5 курс / Пульмонология и фтизиатрия / Бронхиальная_астма_и_хроническая_обструктивная

соединения, по влиянию на протекание которой и оценивается АОА индивидуального соединения или смеси. Кинетика контролируется либо по поглощению кислорода способами измерения объема, либо по изменению характеристик реакционной смеси – изменению поглощения электромагнитного излучения, флуоресценции, люминесценции и т.д. В ряде случаев создаются условия для генерирования свободных радикалов с постоянной скоростью, добавлением инициаторов, либо с химической генерацией радикалов в результате протекания контролируемого химического процесса [75].

Флуориметрические методы

Метод определения адсорбционной емкости по отношению к кислородным радикалам («Oxygen Radical Absorption Capacity»-ORAC) [75] является одним из наиболее применяемых в настоящее время. Он был первоначально разработан доктором Гохуа Као (G. Cao) в Национальном нституте старения (США) в 1992 г. В 1996 г доктор Г. Као объединился с доктором Рональдом Прайером (R. Prior) в совместную группу в Исследовательском центре старения USDA (администрации по контролю за лекарственными средствами, США), где был создан полуавтоматический метод.

С тех пор автоматизированный метод интенсивно применяется при исследованиях антиоксидантов и окислительного стресса [108, 128]. Метод основан на измерении интенсивности флуоресценции определенного соединения и ее изменении от времени протекания реакции. В присутствии соединений, связывающих кислородные радикалы, увеличивается время флуоресценции вследствие защитного действия антиокислителей. Количественное определение антиокислительной активности осуществляется по площади между двумя кривыми – свободной реакции и с добавлением антиоксидантов.

Степень уменьшения флуоресценции есть мера степени деградации флуоресцирующего соединения под воздействием кислородных радикалов.

Первоначально в качестве флуоресцирующего вещества применялся белок В-фикоэритрин. Однако оказалось, что он вступает в реакцию с фенольными соединениями, являющимися главными антиоксидантами растительного происхождения, что приводило к систематически заниженным результатам определения АОА. Поэтому на фирме Brunswick Laboratories впервые применили другое, более стабильное, флуоресцирующее соединение – флуоресцеин.

Метод, основанный на поглощении кислородных радикалов

(ORAC) – относительно простой и чувствительный, но продолжительный (около 95 мин) и требует наличия флуоресцентного детектора.

Метод ORAC измеряет только антиокислительную активность против пероксидного и гидроксильного радикалов, но в дальнейшем планируется распространить его и на другие токсичные

40

реакционноспособные частицы. Указанным методом (ORAC) может быть определена антиокислительная активность как водорастворимых, так и жирорастворимых объектов, таких как пищевые продукты, напитки, химикаты, добавки, плазма и сыворотка крови, моча и т.д. Главное условие

–перед определением образцы должны храниться в сухом льду.

Вкачестве стандартных соединений применяются Тролокс (определение пероксидов) и галловая кислота (гидроксил-радикалы). Соответственно, единицей измерения в методе ORAC является микромоль стандарта на единицу массы или объема.

Метод Гуо и Янга [252] основан на определении антиокислительной

активности соединений по их способности связывать гидроксил-радикалы НО., которые, как полагают, являются наиболее реакционноспособными в физиологических условиях и ответственными за множество нежелательных в организме последствий, таких как онкогенез, атеросклероз и мутации ДНК. В модельной системе, предложенной авторами, генерация гидроксил-ионов протекает из кислорода при участии комплексов железа с этилендиаминтетрауксусной кислотой.

Фотометрические методы

Наиболее многочисленные методы и модификации методов, используют фотометрическую регистрацию, вероятно, как самую удобную и доступную.

Колориметрическое определение общей антиокислительной активности (ТАС) по окислению кроцина впервые было предложено F.Tubaro et al. (1998). Кроцин представляет собой красящее вещество желтых стручков, плода китайского растения Gardenia grandiflora.

