2 курс / Гистология / РУКОВОДСТВО_ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ_ММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ_МЕТОДЫ

Глава 21	Устранение неисправностей

Реагент

	№6	Ткань отрицательного контроля:
	Препарат
		протокол окраски выполнен
		полностью.

НЕТ ОКРАШИВАНИЯ.

ПЕРЕХОД К СЛЕДУЮЩЕМУ ПУНКТУ

Результат/Действие

Коричневое/красное окрашивание в ткани отри-

цательного контроля:

Моноклональные антитела: возможное загрязнение.

Поликлональные антитела: возможное загрязнение или нежелательные антитела в фракции Ig донора.

Может появиться липофусцин – артефакт температурной демаскировки антигенов, пылевидное окрашивание – в печени, тканях сердца, или как специфическое окрашивание срезов поджелудочной железы.

Фоновое окрашивание при использовании щелочной фосфатазы

Реагент

Результат/Действие

	№1		Ткань положительного контроля:
	Препарат
			Fast Red, Fuchsin или BCIP/
			NBT+докрашивание
			НЕТ ОКРАШИВАНИЯ.
		ПЕРЕХОД К СЛЕДУЮЩЕМУ ПУНКТУ

Коричневый/красный цвет:

Указывает на эндогенную активность щелочной фосфатазы в ткани. Обнаруживается в печени, почках, желудочно-кишечном тракте, костях, мочевом пузыре, яичнике, слюнной железе, плаценте, лейкимических, некротизированных или поврежденных клетках.

Блокировать левамизолем (при обработки тонкой кишки, может потребоваться предварительная обработка 0,03 N HCl перед добавлением щелочной фосфатазы).

	№2		Ткань положительного контроля:
	Препарат
			стрептовидин-АР + Fast Red, Fuchsin
			или BCIP/NBT + докрашивание
			НЕТ ОКРАШИВАНИЯ.
		ПЕРЕХОД К СЛЕДУЮЩЕМУ ПУНКТУ

Коричневый/красный цвет:

Указывает на эндогенную активность биотина в ткани. Биотин, связанный с белками, можно обнаружить в надпочечниках, печени, почках, желудочно-кишечном тракте, легком, селезенке, мозге, молочной железе, жировой ткани, лимфоидной ткани и культурах клеток, выращенных на биотине (RPMI, NCTC, MEME).

Блокируйте активность эндогенного биотина или поменяйте метод окраски на независящий от реакции биотин/стрептовидин.

ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ | 209

Устранение неисправностей

Реагент

	№3		Ткань положительного контроля:
	Препарат		биотиновый блок (если требуется)
			+ вторичные антитела +
			Стрептовидин-АР + Fast Red, Fuchsin
			или BCIP/NBT + докрашивание
			НЕТ ОКРАШИВАНИЯ.
		ПЕРЕХОД К СЛЕДУЮЩЕМУ ПУНКТУ

			Ткань положительного контроля:
	№4
			биотиновый блок (если требу-
	Препарат		ется) + реагенты отрицательного
			контроля+ вторичные антитела +
			Стрептовидин-АР + Fast Red, Fuchsin
			или BCIP/NBT + докрашивание
			НЕТ ОКРАШИВАНИЯ.
		ПЕРЕХОД К СЛЕДУЮЩЕМУ ПУНКТУ

	№5
	Препарат		Ткань положительного контроля:
			протокол окраски выполнен полностью.
			НЕТ ОКРАШИВАНИЯ.
		ПЕРЕХОД К СЛЕДУЮЩЕМУ ПУНКТУ

210 | ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

Глава 21

Результат/Действие

Коричневый/красный цвет:

Указывает на неспецифическое или нежелательное связывание вторичных антител с антигенами ткани. Первично возникает, если вторичные антитела не приготовлены к использованию на специфических образцах ткани (например, биотинизированные антитела в богатых биотином тканях).

Для решения этой проблемы абсорбируйте неспецифические антитела, добавлением 2,5 – 10,0 мкл нормальной сыворотки (того же животного, которое окрашивается) на 100 мкл вторичных антител.

