2 курс / Гистология / Компьютерная_видеомикроскопия_живых_клеток_Дромашко_С_Е_,_Квитко

гой, что обеспечивает удобство микроскопического анализа в динамике роста субкультур). СО2 добавляется в сосуды Карреля с помощью шприца (до 5% объема сосуда), сосуды герметически закупориваются, и клетки культивируются в камере инвертированного микроскопа при 37оС. В течение культивирования одни и те же участки ростовой поверхности фотографируются с помощью компьютерной видеосъемки с требуемыми интервалами времени (от одного до нескольких дней). Полученные компьютерные фотографии являются материалом для подсчета изменений количества клеток, а также соотношения стареющих (с ограниченной пролиферацией) и бессмертных клонов (в случае формирования компактных клонов у некоторых линий раковых клеток, например у линии рака легкого А549). Следовательно, предоставляется возможность изучения действия того или иного вещества на различные клеточные фракции, включая раковые стволовые клетки.

Рисунок 19 – Линия рака легкого А549: появление трехядерной клетки под воздействием 10 мгк/мл диазиквона

31

Перспективы широкого использования компьютерной видеомикроскопии живых клеток в фундаментальных и прикладных исследованиях во многом определяются все более полной автоматизацией как процесса компьютерной видеозаписи, так и обработки накопленных компьютерных имиджей. Говоря о перспективах развития этого метода в нашей стране, следует отметить, что сборка и поставка компьютерных видеокомплексов для исследований живых клеток выполняется ведущими фирмами нескольких стран (например, японской компанией Nikon Corporation) по специальным заказам. Цена полного комплекта составляет примерно 160 тысяч долларов. Самостоятельная сборка видеокомплекса потребителем из комплектующих и подбор подходящих компьютерных программ с целью уменьшения затрат не приводит к удовлетворительным результатам из-за многообразия имеющихся на рынке компонентов и необходимости их квалифицированного подбора. Например, данная видеокамера обеспечивает качественную видеозапись только в сочетании с определенными картами видеозахвата, но эта информация является «ноу хау» специализированных фирм. В результате эксплуатация закупленного за рубежом дорогого оборудования может оказаться неэффективной.

Комплектация и «подгонка» компонентов компьютерной видеосистемы для мониторинга живых клеточных культур – задача, которая может быть качественно выполнена только специализированными техническими организациями, способными при необходимости изготавливать дополнительные технические элементы и разрабатывать программное обеспечение для конкретных научных и прикладных задач. Нами совместно с НТЦ «Микроскопия» «КБТЭМ-ИТЦ», входящим в состав ГНПО «Планар» (головная организация), и лабораторией нанопроцессов и технологий Института тепло- и массообмена НАН Беларуси реализуется научно-технический проект по разработке, изготовлению и освоению в производстве автоматизированного видеокомплекса для мониторинга живых клеток «Цитомир», способного обеспечить многократное компьютерное фотографирование многих (до нескольких сотен) различных участков ростовой поверхности долговременных клеточных культур. Его ориентировочная цена составит 64 тысячи долларов.

Всостав автоматизированного видеокомплекса будут входить:

инвертированный микроскоп проходящего света с выходом изображения непосредственно на монитор персонального компьютера:

o	диапазон увеличения объекта на мониторе – от 50х до 400х;
o	диапазон перемещения автоматизированного предметного стола по

координатам X, Y: 140x100 мм;

o цветная видеокамера с разрешением не менее 2 МГПкс;

32

oвозможность многократного повторного фотографирования до 1000 участков объекта в течение месяца;

терморегулируемая камера с поддержанием температуры 37±0,2оС;

компьютер с источником бесперебойного питания;

пакет ПО для видеозаписи обработки микроскопических имиджей живых клеточных культур.

Контрольные вопросы

1.Что такое аутологичные клетки? Для чего они могут использоваться?

2.Как получают фолликулярные стволовые клетки?

3.Как используется компьютерная видеомикроскопия для изучения способности к дифференцировке линий клеток из фолликулов волос?

4.Что такое симметричная дифференцировка?

5.Для чего используется продукция in vitro эмбрионов?

6.В чем заключается модификация метода Хорисбергера для получения клеток гранулезы из фолликулов яичника крупного рогатого скота?

7.Как компьютерная видеомикроскопия используется для выявления способности ксенобиотиков оказывать цитопатические и генотоксические эффекты?

8.Каковы перспективы широкого использования компьютерной видеомикроскопии живых клеток в фундаментальных и прикладных исследованиях?

ЗАДАНИЯ ДЛЯ САМОПОДГОТОВКИ

1.Проанализировать существующие методы компьютерной видеомикроскопии.

2.Подготовить реферат на тему «Клеточное старение и лимит Хайфли-

ка».

3.Проанализировать взаимосвязь изменений клеточного фенотипа с процессами старения и трансформации.

4.Проанализировать литературу в PubMed по клеточному старению.

