IL-2 до активации естественных киллеров и индукции дифференцировки цитотоксических лимфоцитов.

При изучении влияния лактобактерий на продукцию дендритными клетками цитокина IL -12 было показано, что L.casei в наибольшей, а L.reuteri – в наименьшей степени способны к стимуляции IL-12. Установлено, что инкубация клеток кишечного эпителия с лакто- и бифидобактериями, характерными для раннего детского возраста, снижают продукцию провоспалительного цитокина IL-8, индуцированного

10