2 курс / Микробиология 1 кафедра / Доп. материалы / Инфекции_в_акушерстве_и_гинекологии_Чайка_В_К_

—--- ---------------------------	Глава 3 ---------------------------------	—
	Сифилис

Для установления диагноза сифилиса используют как бактериоскопическое, так и серологическое исследование крови.

Наиболее убедительным доказательством трепонемной природы заболевания является прямая визуализация трепонемы. При первичном сифилисе на бледную трепонему исследуют отделяемое эрозивноязвенных папулезных элементов в области половых органов, полости рта, в пунктате из регионарных лимфатических узлов. При вторичном сифилисе используется материал из различных поражений кожи и слизистых оболочек. Для диагностики врожденного сифилиса может быть использована амниотическая жидкость. При отрицательных результатах микроскопическое исследование повторяют либо до обнаружения бледной трепонемы, либо до подтверждения диагноза результатами серологического исследования. В последнее время для обнаружения ДНК бледной трепонемы применяют ПЦР.

Серологические исследования крови основаны на определении антител, которые вырабатываются при сифилисе и классифицированы как неспецифические и специфические антитела против трепонем.

Специфические антитела против трепонем вырабатываются в ответ на инфекцию, вызываемую трепонемами. Как и при других инфекциях, вначале появляются антитела класса IgM, а затем — IgG-антитела. IgMантитела можно выявить у пациентов с первичным, вторичным или врожденным сифилисом, а также при реинфекции. В целом титры IgMантител снижаются после лечения, однако скорость снижения зависит от стадии болезни, при которой проводилось лечение; антитела снижаются быстрее после ранее начатого лечения. При позднем или неполном лечении антитела могут персистировать в течение длительного периода.

Образование IgG-антител следует за выработкой IgM-антител и обычно достигает более высокого уровня. Хотя титры IgG-антител могут со временем снижаться, они персистируют в течение всей жизни пациента даже при адекватном лечении.

Неспецифические антитела против трепонем включают антитела против группового антигена и кардиолипина (антилипидные антитела). Антилипидные антитела выявляются на ранних стадиях течения инфекции и достигают высоких уровней к началу вторичного периода. После проведенного лечения титры антител снижаются до уровня, который зависит от стадии, при которой бы-

61

-------------------------------- Глава 3 ----------------------------------

ло начато лечение. Данные уровни могут снижаться по мере прогрессирования инфекции до поздней стадии (даже при отсутствии терапии). Реинфекция приводит к увеличению титров антител.

Существует множество тестов для количественной оценки антител против липидов. Тесты фиксации комплемента (например, реакция Вассермана) в настоящее время в мире применяются очень редко, так как они не имеют преимуществ по сравнению с современными тестами флоккуляции, тестом Venereae Disease Research Laboratory (VDRL) или экспресс-тестом, основанным на микропреципитации с кардиолипиновым антигеном с плазмой крови (RPR), которые более простые, быстрые, а также дешевле в исполнении.

Скрининговые и подтверждающие тесты на сифилис представлены в таблице 3.1. Серологический скрининг проводится с помощью анализа крови, взятого в первый визит пациентки, с применением стандартных тестов — нетрепонемных, таких как VDRL (Veneral Disease Research Laboratory) или RPR (Rapid Plasma Reagin). Эти тесты обнаруживают нетрепонемные антитела и являются неспецифическими, поэтому все положительные или сомнительные результаты должны быть подтверждены с помощью специфических трепонемных тестов, таких как тест иммобилизации Treponema pallidum (Treponemapallidum immobilization test — TPI) и реакция иммунофлюоресценции-абсорбции

(FTA-ABS — fluorescent treponemal antibody absorption).

После того, как получен первичный положительный результат какоголибо теста по определению антилипидных антител, необходимо определить титры этих антител. Данные тесты обладают ограниченной специфичностью, но они пригодны для диагностики трепонемной инфекции, поскольку дают положительный результат в начальной стадии и являются достоверными маркерами активности инфекционного процесса.

Достоверным способом оценки активности болезни является тест на IgM-антитела.

Кардиолипины широко распространены в природе, поэтому антилипидные антитела не являются специфическими при трепонемной инфекции: позитивные результаты могут наблюдаться при других заболеваниях, а иногда и у здоровых людей.