Последние усовершенствования этого метода позволяют определять антиокислительную активность плазмы человека. Метод был стандартизован по индивидуальному соединению, в качестве которого был использован Тролокс (Trolox) – водорастворимый аналог витамина Е (6- гидрокси-2,5,7,8-тетраметилхроман-2-карбоновая кислота).

ТАС не чувствителен к процессам замораживания – размораживания образцов и дает стабильные результаты при хранении образцов при комнатной температуре до 4 ч. Выяснилось, однако, что результаты определений занижаются в присутствии лимонной кислоты примерно на

20%.

Антиокислительная активность в тканях мозга была исследована [217] по методу с использованием Тролокса в качестве эквивалента (и названа TEAC), это является продолжением работ, использующих в качестве основы метода окисление кроцина. Определение антиокислительной активности по методу ТАС основано на оценке общего восстановительного эффекта индивидуальных низкомолекулярных антиоксидантов, как гидрофильных, так и гидрофобных. Оно дает информацию о типах антиоксидантов и их концентрациях без точного

41

качественного различия. Эти методы основаны изначально на мониторинге изменения окраски, отнесенной к стандартному соединению – Trolox.

Одним из способов оценки АОА является колориметрия свободных радикалов, основанная на реакции DPPH (2,2-дифенил-1- пикрилгидразил, C18H12N5O6, M = 394,33), растворенного в метаноле, с образцом антиоксиданта (АН).

Врезультате восстановления DPPH антиоксидантом снижается пурпурно-синяя окраска DPPH в метаноле, а реакция контролируется по изменению оптической плотности при 514 нм обычными методами спектрофотометрии.

M. Buijnsters et al. [134] модифицировали способ определения АОА объединением стандартной фотометрической процедуры с методом оптотермического окна (optothermal window – OW) – недорогим,

нетрадиционным детектором поглощения. Оптотермическое преобразование позволяет увеличить чувствительность определений на два порядка, линейный диапазон измерений – в 16 раз, по сравнению с традиционными способами спектрофотометрии.

Важным преимуществом оптотермического способа измерения поглощения является также то, что возможна работа с опалесцирующими образцами.

Есть сведения об определении антиокислительной активности

соединений на модели окисления униламелярных (одномембранных) липосом кислородом воздуха (катализируемое ионами Fe2+).

Другие используемые методы по восстановлению антиоксидантами железа: (ferric reducing/antioxidant power-FRAP) –

позволяют прямое определение низкомолекулярных антиоксидантов. При низких рН восстановление Fe(III)-трипиридилтриазинового комплекса в Fe(II)-комплекс сопровождается появлением интенсивной голубой окраски. Измерения основаны на способности антиоксидантов подавлять окислительный эффект реакционных частиц, генерируемых в реакционной смеси. Этот метод отличается простотой, быстротой и небольшими затратами при исполнении.

Электрохимические методы оценки АОА могут быть разделены на две группы.

Вчасти методов используется только электрохимическая регистрация какого-либо соединения, изменение концентрации которого косвенно связано с протеканием процессов окисления [37, 119, 182].

Другая группа методов [120, 133, 234] основана на непосредственном измерении окислительно-восстановительных потенциалов. Указывается, что эти параметры в целом коррелируют с АОА

имогут быть использованы для ее оценки.

Вразных методах определяются либо отдельные антиокислительные компоненты (например, витамин Е, аскорбиновая кислота и т.д.), либо

42

общая антиокислительная активность (АОА). Действительно, определение концентрации отдельного соединения, обладающего свойствами антиокислителя, часто менее информативно по сравнению с определением общей антиокислительной активности.

Представлен анализ восстанавливающей способности и количественной оценки антиокислительной активности in vitro гидрида кремния и семи коммерчески доступных водорастворимых антиоксидантов [234]. Эксперимент включает определение окислительновосстановительных потенциалов, рН и клеточную фотосенсибилизацию методом спектрофотометрии, что позволило объективно оценить антиокислительную эффективность соединений.

Для оценки абсолютной восстановительной способности антиоксидантов было использовано модифицированное W.M. Clark уравнение Нернста, связывающее парциальное давление водорода и восстановительный потенциал в единицах rH. Однако измерение восстановительного потенциала хорошо только in vitro, проблема моделирования in vivo при этом сохраняется.