Коричневый/красный цвет:

Может свидетельствовать о неспецифическом связывании белков-переносчиков первичных антител. Приготовьте протеиновый блок из нормальной сыворотки животного-донора меченных антител добавьте 0,05-0,1% TWEEN 20 к промывочному буферу чтобы снизить взаимодействие белков.

Может появиться липофусцин – артефакт температурной демаскировки антигенов, пылевидное окрашивание – в печени, тканях сердца, или как специфическое окрашивание срезов поджелудочной железы.

Коричневое/красное окрашивание в ткани отри-

цательного контроля:

Моноклональные антитела: возможное загрязнение.

Поликлональные антитела: возможное загрязнение или нежелательные антитела в фракции Ig донора.

Может появиться липофусцин – артефакт температурной демаскировки антигенов, пылевидное окрашивание – в печени, тканях сердца, или как специфическое окрашивание срезов поджелудочной железы.

Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/

Глава 21	Устранение неисправностей

Реагенты отрицательного контроля

Реагент

Результат/Действие

Ткань отрицательного контроля: протокол окраски полностью

выполнен.

Красное/синее окрашивание:

(человеческие ткани) приготовьте протокол пероксидазного блока с препарата №2 «фоновое окрашивание, полученное с использованием пероксидазы».

Приготовьте биотиновый блок, если требуется, протеиновый блок, если требуется, приготовьте соответствующие реагенты отрицательного контроля (смотрите ниже), используйте биотинизированные вторичный антитела, используйте стрептовидин/HRP и DAB.

Приготовьте реагенты отрицательного контроля

•Поликлональные: неиммунизированную сыворотку того же животного, разведите до тех же концентраций белка, что и первичные антитела.

•Моноклональные: реагенты отрицательного контроля, того же изотипа, что и первичные антитела. Растворитель, используемый производителем моноклональных первичных антител и отрицательный контроль должен содержать те же ионы. Растворители, содержащие ионы натрия или фосфора, могут изменить чувствительность некоторых моноклональных антител.

•Подсчет:

• Ig или общая концентрация белка первичных антител зависит от фактора разведения первичных антител .

• Ig или общая концентрация белка реагентов отрицательного контроля зависит от фактора разведения реагентов отрицательного контроля.

ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ | 211

Устранение неисправностей	Глава 21

Третий раздел

Образец ткани

В таблице ниже записаны, образцы тканей каких животных были использованы, метод забора материала, способ фиксации ткани.

Образцы:

Орган/поверхность ткани:

Забор материала:

Хирургический метод/биопсия

Посмертный образец

Тонкоигольная биопсия

Периферическая кровь (включая анти-коагулянты)

Браш-биопсия

Биологические жидкости

Культуры клеток

Другое

Обработка тканей:

Заливка в парафин

Заливка в полимерные среды

Замороженный срез

Цито-центрифуга

Мазок клеток

Монослой культуры клеток

Другое

Метод фиксации:

Тип фиксации

Продолжительность фиксации

Размер кусочка

Заливка ткани:

Заливочная среда

Толщина ткани

Желатин, коммерческие адгезивные клеи или крахмал в водяной бане

Другое

212 | ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/

Глава 21	Устранение неисправностей

Блокирование эндогенных ферментов

Фоновое окрашивание определяется как неожиданное или нежелательное окрашивание в

контрольном образце, которое не затрагивает таргетную зону антигена. Частой причиной фонового окрашивания является активность эндогенных ферментов и биотина.

Пероксидаза – фермент окислительно-восстановительного ряда, который взаимодействует с субстратом, содержащим перекись водорода, как акцептор электронов. Чтобы блокировать ее активность, клетки можно обработать реагентами, содержащими перекись водорода.

Щелочная фосфатаза – фермент, встречающийся в разных изоформах, продуцируемый лейкоцитами, печенью, костями, тонкой кишкой, плацентой и Regan (карциномой). Добавление левамизоля к хромогену/субстрату ингибирует активность эндогенной щелочной фосфатазы, за исключением изоформы тонкой кишки. При необходимости ее можно блокировать раствором слабой кислоты, например, 0,03-0,05 N HCl.

Биотин, витамин В, может быть связан с белками ткани и может мешать правильной интерпретации окраски при использовании стрептовидина или биотина. Биотин/авидин блок разрушит это связывание.