5.Подготовить реферат на тему «Получение и использование иммортализированных линий клеток».

6.Подготовить электронную презентацию на тему «Немитотическое образование трансформированных клеток».

7.Подготовить реферат на тему «Физиологические и молекулярные маркеры старения».

33

8.Подготовить электронную презентацию на тему «Клеточные культуры в медицинской трансплантологии».

9.Проанализировать литературу по использованию клеточных технологий в животноводстве.

10.Охарактеризовать особенности использования клеточных культур для токсикологического тестирования ксенобиотиков.

СЛОВАРЬ ОСНОВНЫХ ТЕРМИНОВ И ПОНЯТИЙ

Апоптоз – программируемая клеточная гибель

Аутологичные клетки – собственные клетки организма

Ген бета-галактозидазы – ген, активно экспрессирующийся в стареющих клетках некоторых тканей, маркер клеточного старения

Генотоксические эффекты – повреждения ДНК

Клетки гранулезы – клетки внутренних стенок и полости фолликула яичника

Диазиквон (AZQ) – противоопухолевый препарат, относящийся к классу хинонов

Иммортализированная клеточная линия – потенциально бессмертная линия клеток, способная к неограниченному во времени культивированию

Инвертированный микроскоп – микроскоп с обращенной оптической системой, позволяющей наблюдать объекты значительной толщины, включая посуду для культивирования клеток

Карциногенез – совокупность процессов, приводящих к возникновению и пролиферации раковых клеток

Клазматоз – отделение участков цитоплазмы от клетки

Лимит Хайфлика – максимальное количество удвоений популяции стареющих клеток

34

Неозис – гипотетический процесс возникновения иммортализированных (включая раковые) клеток при немитотическом делении постаревших полиплоидных клеток

Рекомбинантные белки – белки, произведенные с помощью генноинженерных технологий

Сенесенс – старение, (транслитерация англ. Senescence)

Цитопатические эффекты – разрушение и функциональная патология клеток

ЛИТЕРАТУРА

*Квитко, О.В., Шейко, Я.И., Конева, И.И., Мезен, Н.И., Тюриков, А.П.

Исследование причин различной предрасположенности к раковой трансформации клеток человека и мыши / О.В.Квитко [и др.] // Известия НАН Беларуси, сер. биол. наук.– 2002, № 2. – С. 61–64.

*Квитко, О.В., Шейко, Я.И., Конева, И.И. Анализ неограниченной пролиферации иммортализированной линии клеток с помощью прижизненной микроскопии / О.В.Квитко [и др.] // Доклады НАН Беларуси. – 2005. – Т.49, № 5. – С. 89–93.

*Шейко, Я.И., Квитко, О.В., Конева, И.И., Тюриков, А.П. Анализ пролиферации и дифференцировки нормальных (стареющих) фибробластов человека и мыши с помощью прижизненной видеомикроскопии / Я.И.Шейко [и др.] // Доклады НАН Беларуси.– 2002. – Т. 46, № 1. – С. 90–94.

*Bayreuther, K., Francz, P.I., Gogol, J., Hapke, C., Maier, M., Meinrath, H.G. Differentiation of primary and secondary fibroblasts in cell culture systems / K. Bayreuther [e. a.] // Mutation Research. – 1991. – Vol. 256, № 2–6. – P. 233– 242.

*Dimri, G.P., Lee, X., Basile, G., Acosta, M., Scott, G., Roskelley, C., Medrano, E.E., Linskens, M., Rubelj, I., Pereira-Smith, O. e.a. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo / G.P. Dimri [e. a.] // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1995. – Vol. 92. – P. 9363–9367.

*Hayflick, L., Moorhead, P.S. The serial cultivation of human diploid cell strains / L.Hayflick [e. a.] // Exp. Cell. Res. – 1961. – Vol. 25. – P. 177–185.

*Hong Yu, Dong Fang, Kumar, S.M., Ling Li, Nguyen, T.K., Acs, G., Herlyn, M., Xiaowei Xu. Isolation of a novel population of multipotent adult stem cells from human hair follicles / Hong Yu [e. a.] // American Journal of Pathology. – 2006. – Vol. 168. – P. 1879–1888.

35

*Horisberger, M. A method for prolonged survival of primary cell lines / M.Horisberger // In Vitro Cellular and Developmental Biology. – 2006. – Vol. 42,

№5–6. – P. 143–148.

*Gho, C.G., Braun, J.E., Tilli, C.M., Neumann, H.A., Ramaekers, F.C. Human follicular stem cells: their presence in plucked hair and follicular cell culture / C.G.Gho [e. a.] // Br. J. Dermatol. – 2004. – Vol. 150. – P. 860–868.