43

Глава 2 ОКСИДАТИВНЫЙ СТРЕСС ПРИ БРОНХИАЛЬНОЙ ОБСТРУКЦИИ

2.1. Оксидативный стресс и его роль в патогенезе бронхиальной астмы и хронической обструктивной болезни легких

Бронхиальная астма и хроническая обструктивная болезнь легких – два самостоятельных хронических заболевания респираторной системы, сопровождающиеся воспалением с формированием бронхиальной обструкции и нарушений, выражающихся чрезмерным усилением образования активных форм кислорода и ослаблением эффективности антиоксидантной защиты. Эти нарушения обусловлены оксидативным

стрессом.

Концепция «оксидативного стресса», которая играет ключевую роль в развитии воспалительного процесса при бронхиальной астме и хронической обструктивной болезни легких активно изучается в последние годы.

Любые органы и ткани могут страдать от оксидативного повреждения, однако легкие наиболее уязвимы в этом отношении [70], что обусловлено:

1)большой площадью, занимаемой поверхностным эпителием, составляющей у человека в среднем 70 м2 (площадь эпителия легких занимает второе место среди всех систем организма, уступая лишь эпителию кишечника);

2)большей возможностью протекания свободнорадикальных реакций из-за повышенного содержания в ткани легких субстратов перекисного окисления липидов [25, 79];

3)непосредственным воздействием на легкие [69, 246]:

кислорода – инициатора окисления,

оксидантов, содержащихся в загрязненном воздухе (озон, диоксиды азота и серы, ксенобиотиков и т.д.),

44

оксидантов, образующихся при курении,

микроорганизмов и вирусов, содержащихся в воздухе, выделяющих оксиданты.

(А) Во время нормального гомеостаза клетки, супероксидные радикалы производятся в митохондриях, эндоплазматическом ретикулуме, цитозоле, ядерной и клеточной мембранах. Внутриклеточная продукция супероксида и Н2О2 уравновешивается высоким уровнем антиоксидантных ферментов, что поддерживает нормальный гомеостаз. Внеклеточный синтез супероксида на низком уровне и уравновешивается наличием в

дыхательных путях EC-СОД. Внутриклеточный оксид азота (NO·) защищен от повреждающего действия супероксида EC-СОД.

(B) При оксидативном стрессе (например, астматическое воспаление) и супероксид, и iNOS продуцируются внутри клеток. Воспалительные клетки, такие как эозинофилы, моноциты и нейтрофилы проникают в субклеточное пространство эпителия дыхательных путей. Содержание NADPH-оксидазы на их клеточных мембранах снижается, а iNOS, MPO и ЭПО активизируются в воспалительных клетках и начинают вырабатывать оксиданты, что приводит к нарушению нормального гомеостаза, и внутриклеточный оксид азота преобразуется в цитотоксический оксидант – пероксинитрит.

Рисунок 9. Источники оксидантов в легочной ткани при воспалении

45

Кроме того, установлено, что при БА и ХОБЛ имеет место чрезмерная и неконтролируемая эндогенная продукция свободных радикалов [70, 92, 122, 148, 210, 251]. Клетки, обуславливающие характерный воспалительный процесс в бронхиальном дереве под воздействием различных раздражителей активизируются и генерируют эндогенные оксиданты. Такими клетками могут быть нейтрофилы, эозинофилы, моноциты, макрофаги, бронхиальные эпителиальные клетки. Результатом является снижение уровня антиоксидантов при оксидативном стрессе на фоне бронхиальной обструкции (рис.9) [178].