В 1982 году Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) рекомендовала применение двух тестов для скрининга на сифилис. Один из них предназначался для обнаружения липидного (VDRL), а второй — трепонемного антигена (RPR). Данная комбинация представляет собой оптимальный способ выявления всех стадий трепонемной инфекции — как леченной, так и не леченной. В то

62

------------------------- Глава 3 ----------------------------

Таблица 3.1. Серологические тесты, применяемые для диагностики и эффективности лечения сифилиса

Тест	Тип теста	Клиническое
		применение
Rapid plasma regain	Нетрепонемный (неспе-	Диагноз активности,
(RPR)	цифический). Карточный	применяется в скрининге и
	тест Rapid plasma regain «на	для диагностики активности
	месте». Макроскопический	заболевания.
	тест, может быть	Количественный.
	использован в клиниках.	Успешность лечения/ре-
	Недорогой	инфекция
Veneral Disease	Нетрепонемный (неспе-	Диагноз активности,
Research Laboratory	цифический). Не является	применяется в скрининге и
(VDRL)	тестом «на месте».	для диагностики активности
	Более чувствительный, так	заболевания.
	как микроскопиро-вание	Количественный.
	позволяет определить	Успешность лечения /ре-
	флоккуляцию. Должен быть	инфекция
	проведен в лаборатории
Тест микроагглю-	Трепонемный.	Исключает ложнополо-
тинации Т.pallidum	Специфический.	жительные результаты
(MHA-TP)	Не является тестом « на	нетрепонемных тестов
	месте».	«serofast» (+ на протя-
	Дорогой	жении жизни).
		Качественный тест
Флюоресцентный	Трепонемный.	Исключает ложнополо-
тест абсорбции ан-	Специфический.	жительные результаты
тител Т.pallidum	Не является тестом «на	нетрепонемных тестов
(FTA-ABS)	месте».	«serofast» (+ на протя-
	Дорогой	жении жизни).
		Качественный тест. IgM
		может быть поло-
		жительным на ранних
		стадиях сифилиса

63

---------------------------------- Глава 3 --------------------------------------

же время тесты VDRL и RPR — взаимозаменяемые и оказываются недостаточными для выявления ранней первичной инфекции.

При подозрении на первичную инфекцию у беременной необходимо проводить определение FTA. Однако диагноз первичной инфекции в большинстве случаев можно поставить путем тщательного клинического обследования, сбора анамнеза и темнопольной микроскопии материала, взятого из любых участков поражения. Тест FTA применяется также в качестве контрольного теста для подтверждения результатов, полученных при исследовании материала каким-либо из скринингтестов.

Современные серологические методики непригодны для диагностики сифилиса у плода.

Имеющиеся у матери антилипидные и антитрепонемные антитела могут пассивно проходить через плаценту; следовательно, обнаружение антител в крови плода не обязательно подразумевает наличие инфекции. Поэтому, учитывая эффективность лечения инфекции у матери, следует ориентироваться именно на это лечение в сочетании с регулярными серологическими обследованиями новорожденного для подтверждения эффективности терапии.

Окончательный диагноз сифилиса у новорожденного может быть поставлен при выявлении возбудителя — обычно путем тем-нопольного микроскопического исследования материала, полученного из пораженных участков тела. Серологическая диагностика у младенцев проблематична, так как антилипидные и антитрепонемные антитела IgGантитела, имеющиеся у матери, могут пассивно передаваться плоду через плаценту. Антитела, полученные от матери, могут персистировать у младенца в течение нескольких месяцев, но, как правило, исчезают к 6- месячному возрасту. Новорожденный может быть обследован на наличие IgM-антител. Материнские IgM-антитела не проходят через плаценту, и позитивный результат в этом случае позволяет предположить врожденную инфекцию. Однако при этом могут наблюдаться как ложноположительные, так и ложноотрицательные результаты, и младенцы с врожденной инфекцией могут не быть IgM-позитивными вплоть до 3-месячного возраста. Кроме того, инфицированные младенцы могут быть и серонегативными при рождении, если мать была инфицирована в третьем триместре беременности. Поэтому рекомендуется проводить повторный скрининг младенцев, подверженных риску инфекции, вплоть до 6-месячного возраста.

В постнеонатальном периоде и в раннем детском возрасте клинический диагноз врожденного сифилиса может быть подтвержден путем серологического обследования.

