11.1. Механизмы клеточного деления

Эндокринная, паракринная и аутокринная регуляция. В норме клетки делятся исключительно под воздействием различных факторов внутренней среды организма (и внешних — по отношению к клетке). В этом состоит их коренное отличие от трансформированных клеток, деля­щихся под воздействием эндогенных стимулов. Существуют два типа физиологической регуляции — эндокринная и паракринная. Эндокринная регуляция осуществляется специализированными органами (железами внутренней секреции), в числе которых гипофиз, надпочечники, щитовид­ная, паращитовидная, поджелудочная и половые железы. Они секрети­руют продукты своей активности в кровь и оказывают генерализованное воздействие на весь организм.

Паракринная регуляция характеризуется тем, что в одной и той же ткани соседние клетки воздействуют друг на друга посредством секрети- руемых и распространяющихся диффузией активных веществ. К числу таких митогенных стимуляторов (полипептидные ростовые факторы) относятся эпидермальный фактор роста, фактор роста тромбоцитов, ин- терлейкин-2 (фактор роста Т-клеток), фактор роста нервов и множество других.

Аутокринная регуляция, характерная для опухолевых клеток, отли­чается от паракринной тем, что одна и та же клетка является и источни­ком ростового фактора, и его мишенью. Результат — непрекращающееся, самоподдерживающееся митогенное «возбуждение» клетки, приводящее к нерегулируемому размножению. При этом клетка не нуждается во вне­шних митогенных стимулах и становится полностью автономной.

Перенос митогенного сигнала — процесс многоэтапный. В зави­симости от типа клетки и от конкретного митогенного стимула реализу­ется один из множества сигнальных путей. Ниже в качестве «прототипа» описан так называемый МАР-киназный каскад.

Ростовые факторы (регуляторы пролиферации) секретируются одними клетками и действуют паракринным образом на другие. Это не­большие белки. Полипептидная цепь EGF (epidermal growth factor) состоит, например, из 53 аминокислот. Существует несколько семейств ростовых факторов, представитель каждого из которых объединен структурным и функциональным сходством. Одни из них стимулируют пролиферацию (например, EGF и PDGF, platelet-derived growth factor, тромбоцитарный фактор роста), а другие (TGF-(3, TNF, интерфероны) — подавляют.

Рецепторы расположены на клеточной поверхности. Каждая клет­ка имеет присущий ей репертуар рецепторов и соответственно свой осо­бый набор ответных реакций. Очень важное в функциональном отноше­нии семейство образуют так называемые тирозинкиназные рецепторы (ТКР), обладающие ферментативной (протеинкиназной) активностью. Они состоят из нескольких доменов (структурно-функциональных блоков): внеклеточного (взаимодействующего с лигандом — в данном случае с ростовым фактором), трансмембранного и подмембранного, обладаю­щего тирозинпротеинкиназной активностью. В зависимости от структу­ры ТКР подразделяют на несколько субклассов.

При связывании с ростовыми факторами (например, EGF) молеку­лы рецепторов димеризуются, их внутриклеточные домены сближаются и индуцируют межмолекулярное автофосфорилирование по тирозину. Этоттрансмембранный перенос сигнала —■ начало волны «возбуждения», распространяющейся затем в виде каскада реакций фосфорилирования внутрь клетки и достигающей в итоге хромосомного аппарата ядра. ТКР обладают тирозинкиназной активностью, но по мере продвижения сиг­нала внутрь клетки тип фосфорилирования меняется на серин/треонино- вый.

Ras-белки. Одним из наиболее важных является сигнальный путь с участием Ras белков (это подсемейство так называемых G-белков, обра­зующих комплексы с гуаниловыми нуклеотидами; Ras-GTP — активная форма, Ras-GDP — неактивная). Этот путь — один из основных в регуля­ции клеточного деления у высших эукариот — настолько консервативен, что его компоненты способны заменить соответствующие гомологи в клет­ках дрозофилы, дрожжей и нематод. Он опосредует многочисленные сиг­налы, исходящие из окружающей среды, и функционирует, по-видимо- му, в каждой клетке организма. Ras играет роль своеобразного турникета, через который должен пройти почти любой из поступающих в клетку сиг­налов. Критическая роль этого белка в регуляции клеточного деления из­вестна с середины 80-х годов, когда активированная форма соответству­ющего гена (онкоген Ras*) была обнаружена во многих опухолях человека. Активация онкогена (онкогены — гены, вызывающие нерегулируемое кле­точное деление) — одно из главных событий канцерогенеза. Это такое повреждение нормального, участвующего в регуляции клеточного размно­жения гена (протоонкогена — нормального клеточного гена, способного при нарушении структуры индуцировать опухолевый рост), которое де-

* Названия онкогенов в ряде случаев (ноне всегда) происходят оттехретрови- русов, в которых они были первоначально обнаружены, и, как правило, не отражают их функционального назначения.

