2 курс / Нормальная физиология / Физиология бактерий

2

ПРИНЦИПЫ И МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ ЧИСТОЙ КУЛЬТУРЫ БАКТЕРИЙ

Для начала вспомним понятия чистая культура, штамм и вид из предыдущего урока:

Чистая культура - популяция микроорганизмов, принадлежащих одному виду, полученная как потомство одной клетки на стерильной питательной среде методом механического разобщения.

Штамм – совокупность микробов одного вида, выделенных из одного источника в разное время или из разных источников

Вид – совокупность микроорганизмов, имеющих единое происхождение и генотип, сходных по морфологическим и биологическим свойствам.

Таким образом, чистые культуры представлены микроорганизмами одного вида или штамма.

3

Этапы бактериологического исследования

1.Этап: посев исследуемого материала на чашки Петри с плотной питательной средой (МПА) методом механического разобщения при 37 градусах в течение 24 часов

Втом случае, если в исследуемом материале содержится незначительное количество возбудителя (например,

вкрови), то его предварительно накапливают путем посева материала в жидкую питательную среду (среду

обогащения), а затем после инкубации (как правило при 37 в течение 18-24 ч) производят пересев на плотную среду

Выделение и идентификация чистой культуры анаэробов производится в анаэробных условиях (см. ниже)

Результат: получение изолированных колоний

2.Этап: накопление ЧК на скошенном агаре

Макроскопическое исследование колоний, выросших на плотной питательной среде, в проходящем и отраженном свете (культуральные свойства);

Приготовление мазка из половины колонии каждого вида и окраску препарата по Граму (морфологические и тинкториальные свойства) + проверка чистоты культуры;

Пересев оставшейся части колонии на скошенный агар для накопления выделенной культуры 37оС в течение 24 часов

Результат: накопленная чистая культура в достаточном количестве для дальнейших тестов.

4

3.Этап: идентификация исследуемой культуры

Изучение однородности роста на скошенном МПА

Приготовление, окраска по Граму (или фуксином) и микроскопия для проверки чистоты выделенной культуры)

Изучение биохимической активности бактерий: посев выделенной ЧК на среды Гисса (для определения сахаролитической активности), желатин и МПБ с индикаторными бумажками на индол, аммиак и сероводород (для выявления протеолитической активности). Инкубация при 37oС 24ч

o изучение биохимических свойств проводят только при выделении ЧК. При этом определяют свойства каждого выделенного микроорганизма в отдельности.

Если при микроскопии мазка из материала скошенного МПА обнаруживается смесь бактерий, то процедуру выделения ЧК необходимо повторить!

oдля адекватной оценки биохимической активности бактерий необходимо исследовать не менее 15-20 тестов

oизучение антигенных свойств выделенных бактерий (в рамках блока Инфекция)

4.Этап: Учет результатов

5

ПЕРВЫЙ ЭТАП БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ

Условия для культивирования:

ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА

АТМОСФЕРА КУЛЬТИВИРОВАНИЯ

ТЕМПЕРАТУРА КУЛЬТИВИРОВАНИЯ

ВРЕМЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ

ОСВЕЩЕНИЕ

Питательная среда

Требования к питательным средам:

1.Влажность: все процессы жизнедеятельности бактерий происходят в воде

2.Органический источник углерода (так как культивируем гетерохемоорганотрофы)

3.Источники других химических элементов для биосинтеза: азота, серы, фосфора

4.Определенный уровень pH

5.Определенный уровень осмотического давления (чаще всего среда должна быть изотоничной)

6.Стерильность

7.Прозрачность (чтобы был виден рост бактерий, особенно для жидких сред)

6

Классификация питательных сред

По происхождению

По составу

7

По

консистенции

Плотность среды достигается добавлением агара.

Агар – полисахарид, получаемый из водорослей. Он плавится при температуре 100оС, но при охлаждении остывает при температуре 42-50оС.

Расплавленный агар разливают в чашки Петри по 10-15 мл, в пробирки по 7-15 мл. Налитый в пробирки агар можно скосить для получения скошенного агара. Для этого после разлива агара пробирки кладут на наклонную поверхность до полного застывания.

Также существуют двухфазные среды. Их используют, например, для посева крови. Они состоят из слоя агара, покрывающего одну сторону флакона и налитого в этот флакон бульона.

8

По назначению

9

Методы посевов на питательные среды

Если клетки из смеси микробов будут пространственно разделены друг от друга, то каждая клетка даст отдельную колонию.

И так как каждая колония происходит из одной клетки, то каждая колония представляет собой чистую культуру.

1 колония = 1 чистая культура

Инструменты для посева: бактериологическая петля, шпатель, специальный ватный тампон.

10

Техника посева по Дригальскому

Посев осуществляется стерильным шпателем на 3 чашки Петри с плотной питательной средой.

На середину первой чашки пипеткой или бактериологической петлей вносят исследуемы материал, который распределяют по поверхности чашки круговыми движениями, вращая приоткрытую чашку левой рукой.

Не стерилизуя шпатель переносят во вторую, а затем в третью чашку, проводя распределение истощенного материала по их поверхности.