Внастоящее время доказано, что наиболее частым провоцирующим фактором, вызывающим обострение БА посредством активации воспалительных клеток является риновирусная инфекция. Риновирусы обнаруживаются в материалах дыхательных путей, взятых во время обострений БА у детей и взрослых [192]. Риновирусы индуцируют воспаление дыхательных путей, активируют эозинофилы и нейтрофилы с помощью цитокинов и хемокинов, синтезированных эпителиальными клетками респираторного тракта или Т-клетками [194], тем самым приводя

кобратимой обструкции и усилению гиперреактивности бронхов [192]. Кроме того, риновирусная инфекция вызывает увеличение содержания оксидантов в эпителиальных клетках дыхательных путей, тем самым приводя к активации NF-kB, что в свою очередь стимулирует выработку провоспалительных молекул адгезии и цитокинов [222].

Интенсификация свободнорадикальных процессов обусловлена помимо «дыхательного взрыва» при воспалении, нарушением тканевого дыхания при гипоксии и активацией микросомального окисления при поражении химическими веществами [16].

Впротивовес свободнорадикальным процессам в организме существует АОС, представляющая собой совокупность защитных механизмов клеток, тканей, органов и систем, направленных на сохранение и поддержание гомеостаза [36, 71]. Равновесие между этими двумя противоположными составляющими в состоянии физиологического оптимума удерживает перекисное окисление на определенном низком уровне, препятствуя развитию цепного окислительного процесса, и характеризует антиоксидантный статус организма [36, 71].

Так, для нейтрализации и предотвращения воздействия оксидантов на легочную ткань выстилающий эпителий бронхов при первых признаках воспаления вырабатывает секрет [156]. Этот секрет содержит большое количество GSH (в 100 раз выше, чем в плазме), 90% из которого находится в восстановленной форме; каталазу, супероксиддисмутазу и GPx [116, 221]. В этом секрете содержатся также церулоплазмин, трансферрин, аскорбиновая кислота, витамин Е, ферритин, другие сывороточные белки и малые молекулы, такие как билирубин [156].

46

А.Ф. Колпаковой и соавт. представлена классификация антиоксидантов легких, составленная с использованием компьютерной системы BioUM (рис.10). Новая отечественная компьютерная система BioUML в данном случае использована для формализованного описания результатов собственных исследований [33, 180, 181, 232] и анализа баз данных TRANSPATH, GeneNet, GeneOntology, EMBL, GeneBank, BMOND [180]. BioUML – это интегрированная, расширяемая, свободно доступная программа (http://www.biouml.org) для формального описания, графического представления, анализа и моделирования сложных биологических систем. Программа BioUML позволила формально описать патогенез хронических заболеваний легких.

АНТИОКСИДАНТЫ ЛЕГКИХ

	Хелаторы металлов	Ферментные	Неферментные
		антиоксиданты	антиоксиданты

	Ферритин	Глутатион-	Глутатион
	Трансферрин	пероксидаза	Альбумин
		Гемоксигеназа	β-каротин мембран
	Лактоферрин
		Каталаза	Плевральная слизь
	Церулоплазмин	Супероксиддисму	легких
		таза	α-токоферол
		(CuZn-SOD, Mn-	Аскорбиновая
		SOD,Cu-SOD)	кислота
			Мочевая кислота

Рис. 10. Классификация антиоксидантов легких

Сбалансированность оксидантов и антиоксидантов необходима для поддержания окислительно-восстановительного статуса. Дисбаланс, либо за счет увеличения количества или активности оксидантов или уменьшения антиоксидантных ресурсов, может привести к ряду патофизиологических событий в легочной ткани, в том числе к оксидативному стрессу.

47

Нарушениям в системе оксиданты-антиоксиданты в патогенезе заболеваний легких придается большое значение благодаря таким доказанным фактам [145]:

1)антиоксидантная терапия предупреждает активацию транскрипционных факторов;

2)оксидативный стресс модулирует концентрацию антиоксидантов в

легких;

3)антиоксиданты защищают легкие и клетки против оксидативного

стресса.

В низких концентрациях активные формы кислорода, оксид азота и другие свободные радикалы выполняют важные физиологические функции, участвуют во многих метаболических процессах.

При их избыточной продукции происходят структурные повреждения биомолекул как собственных, так и окружающих тканей.

В результате оксидативного стресса могут повреждаться [68]:

1)аминокислоты различных белков,

2)мембраны липидов (перекисное окисление липидов),

3)единичные нуклеотиды в ДНК.