Пероксидазный блок:

3% H2O2

Метанол/ H2O2

Азид натрия

Пероксидазный блок (S2001)

Другое

Блокирование щелочной фосфатазы:

Левамизоль

0,03 N HCl (не использовать на замороженных тканей)

Другое

Блокирование биотина:

Биотиновый блок (Х0590)

Другое

Протеиновый блок:

Протеиновый блок (Х0909)

Нормальная сыворотка животного-донора вторичных антител

Другое

ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ | 213

Устранение неисправностей	Глава 21

Четвертый раздел

Использование стандартных инструкций к IVD антителам

Информация,
которую вам		Информация, содержащаяся в инструкции		Комментарий
необходимо
знать
Область		Использование по назначению/ограниченное		Означает, что продукт удовлетворяет
применения		применение		требования FDA, как диагностический. Так
первичных		Только для диагностики in vitro		же, как значок CE свидетельствует о том,
антител				что продукт удовлетворяет требованиям
				Европейского Союза.
Обработка		Обработка кусочка		Указывает на тип ткани, использованной на
ткани		Парафиновые срезы: антитела могут приме-		этапе разработки антител (при валидации).
				Во многих случаях это ткани, фиксиро-
		няться на тканях, фиксированных в форма-
				ванные формалином, и замороженные срезы.
		лине, залитых в парафин. Рекомендована
				Использование других фиксаторов требует
		температурная демаскировка тканей.
				валдидации каждой лабораторией.
		Оптимальный результат получается при
		работе с 10 ммоль/л цитраным буфером, рН		В этом разделе также указывается опти-
		6,0. Использование 10 ммоль/л TRIS буфера,
				мальный способ демаскировки антигенов
		1 ммоль/л EDTA, рН 9,0 также допустимо.
				и предостережения от процедур, которые
		Ткань не должна высыхать во время темпе-
				могут разрушить эпитопы антигенов.
		ратурной обработки и последующей проце-
				Периодически процедуры подготовки и
		дуры иммуногистохимического окрашивания.
				окраски ткани изменяются, что отражает
		Замороженные срезы и цитологические
				изменения в технологии окрашивания. В
		препараты: антитела можно использовать
				связи с этим уместно сохранять копии всех
		на криосрезах или фиксированных цитоло-
				версий инструкций к реактивам. Номера
		гических мазках.
				инструкций обычно пропечатаны на каждой
				странице.
Выбор		Процедура окраски		Указывает рекомендуемую систему визуа-
системы визу-		Визуализация: эти антитела можно исполь-		лизации для данных антител.
ализации		зовать для окраски ткани иммуноперок-		Также в этом разделе прописано, можно ли
		сидазным методом. Следуйте инструкции,
				использовать антитела в автостейнере.
		прилагаемой к выбранному набору для визу-
				ВНИМАНИЕ: в том случае, если Вам нужен
		ализации.
				документ, подтверждающий возможность
		Автоматизация: антитела подходят для
				использования антител в автостейнере, а
		иммуногистохимического окрашивания с
				в инструкции это не прописано, вы можете
		применением автостейнеров.
				связаться с группой технической поддержки
				производителя для получения подробной
				информации.
Разведение		Процедура окраски		Указывает диапазон разведений антител и
первичных		Разведение: при окраске срезов с парафи-		рекомендованный растворитель.
антител
		новых блоков, фиксированных формалином		Указанный диапазон разведений – лишь
		тканей миндалины, моноклональные мышиные
				стартовая позиция для поиска оптимальной
		анти-виментиновые антитела можно использо-
				концентрации в каждой лаборатории.
		вать в разведении 1:50 – 1:100.
				Оптимальные условия могут изменяться в
				зависимости от образца, способа обработки
				ткани, температуры в лаборатории или авто-
				матизации процесса.