лает его перманентно работающим (активным) и, тем самым, индуциру­ющим столь же непрерывное (нерегулируемое) клеточное деление. По­скольку в регуляции клеточного размножения принимает участие мно­жество клеточных генов (протоонкогенов), повреждение которых потенциально способно вызывать опухолевый рост, то соответственно существует и множество (несколько десятков, а возможно и сотен) онко­генов.

В конкретной ситуации Ras-опосредованного сигнального пути (на­пример, при взаимодействии EGF с рецептором) димеризация последнего приводит к автофосфорилированию одного из остатков тирозина в его подмембранном домене. В результате этого становится возможной са­мосборка («рекрутирование» в комплекс) ряда белков, расположенных ниже в сигнальном пути (адаптерный белок Grb2, белок Sos1). Этот муль- тибелковый комплекс локализован в плазматической мембране.

МАР-киназный каскад. МАР-киназы (mitogen activated protein kinases) — серин/треониновые протеинкиназы, активируемые в резуль­тате митогенной стимуляции клетки. Киназный каскад возникает как след­ствие последовательной активации одного фермента другим, стоящим «выше» в сигнальном пути. Как следствие стимуляции белка Ras и фор­мирования подмембранного комплекса повышается активность двух ци- топлазматических серин/треониновых МАР-киназ (известных так же как ERK1 и ERK2, extracellular signal-regulated protein kinases 1 and 2), кото­рые перемещаются из цитоплазмы в ядро клетки, где фосфорилируют ключевые факторы транскрипции — белки-регуляторы активности раз­личных генов.

Активация транскрипции. Группа генов, определяющих вхождение клетки в фазу S, активируется транскрипционным фактором АР-1 — ком­плексом белков Jun и Fos (гены, их кодирующие — c-Jun и c-Fos, отно­сятся к числу протоонкогенов; с — от cell, обозначает их клеточное про­исхождение в отличие от вирусных онкогенов v-Jun и v-Fos). Эти транскрипционные факторы могут взаимодействовать между собой с об­разованием множества гомо- и гетеродимеров, связывающихся с опре­деленными участками ДНК и стимулирующих синтез РНК на прилежащих к этим участкам генах. МАР-киназы повышают активность АР-1 двояким образом:

• опосредованным, активируя гены, кодирующие эти транскрипцион­ные факторы, и увеличивая тем самым их содержание в клетке;

• прямым, фосфорилируя входящие в их состав сериновые и треони-

новые остатки.

В результате активации генов продуцируются белки, необходимые для синтеза ДНК и последующего митоза. Некоторые из новообразован­ных белков (Fos, Jun, Мус), известные как белки раннего ответа (immediate- early proteins), выполняют регуляторные функции; связываясь со специ­фическими участками ДНК, они активируют прилежащие гены. Другую группу составляют такие ферменты, как тимидинкиназа, рибонуклео- тидредуктаза, дигидрофолатредуктаза, тимидилат-синтаза, орнитинде- карбоксилаза, ДНК-полимеразы, топоизомеразы и ферменты, которые имеют непосредственное отношение к синтезу ДНК. Кроме того, усили­вается общий белковый синтез, поскольку при каждом цикле удвоения воспроизводятся все клеточные структуры.

Реализация митогенного сигнала. Результатом переноса мито­генного сигнала является реализация сложной программы клеточного деления.

Клеточный цикл. Клетки могут находиться в одном из трех состоя­ний — в цикле деления, в стадии покоя с сохранением возможности воз­врата в цикл и, наконец, в стадии терминальной дифференцировки, при которой способность к делению полностью утрачена. Образовывать опу­холи могут только те клетки, которые сохранили способность к делению.

Цикл удвоения разных клеток человека варьирует от 18 ч (клетки ко­стного мозга) до 450 ч (клетки крипт толстой кишки), в среднем — 24 ч. Митоз (М) и синтез ДНК (фаза S), между которыми выделяют 2 промежу­точных (gap) периода — G₁ и G₂, наиболее заметны; во время интерфазы (период между двумя делениями) клетка растет и готовится к митозу. В период фазы G₁ существует момент (так называемая точка рестрикции R), когда осуществляется выбор между вхождением в следующий цикл деления или переходом в стадию покоя G₀. Вхождение клетки в цикл де­ления — процесс вероятностный, определяемый сочетанием ряда усло­вий (внутренних и внешних); однако после того, как выбор сделан, по­следующие этапы совершаются автоматически. Хотя клетка может блокироваться на той или иной стадии цикла деления, обычно это может быть следствием каких-то особых обстоятельств.