64

-----------------------------------Глава 3 -------------------------------------------

Токсоплазмоз

Материалом для исследования у беременной женщины является сыворотка крови. Диагноз основывается на определении специфических антител. Наиболее достоверным подходом в этом случае является выявление специфической IgG-сероконверсии (т. е. переход отрицательных результатов исследования в положительные). Точно установленная IgG-сероконверсия может быть подтверждена выявлением специфических IgM-антител. В этом случае становится очевидным, что речь идет об острой инфекции, создающей риск внутриутробной передачи токсоплазмоза.

Если серологические тесты в первом триместре беременности указывают на наличие инфекции у матери, необходимо обследовать плод с помощью ультразвуковой эхографии и кордоцентеза. В крови плода, полученной путем кордоцентеза, можно измерить уровень IgM-антител Принятым «эталонным» методом для количественной оценки антител против токсоплазм является тест окрашивания. Ввиду технической сложности и высокой его стоимости, выполняется только в специализированных центрах. Традиционные варианты метода ELISA при количественном определении IgM-антител часто дают ложноположительные результаты, связанные с избытком специфических IgG-антител, и ложнопозитивные реакции, связанные с присутствием

ревматоидного и антинуклеарного фактора в сыворотке.

У новорожденных с выраженными поражениями предположительный диагноз может быть поставлен на основании клинических данных. При выделении паразита из ткани плаценты диагноз врожденной инфекции становится весьма вероятным, но и отрицательные результаты исследования не исключают такого диагноза. Выделение Т.gondii из крови новорожденного имеет диагностическое значение, но, как и при культивировании ткани плаценты, отрицательные результаты могут быть получены при наличии врожденной инфекции, особенно если проводилось пренатальное лечение. Для выделения паразитов из крови плода требуется ускоренная и высокочувствительная методика. Заражение животных является высокочувствительным методом, однако окончательные результаты могут быть получены только через 45 дней. Более быстрым методом является выращивание токсоплазм в культуре ткани, но при этом не обеспечивается достаточный уровень чувствительности. Эти проблемы можно преодолеть с помощью молекулярной биологии в целях обнаружения специфической ДНК.

65

---------------------------------- Глава 3 --------------------------------------

Серологическое обследование младенца осложняется при наличии у ребенка (как инфицированного, так и неинфицированного) пассивно приобретенного материнского иммуноглобулина G. Титр материнских антител, выявленных у младенца после родов, прогрессивно снижается. Если не считать случаев обнаружения чрезвычайно высоких исходных титров, то материнские антитела обычно исчезают из крови младенца к 10-месячному возрасту. Наличие специфических IgM-антител свидетельствует о врожденной инфекции, но лишь у 1/3 новорожденных с врожденной инфекцией вырабатываются IgM-антитела в определяемых уровнях. Накопленный до настоящего времени опыт свидетельствует о большом значении определения IgA-антител для постнатальной диагностики врожденного токсоплазмоза.

Ветряная оспа

Клинический диагноз ветряной оспы можно подтвердить серологическими методами путем обнаружения четырехкратного нарастания титров антител в парных сыворотках, взятых в определенные периоды, и выявления специфических IgM-антител к вирусу ветряной оспы. IgG и IgM-антитела появляются через 2-5 дней после возникновения сыпи, их уровни достигают пика через 3-5 дней, затем титры IgM-антител снижаются, и через несколько месяцев эти антитела уже не выявляются; IgG-антитела персисти-руют в течение всей жизни. Уровни антител можно достоверно определить с помощью реакции связывания комплемента (РСК), иммунофлюоресценции (РИФ) и иммуноферментными методиками (ИФА). Нарастание титров IgGантител может быть у пациентов с первичными поражениями, вызванными вирусом простого герпеса, а также у пациентов с опоясывающим лишаем.

Для подтверждения неонатальной инфекции используют определение специфических IgM-антител. У некоторых IgM-негативных больных ретроспективные доказательства врожденной инфекции были получены путем выявления персистенции специфических IgG-антител в течение первого года жизни. Сообщения об антенатальной диагностике врожденной инфекции ветряной оспы путем выявления специфических IgM-антител в крови плода отсутствуют.