214 | ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/

Глава 21		Устранение неисправностей
Информация,
которую вам	Информация, содержащаяся в инструкции	Комментарий
необходимо
знать
Реагенты	Поставляемые реагенты	Использование реагентов отрицатель-
отрицатель-	Изотип IgG1 kappa.	ного контроля рекомендовано College of
ного контроля		American Pathologists (CAP), основанием для
	Процедура окраски
		этого стали Clinical Laboratory Improvement
	Рекомендованный отрицательный контроль
		Amendments (CLIA 2003) для каждого паци-
	– моноклональный мышиный IgG в той же
		ента или блока ткани в процедуре окраски.
	концентрации, что и первичные антитела.
	Положительный и отрицательный контроль
	необходимо ставить одновременно с исследу-
	емым образцом.
Ткань положи-	Характеристика производителя:	CLIA 2003 Sec. 493.1273 (3)
тельного	Нормальная ткань: большинство человеческих	Требует проверки соответствующего поло-
контроля
	тканей мезенхимального происхождения метятся	жительного и отрицательного окрашивания
	антителами, включая фиброциты, адипоциты,	иммуногистохимическими и флуоресцент-
	клетки гладной мускулатуры, экдотелий сосудов,	ными красителями тканей положительного
	астроциты, клетки периферической нервной	и отрицательного контролей при каждом
	системы клетки Swann, макрофаги (в том числе	использовании красителя.
	и клетки Kupfer), также миоэпителий слюнных,	В большинстве инструкций к IVD антителам
	потовых желез, молочной железы ярко окраши-
		перечислены ткани, дающие положительное
	ваются. Также положительны, показывая разную
		и отрицательное окрашивание при опреде-
	интенсивность и распределение метки, клетки
		лении технических характеристик антител.
	фолликулов щитовидной железы, коры надпо-
		ВНИМАНИЕ: нездоровая ткань не обяза-
	чечников, дистальные канальца почек, мезан-
		тельного прореагирует с антителами.
	гиальные и эндотелиальные клетки почечных
		Образцы ткани отрицательного и положи-
	клубочков, клетки подлелудочной железы [1,
		тельного контроля должны подвергаться
	2]. В человеческом глазу антителами метится
		той же обработке (фиксация, заливки,
	пигментированный задний и передний эпителий
		монтирование среза, сушка, восстанов-
	радужки, включая мышечную порцию (расши-
		ление эпитопов, окраска по протоколу IHC)
	ритель зрачка) переднего эпителия, кроме
		что и исследуемый образец.
	того, непигментированный и пигментированный
	цилиарный эпителий [4]. В цилиарном эпителии
	экспрессируются цитокератин и виментин [4].
	Ненормальная ткань: Антитела метят проме-
	жуточные филаменты в 17/20 саркомах, 16/18
	меланомах, 3/3 шванномах. Кроме того, поло-
	жительный результат реакции с этими анти-
	телами отмечен среди различного количества
	карцином (от 10 до 57%), нейроэндокрийных
	карцином, нейробластом, тимом и мезотелиом.
	При подозрении на нейробластому, проводили
	дополнительное окрашивание виментином и
	цитокератином. Среди аденокарцином, более
	50% папиллярных опухолей щитовидной железы,
	почек, эндометрия, яичников и легких экспрес-
	сировали виментина, кератины.
Ткань отрица-	Характеристика производителя:
тельного	Нормальная ткань: клетки скелетной и
контроля
	сердечной мышцы, эпидермиса, уротелия,
	плоского эпителия, слизистой оболочки
	толстой кишки и желудка, так же как и
	нейроны в равной степени не реагируют с
	антителами.

ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ | 215

Устранение неисправностей	Глава 21

Литература:

1.Wood G, et al. Suppression of Endogenous AvidinBinding Activity in Tissues and Its Relevance to BiotinAvidin Detection Systems // Journal of Histochemistry and Cytochemistry. – 2981. – 29. – p. 1196-204.

2.Sayaki H, et al. Azure B as a Counterstain in the Immunohistochemical Evaluation of Heavily Pigmented Nevomelanocytic Lesions // Applied Immunohistochemistry. – 1995. – 3. – p. 268-71.

3.Federal Register: January 24. – 2003. –68. – 42CFR.

– 493.

4.College of American Pathology. Anatomic Pathology Checklist. – October 2005.

216 | ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/

Словарь

Мы не стремились собрать в этом словаре все термины, использованные и издании. Скорее, здесь приведены базовые понятия, необходимые для лучшего понимания данного руководства.