Особенно важными в цикле являются моменты вхождения клетки в фазу синтеза ДНК (граница фаз G/S) и митоз (граница фаз G₂/M), где действуют своеобразные «контрольно-пропускные пункты» (checkpoints), которые проверяют в первом случае целость ДНК (ее готовность к репли­кации), а во втором — завершенность репликации. Клетки с поврежден­ной или недорепл ицированной ДНК блокируются на границе соответству­ющих фаз, что предотвращает возможность передачи потомству дефектов ее структуры в виде мутаций, делеций и иных нарушений. Некая система надзора, по-видимому, существующая в клетке, индуцирует систему ре­парации ДНК, после завершения которой продвижение клетки по циклу может быть продолжено. Альтернативой репарации является апоптоз, радикальным образом устраняющий опасность возникновения в организ­ме клона дефектных (потенциально опухолевых) клеток. Конкретный вы­бор зависит от множества условий, в том числе от индивидуальных осо­бенностей клетки.

Процесс репликации ДНК сложен и длителен (занимает несколько часов), поскольку весь генетический материал клетки должен быть вос­произведен абсолютно точно. При возникновении в нем каких-либо от­клонений клетка блокируется на подходе к митозу (на границе фаз G₂/M) и также может подвергнуться апоптозу. Защитное значение checkpoints трудно переоценить, поскольку их функциональные дефекты в конечном итоге имеют следствием и опухолевую трансформацию клетки и прогрес­сию уже сформировавшейся опухоли.

Циклические реакции. Существуют два семейства белков, «движу­щих» клеточный циклциклин(сусНп)-зависимые серин/треониновые протеинкиназы (Cdk, cyclin-dependent kinases) и сами циклины. Циклины регулируют активность Cdk и тем самым их способность модифициро­вать структуры-мишени, непосредственно участвующие в метаморфозах цикла. С их участием осуществляются такие важные этапы цикла, как де­зинтеграция ядерной мембраны, конденсация хроматина, формирование веретена и ряд других. Cdk активны только в комплексе с одним из цикли- нов. В связи с этим сборка и активация многочисленных комплексов Cdk- cyclin, а также их диссоциация — ключевые моменты клеточного цикла.

Как следует из их названия, циклины синтезируются и распадаются в строго определенные моменты цикла, различные для разных циклинов. Имеется три основных их класса: й^циклины, необходимые для прохож­дения GyS, S-циклины — для прохождения S-фазы и G₂ (или митотичес- кие) — циклины для вхождения в митоз. В клетках млекопитающих име­ется также несколько семейств Cdk, участвующих в разных регуляторных влияниях. Удаление того или иного циклина из внутриклеточной среды строго в определенный момент столь же важно, как и его появление (уст­ранение циклинов из внутриклеточной среды достигается как их дегра­дацией, так и блоком синтеза), например в митозе (на границе мета- и анафазы) в результате протеолиза один из циклинов быстро деградиру­ет; если же этого не происходит, то митоз не может завершиться и разде­ления дочерних клеток не происходит.

Продвижение в фазе S требует активации киназ Cdk2, Cdk4 и Cdk6, которые взаимодействуют с в^фазными циклинами (в частности, с cyclin D). Комплекс Cdc2 с первым й^фазным циклином индуцируеттранскрип- цию гена следующего циклина и т.д., продвигая клетки все дальше по цик­лу. Cdc2-cyclin D в самом начале замещается на Cdc2-cyclin Е, а тот в свою очередь — на Cdc2-cyclin А, активирующий аппарат синтеза ДНК. Когда клетка входит в S-фазу, й^циклины деградируют и появляются вновь лишь в фазе G₁ следующего цикла.

Контрольно-пропускные пункты (checkpoints — англ.). Любое стрессорное воздействие (например, отсутствие питательных веществ, гипоксия, особенно повреждение ДНК) блокирует движение'по циклу в одном из двух упомянутых выше контрольных пунктов (checkpoints). Во время этих остановок активируются механизмы надзора, способные:

• обнаружить повреждение ДНК;

• передать сигнал неблагополучия, блокирующий синтез ДНК или

митоз;

• активировать механизмы репарации ДНК.

Благодаря этому обеспечивается стабильность генома. Как упоми­налось выше, механизм контроля G/S блокирует репликацию ДНК и ак­тивирует процессы репарации (или индуцирует апоптоз), тогда как меха­низм контроля G₂/M запрещает митоз до завершения репликации Дефекты этих механизмов могут привести к появлению дочерних клеток с поврежденным геномом.