Лабораторное подтверждение ветряной оспы у взрослого или новорожденного можно осуществлять путем идентификации вируса ветряной оспы в жидкости везикул. Частицы вируса эффективно выявляются путем электронной микроскопии. Обнаружение специфических антигенов в везикулярной жидкости методом мечен-

66

---------— ---------------------

Глава 3 --------------------------------------

ных флюоресцином антител осуществляется гораздо быстрее. Попытки выделить вирус у младенцев с синдромом врожденной ветряной оспы обычно оказываются безуспешными.

ВИЧ

С 1984 года основой диагностики ВИЧ-инфекции являются иммунологические методы.

Специфический диагноз можно поставить путем тестирования крови на наличие антител против ВИЧ (анти-ВИЧ). У большинства пациентов сероконверсия отмечается в течение 6-8 недель после инфицирования, хотя в некоторых случаях антитела выявляются только через 6-9 месяцев. Поэтому отрицательный тест на наличие антител может считаться достоверным, если пациент не имел экспозиции к вирусу в течение приблизительно 6 месяцев. При наличии постоянного риска инфекции отрицательный тест не имеет существенного значения.

Иммуноферментный анализ является первым скрининговым этапом обследования. Он позволяет определить в сыворотке крови суммарные антитела к ВИЧ. Если в ELISA получен положительный результат, проводят два повторных исследования данного образца тем же методом; при двух отрицательных результатах повторных исследований кровь считается неинфицированной. Если одно или оба исследования повторяют ранее полученный результат, его перепроверяют на втором этапе — стадии подтверждающей диагностики. На этом этапе осуществляется исследование сыворотки крови с помощью метода иммуноблотинга, позволяющего установить наличие антител к отдельным протеинам ВИЧ.

Выявление в сыворотке антител к поверхностным протеинам ВИЧ (gpl60, gpl20, gp41), как правило, обнаруживающихся в сочетании с антителами к ядерному белку р24, свидетельствует о наличии ВИЧинфекции. Положительными считаются пробы, в которых обнаруживаются антитела к 2-3 гликопротеидам ВИЧ.

Среди антигенов ВИЧ наиболее часто определяют белок р24, Антиген р24 не связан с антителами только в начальный период заболевания и в стадии СПИДа, поэтому он может быть использован для диагностики ВИЧ только в эти периоды. Высокой специфичностью обладает метод ДНК-зондов, или молекулярной гибридизации, или полимеразная цепная реакция (ПЦР). Этот метод позволяет определять генетический материал вируса даже в начальный период

67

---------------------------------- Глава 3 --------------------------------------

болезни. Кроме того, ПЦР выявляет количество РНК-копий вируса в 1 мл крови («вирусная нагрузка»), что является одним из основных лабораторных маркеров прогрессирования ВИЧ-инфекции.

Теоретически решающим для уточнения вопроса об инфицированности организма ВИЧ является выделение культуры вируса. Однако на практике возможности применения этого метода ограничены из-за дороговизны исследования, низкого количества копий вируса в крови больных в некоторые периоды заболевания, что делает невозможным выделение вируса, и длительность получения результата. Таким образом, хотя выделение культуры ВИЧ является важным диагностическим тестом, но он практически не применяется из-за большой трудоемкости исследования, необходимости специально оборудованной лаборатории, высокой стоимости, длительности получения результата (2-4 недели).

Для определения глубины иммуносупрессии и прогнозирования развития тех или иных вторичных заболеваний применяют определение уровня CD4+T-лимфоцитов. У здоровых взрослых людей минимальное количество СD4+Т-лимфоцитов составляет 1400 в 1 мкл. При ВИЧинфекции количество этих клеток снижается до 500 в 1 мкл. В стадии СПИДа их менее 200 в 1 мкл.

В настоящее время нет никаких данных об эффективной диагностике инфекции у плода. Результаты проводимых тестов трудно интерпретировать, и даже самый чувствительный из них — ПЦР — не может считаться достоверным на самых ранних этапах жизни. Обнаружение антител против вируса как традиционный подход достаточно трудно применять для диагностики внутриматочной и/или неонатальной инфекции. Эти трудности связаны с наличием материнских антител, перенесенных через плаценту. Поэтому необходимо регулярно обследовать ребенка, чтобы выявить исчезновение или постоянное наличие антител. На практике это означает, что последующее наблюдение должно продолжаться не менее 15-18 месяцев.