Агглютинация – склеивание и выпадение в осадок клеток, равномерно распределенных в жидкости. Причина агглютинации – агглютинины – антитела к специфическим клеткам, явление

наблюдается при обработке колонии бактерий иммунизированной от этого вида микроорганизмов сывороткой или при обработки взвеси клеток, например эритроцитов, антисывороткой. При добавлении к цельной крови специфических антител из сыворотки донора, реакция агглютинации эритроцитов позволяет определить группу крови.

Адъювант – в иммунологии, любое вещество или комплекс веществ, используемое для усиления иммунного ответа. Существует два типа: позволяющие увеличить как клеточный, так и гуморальный иммунитет (общее потенциирование) и усиливающие ответ только на определенные антигены (специфическое потенциирование). Адъюванты работают по нескольким механизмам: увеличение времени высвобождения антигена, улучшение иммуногенности путем денатурации антигенов, привлечением иммунокомпетентых клеток и увеличением воспаления.

Алгоритм – перечень правил, позволяющих решить некоторые проблемы с изображением.

Анализ изображения – получение значимой информации из изображения.

Антиген – молекула, способная связаться с антителом.

Антигенная детерминанта – см. Эпитоп.

Антисыворотка (иммунная сыворотка) – сыворотка, содержащая антитела.

Асцит или асцитическая жидкость – скопление жидкости в брюшной полости.

Афинная адсорбция – метод разделения с помощью афинной хроматографии. Можно использовать, например, для удаления нежелательных антител при их изготовлении. Первичная смесь антител пропускается через колонку с матрицей, содержащей антитела к нежелательным антителам. Таким образом, примеси антител остаются на колонке, на выходе имеем раствор антител, очищенный методом аффинной адсорбции.

Афинная изоляция – метод разделения смеси с помощью афинной хроматографии. Например,

антитела, осевшие на колонке после процедуры афинной адсорбции, можно выделить из связи с антигеном при помощи специальных разделителей.

Виртуальный препарат – цифровое изображение препарата.

Внутренний тканевой контроль – образец ткани пациента, содержащей целевые антигены не только в опухолевых структурах, но и в неизмененной ткани. Таким образом, можно обойтись без положительного контроля.

ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ | 217

Словарь

Вторичные антитела – вторые антитела, использующиеся в процессе окраски; реагируют с первичными антителами, являющимися для них антигенами, и формируют мостики между первичными антителами и последующими реагентами, если таковые имеются. Еще называются «меченными антителами».

Гибридизация in situ – исследование нуклеиновых кислот «на месте» в фиксированной ткани путем температурной обработки срезов, обратного отжига специфических DNA, RNA или PNA праймеров.

Гипериммунизация – укрепление и усиление активности иммунной системы путем повторного введения антигена.

Демаскировка антигенов – син. демаскировка эпитопов, восстановление антигенных свойств (иммунореактивности) иммуногена.

Дихроичное зеркало – обладает способностью отражать свет только определенного цвета. Система из нескольких дихроичных зеркал позволяет разбить световой поток на три основных составляющих: красный, зеленый и синий.

Докрашивание – контрастирующее окрашивание.

Идиотип – традиционно, антигенная детерминанта, относящаяся к определенному антителу. Идиотипная структура нескольких групп аминокислот в гипервариабельном регионе легких и тяжелых цепей предположительно обеспечивает антигенные свойства молекулы антитела и, как следствие, высокий уровень специфичности. Однако, иммунная сыворотка с антителами к этим детерминанам обладает перекрестной реактивностью с другими молекулами антитела. Термин идиотип до сих пор не определен.

Иммуноген – любое вещество, способное вызвать иммунный ответ, в отличие от любых субстанций, которые связываются с антителом (то есть антиген).

Иммуногенность – возможность иммуногена запускать иммунную реакцию. Иммуногенность зависит от чужеродности в отношении организма хозяина, размеров сложности его молекулярной структуры, продолжительности воздействия и возможности быстро активировать иммунореактивные клетки с формированием иммунного ответа.

Иммуногистохимия – применение иммунохимии к тканям и клеткам (часто термин используется для обозначения и иммуноцитохимии).

Иммунохимия – раздел иммунологии, изучающий химические вещества и реакции иммунной системы, специфические взаимоотношения антител и антигенов.

Иммуноцитохимия – применение иммунохимии к клеточным образцам.

218 | ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/