*Langhout, D.J., Spice, L.J., Geisert, R.D. Development of a culture system for bovine granulose cells: effects of growth hormone, estradiol, and gonadotropins on cell proliferation, steroidogenesis, and protein synthesis / D.J.Langhout [e. a.] // J. Anim. Sсi. – 1991. – Vol. 6. – P. 3321–3334.

*Simons, J.W. Genetic, epigenetic, dysgenetic, and non–genetic mechanisms in tumorigenesis / J.W.Simons // Critical Reviews in Oncogenesis. – 1995. – Vol. 6, № 3–6. – P. 261–273.

*Sundaram, M., Guernsey, D.L., Rajaraman, M.M., Rajaraman, R. Neosis: a novel type of cell division in cancer / M.Sundaram [e. a.] // Cancer Biol. Ther. – 2004. – Vol. 3, № 2. – P. 207–218.

**Квитко, О.В., Жукова, Л.Н., Конева, И.И. Антираковый эффект экзогенных нуклеиновых кислот / О.В.Квитко [и др.] // Доклады АН Беларуси. – 1992. – Т. 36, № 7–8. – С. 652–655.

**Квитко, О.В., Шейко, Я.И., Конева, И.И., Анисович, М.В. Активность бета–галактозидазы в стареющей и иммортализированной клеточных популяциях / О.В.Квитко [и др.] // Известия НАН Беларуси, сер. биол. наук. – 2006,

№4. – С. 53–57.

**Квитко, О.В., Шейко, Я.И., Конева, И.И., Дромашко, С.Е. Разработка клеточных тест–систем для создания полинуклеотидных антираковых препаратов / О.В.Квитко [и др.] // Молекулярная и прикладная генетика. – 2008. – Т. 7. – С. 18–24.

**Конева, И.И., Войтович, А.М., Наджарян, Л.А., Афонин, В.Ю., Коте-

ленец, А.И., Квитко, О.В. Эпибрассинолид модифицирует пролиферацию и апоптоз эмбриональных фибробластов / И.И.Конева [и др.] // Новости меди- ко–биологических наук. – 2005. – № 2. – С. 112–117.

**Bahnson, A., Athanassiou, C., Koebler, D., Shun, T., Shields, D., Yu, H., Wang, H., Goff, J., Cheng, T., Houck, R., Cowsert, L. Automated measurement of cell motility and proliferation / A.Bahnson [e. a.] // BMC Cell Biol. – 2005. – Vol. 6. – P. 19.

**Cremisi, C., Duprey, P. Spontaneous differentiation of murine teratocar-

cinoma stem cells at low temperature / C.Cremisi [e. a.] // J. Cell Physiol. – 1986.

–Vol. 129. – P. 230–236.

**Hayflick, L. Aging under glass / L.Hayflick // Mutation Research. – 1991.

–Vol. 256. – P. 69–80.

36

**Kumar, N., Gammell, P., Meleady, P., Henry, M., Clynes, M. Differential protein expression following low temperature culture of suspension CHO–K1 cells

/N.Kumar [e. a.] // BMC Biotechnol. – 2008. – Vol. 8. – P. 42.

**Kvitko, O.V., Koneva, I.I., Sheiko, Y.I., Anisovich, M.V. Hunting the mechanisms of self–renewal of immortal cell populations by means of real–time imaging of living cells / O.V.Kvitko [e. a.] // Cell Biology International. – 2005. – Vol. 29. – P. 1019–1024.

**Zwaka, T.P., Thomson, J.A. Differentiation of human embryonic stem cells occurs through symmetric cell division / T.P. Zwaka [e. a.] // Stem Cells. – 2005. – Vol. 23. – P. 146–149.

***http://labmcp.at.tut.by/

***http://www.medicine.dal.ca/rajaraman/

***http://www.confocal.ru/

***http://www.informnauka.ru/scicafe/scicafe081020.shtml

Условные обозначения:

*основная литература;

**дополнительная литература;

***интернет-сайты.

37

Учебное издание

Дромашко Сергей Евгеньевич, Квитко Олег Викторович, Конева Ирина Ивановна и др.

КОМПЬЮТЕРНАЯ ВИДЕОМИКРОСКОПИЯ ЖИВЫХ КЛЕТОК

Учебно-методическое пособие

Редактор-корректор А. А. Сычѐв Компьютерная верстка С. Е. Дромашко

Подписано в печать 20.05. 2010. Формат	60х80 1/16 Бумага офсетная. Гарнитура Таймс.
Печать цифровая. Усл. печ. л.	2,1 Уч.-изд. л. 1,55 Тираж 100 экз. Заказ 226.

ГУО «Институт подготовки научных кадров Национальной академии наук Беларуси» ЛИ №02330/0552815 от 17.02.2010.

Ул. Кнорина, 1, 220049, г. Минск.

Типография РУП «Научно-практический центр Национальной академии наук Беларуси по механизации сельского хозяйства»

ЛП № 02330/0150026 от 10.05.2007. Ул. Кнорина, 1, корп. 3, 220049, г. Минск.