Эпидемический вирус паротита

Основным методом лабораторной диагностики эпидемического паротита является определение IgM к вирусу паротита в сыворотке. IgMантитела появляются в острый период инфекции (первые дни) и сохраняются до 2-х лет.

68

---------------------------------- Глава 3 ------------------------------------

Урогенитальные микоплазмы

Учитывая то, что урогенитальные микоплазмы, к которым относятся

Mycoplasma hominis и Ureaplasma urealyticum, могут являться коменсалами вагинального тракта здоровых женщин, оценка уровня контаминации ими должна всегда носить количественный характер. Поэтому для диагностики урогенитальных ми-коплазм приемлем культуральныи метод. Количество бактерий оценивают в КОЕ/мл исследуемого материала. Концентрация микоплазм, в которой они не вызывают патогенное действие, составляет 103 КОЕ/мл. Для сбора исследуемого материала и его транспортировки используют специальные питательные среды. Культивирование, идентификация и количественный учет микоплазм могут быть осуществлены при помощи стандартных систем Mycoplasma DUO, Mycoplasma 1ST. Эти же тест-

системы могут быть использованы и для определения чувствительности выделенных штаммов микоплазм к антибиотикам.

Материалом для исследования являются пробы со слизистой уретры, сводов влагалища, пробы мочи, абортированные или мертворожденные плоды, амниотическая жидкость, пробы с плаценты.

Папилломавирусная инфекция

Для диагностики ВПЧ-инфекции используют цитологический метод при окраске мазков по Папаниколау и метод ДНК-гибридизации с применением нуклеиновых кислот. Определение типа вируса осуществляется с помощью эндонуклеазного анализа ДНК. Другие методы диагностики папилломавирусной инфекции, такие как серологические и ПЦР, как правило, не используются, поскольку они не исключают процент ложноположительных результатов и не дают возможности определить тип вируса. Материалом для исследования являются мазки-соскобы, взятые со слизистой шейки матки.

Кандидоз

Принимая во внимание возможность кандидоносительства, диагноз кандидоза устанавливается при наличии клинических проявлений заболевания и микроскопического выявления грибов рода Candida с преобладанием вегетирующих форм. Наиболее достоверным методом лабораторного исследования является культуральныи метод с количественным определением колоний грибов.

69

---------------------------------- Глава 3 ------------------------------------

Туберкулез

Основным методом диагностики туберкулеза является бактериологическое исследование, Традиционная микробиологическая диагностика туберкулеза с помощью посева на плотные яичные среды дает визуальный результат через 6-8 недель, а с учетом определения лекарственной резистентности микобактерий туберкулеза — через 10-12 недель при наличии в посеянном материале не менее 100 жизнеспособных клеток.

В настоящее время разработаны полностью автоматизированные системы для выявления микобактерий на жидких средах, что дает возможность получить результаты, начиная с четвертого дня после поступления диагностического материала. Приблизительно третья часть пациентов с бактериовыделением может быть выявлена при первичной микроскопии окрашенного мазка мокроты.

Определение антител к возбудителю туберкулеза в сыворотке — новый и перспективный метод серологической диагностики этого заболевания. В пуле специфических антител при туберкулезе у взрослых обычно превалируют IgG. Реже подавляющая часть пула бывает представлена IgA. Антитела IgM у взрослых больных встречаются довольно редко и более характерны для начальных стадий заболевания. У детей высокие титры специфических антител IgA и IgM отмечаются гораздо чаще. Причем высокий уровень IgM иногда может сохраняться длительное время и даже при относительно низких уровнях IgG- и IgAантител.

Выводы

1.По способности выявления возбудителя инфекции методы лабораторной диагностики могут быть разделены на две группы: прямые, позволяющие выявить в биологических жидкостях или тканях матери (плода) вирусы или микроорганизмы; непрямые, позволяющие зарегистрировать специфический иммунный ответ матери (плода) на возбудителей инфекции.

2.К прямым методам относятся:

—микроскопия (электронная или прямая — например, в темном

поле);

—выявление вирусных или бактериальных антигенов (в т. ч. одноэтапными иммуноферментными и иммунохроматографичес-кими методами);

—полимеразная цепная реакция (ПЦР);

—культуральный метод.

70