Повреждающее действие свободных радикалов, в том числе активных форм кислорода (супероксида и других) носит неспецифический характер и является составным элементом типового патологического процесса. В тоже время выраженность нарушений в системе оксидантантиоксидант зависит от механизма формирования бронхиальной обструкции, степени тяжести и фазы заболевания.

Патологические эффекты свободных радикалов обусловлены не только прямым повреждающим действием на молекулярно-клеточном уровне, но и опосредованным.

Так, оксиданты повреждают молекулы (белки, липиды, нуклеиновые кислоты) блокированием SH-групп ферментов и их инактивацией, гидроксилированием оснований ДНК и ее фрагментацией, развитием ПОЛ

идестабилизацией клеточных мембран [8]. Они опосредуют множество процессов, благоприятствующих развитию воспалительных изменений в легких: повреждают фибробласты, снижают активность сурфактанта, стимулируют образование тромбоксана, повышают проницаемость эпителия, ухудшают функцию ресничек и т.д. [86].

Оксидативный стресс поддерживает воспалительную реакцию в респираторной системе, активируя клетки через механизмы сигнальной трансдукции: редоксчувствительные транскрипционные факторы (NF-kB и AP-1), митоген-активируемая протеин-киназа (MAPК), фосфатилинозитолтрифосфокиназа (PI-3K), и вызывая экспрессию генов цитокинов.

Активация транскрипционных факторов считается следствием оксидативного стресса, ассоциированного с воспалением при бронхиальной астме [100] и хронической обструктивной болезни легких

48

[188]. Регуляция этих транскрипционных факторов связана с изменением окислительно-восстановительного потенциала клетки [48]. При активации этих транскрипционных факторов увеличивается транскрипция генов IL-1, IL-6, IL-8 и фактора некроза опухоли-α (TNF-α), iNOS. Цитокины играют важную роль в свободнорадикальном окислении и повреждении тканей, так как они могут нарушить баланс оксидантов/антиоксидантов, активизируя клетки воспаления.

Таким образом, исследователями доказано наличие оксидативного стресса и его ключевой роли в развитии воспаления при бронхиальной астме и хронической обструктивной болезни легких [79, 176, 178, 216, 219].

Нами проведен анализ данных литературы за последние 50 лет, описывающих особенности окислительно-восстановительного статуса в зависимости от генеза бронхиальной обструкции.

2.2. Особенности окислительно–восстановительного статуса при бронхиальной астме

Исследования последних лет показали, что в основе бронхиальной астмы лежит воспалительный ответ [125, 240], вызываемый комплексом взаимодействий между различными клетками и высвобождаемыми ими медиаторами [197]. Среди последних важную роль играют свободные радикалы, в том числе активные формы кислорода, составляющие основу системы оксидант-антиоксидант [139].

Важным эндогенным источником АФК при БА являются такие воспалительные клетки, как нейтрофилы, макрофаги, эозинофилы и моноциты, которые в избытке имеются в дыхательных путях [112, 125]. Кроме активных воспалительных клеток в легких при БА, источником АФК могут быть также эпителиальные клетки дыхательных путей [219, 224]. Кроме того, клетки, полученные из бронхиальной жидкости и крови больных бронхиальной астмой, способны генерировать большие количества АФК по сравнению со здоровыми, как изначально, так и после стимуляции их in vivo, и коррелируют со стадией заболевания [125].

Это подразумевает, что биохимическая среда при бронхиальной астме содержит факторы, которые являются источником оксидативного процесса [231]. Оксидативный «взрыв» характеризуется увеличением ионной проницаемости клеточной мембраны фагоцитов при контакте с чужеродными частицами, сопровождающимся усилением окисления глюкозы и резким возрастанием (в десятки раз) потребления кислорода с образованием супероксида [83]. Как и при многих других патологических состояниях оксидативный «взрыв» при бронхиальной астме является самовоспроизводящимся неспецифическим процессом, запускающимся при согласованном действии многочисленных воспалительных факторов,

49