В механизме checkpoint участвуют комплексы Cdk-cyclin и ряд допол­нительных белков — Rb, р53 и другие. Их совокупность образует систему «тормозов», не позволяющих клетке делиться в отсутствие адекватных стимулов. Гены, кодирующие эти белки, называют генами-супрессора- ми. Особая значимость этой системы заключается в том, что раковая трансформация клетки становится возможной лишь после ее инактива­ции. В соматической клетке существуют по два аллеля каждого из генов, втом числе и генов-супрессоров, и, следовательно, для их инактивации необходимы два независимых события (например, делеция одного алле­ля и мутация другого). Именно по этой причине «спорадические» опухоли появляются относительно редко (вероятность возникновения в одной клетке нескольких независимых мутаций, причем поражающих один и тот же локус обеих хромосом, относительно невелика), а «семейные» чрез­вычайно часты (в «раковых» семействах один из двух наследуемых алле­лей того или иного гена-супрессора исходно дефектен). В последнем слу­чае система «тормозов» у всех клеток данного организма обеспечивается лишь одним нормальным аллелем, что резко снижает ее надежность и повышает риск возникновения опухоли. Именно это и происходит при наследственной ретинобластоме (делеция одного аллеля Rb) и других наследственных синдромах (делеция или повреждение одного аллеля р53 или других генов-супрессоров).

У клеток с дефектным или отсутствующим белком-супрессором р53 контрольный пункт GyS неполноценен. Это проявляется в том, что повреж­дения ДНК, индуцированные ионизирующей радиацией или каким-либо другим способом, не приводят ни к задержке клеток на границе фаз G 1 /S, ни к апоптозу. В результате в популяции накапливаются клетки с мно­жественными нарушениями структуры ДНК; появляется и со временем нарастает нестабильность генома, которая способствует возникновению новых клеточных клонов. Их естественный отбор лежит в основе опухоле­вой прогрессии — постоянного «дрейфа» опухоли ко все большей авто­номности и злокачественности.

Апоптоз (или программируемая клеточная гибель) — широко рас­пространенный биологический феномен клеточного «самоубийства», ко­торое индуцируется либо разнообразными внешними стимулами, либо неразрешимыми «внутренними» конфликтами (например, невозможнос­тью репарации повреждений ДНК). Роль апоптоза велика не только в фор­мообразовательных процессах во время эмбриогенеза (формирование органов, замена одних тканей другими, резорбция временных органов и т.д.), но и в поддержании тканевого гомеостаза во взрослом организме.

В регуляции тканевого гомеостаза гибель клетки выполняет функцию, комплементарную митозу. У опухолевых клеток программа гибели клеток в большинстве случаев блокирована, что вносит существенный вклад в увеличение массы опухоли.

Механизмы апоптоза. Принципиальное значение имеет тот факт, что механизмы апоптоза чрезвычайно консервативны и сохраняют свои основные закономерности у весьма далеких в эволюционном отношении организмов. Это обстоятельство позволило идентифицировать у млеко­питающих (в частности у человека) гены, гомологичные генам апоптоза у нематоды, — организма, у которого впервые была обнаружена и изучена генетическая система, управляющая этим процессом.

В результате у млекопитающих были идентифицированы гены се­мейства Вс1-2. Роль самого Вс1-2 и некоторых его гомологов — антиапоп- тическая (предотвращение гибели клеток), тогда как у других членов се­мейства, например Вах, — проапоптическая. Белки Вах и Вс1-2 способны к комплексообразованию друг с другом. В зависимости от относительно­го внутриклеточного содержания про- и антиапоптических белков реша­ется судьба данной клетки. Механизм действия белков семейства Вс1-2 не до конца ясен.

Большое функциональное значение имеет механизм апоптоза, ин­дуцируемого через специфические рецепторы CD95 (трансмембранный белок-рецептор размером 45 кДа, который при связывании со специфи­ческим лигандом или антителами передает сигнал к апоптозу) и TNF-R (tumor necrosis factor receptor, рецептор фактора некроза опухолей). Эти рецепторы, объединяемые сходством внеклеточных доменов, входят в состав большого семейства. Лигандами (молекулами, специфически вза­имодействующими с рецепторами TNF-R и CD95) являются соответствен­но TNF и CD95-L, которые представляют собой трансмембранные белки, но могут функционировать и в растворимой, «свободной» форме. Осо­бенно интересен, с онкологической точки зрения, TNF — цитокин, произ­водимый многими клетками (макрофагами, моноцитами, лимфоидными клетками, фибробластами) в ответ на воспаление, инфекцию и другие стрессорные воздействия. Он индуцирует широкий спектр иногда проти­воположных по направленности реакций, включая лихорадку, шок, некроз опухоли, анорексию; а также иммунорегуляторные сдвиги, клеточное раз­множение, дифференцировку и апоптоз. В этом случае апоптоз осуще­ствляется с участием специфической цистеиновой протеазы ICE, разру­шающей многие внутриклеточные белки-мишени. Гиперэкспрессия ICE в клетке вызывает апоптоз.