Реакция иммунофлуоресценции (риф)

РИФ основана на соединении антигенов бактерий, риккетсий и вирусов со специфическими антителами, меченными флюоресцирующими красителями (флуоресцеинизотиоцианат, родамин, В-изотицианит, лиссатинродамин В-200, сульфохлорид и др.), имеющими реакционно-способные группы (сульфохлорид, изотиоцианит и др.). Эти группы соединяются со свободными аминогруппами молекул антител, которые не теряют при обработке флуорохромом специфического сродства к соответствующему антигену. Образовавшиеся комплексы АГ–АТ становятся хорошо видимыми, ярко светящимися структурами под люминесцентным микроскопом (рис. 48). С помощью РИФ можно обнаруживать небольшие количества бактериальных и вирусных антигенов. Метод РИФ используют в двух вариантах: прямой и непрямой метод.

Прямой метод основан на непосредственном соединении антигена с меченым антителом. Непрямой метод – на поэтапном выявлении комплекса АГ–АТ с помощью флуоресцентных красителей. Первый этап заключается в образовании иммунных комплексов определенного антигена со специфическими антителами. Второй этап – в выявлении этого комплекса путем обработки его меченым антигаммаглобулином.

Преимущество РИФ – простота, высокая чувствительность, скорость получения результата. РИФ применяется как метод ранней экспресс-диагностики гриппа, дизентерии, малярии, чумы, туляремии, сифилиса и др. Для проведения такого исследования используется люминесцентный микроскоп.

Рис. 48. Реакция иммунофлуоресценции:

1 – прямой метод;

2 – не прямой метод.

Радиоиммунологический анализ (риа)

РИА – один из самых чувствительных методов иммунодиагностики. Его применяют для выявления антигена вируса гепатита В, у больных вирусным гепатитом. Для этого к исследуемой сыворотке добавляют референс-сыворотку (сыворотку, содержащую антитела к вирусу гепатита В). Смесь инкубируют 1-2 сут при температуре 40⁰С, затем добавляют референс-антиген (антиген, меченный изотопом ¹²⁵J) и продолжают инкубацию еще 24 часа. К образовавшемуся комплексу антиген-антитело добавляют преципитирующие антииммуноглобулины против белков референс-сыворотки, что приводит к образованию преципитата (рис. 49). Результат учитывают по наличию и числу импульсов в преципитате, зарегистрированных счетчиком. При наличии в исследуемой сыворотке антигена, связавшегося со специфическими антителами, последние не вступают в связь с меченным антигеном и, поэтому, он не обнаруживается в преципитате. Таким образом, в основу РИА положен принцип конкурентного взаимодействия определяемого антигена и известного количества меченного антигена с активными центрами антител.

Рис. 49. Радиоиммунологический анализ:

1 – антиген;

2 – антитело;

3 – радиоактивная метка.

Иммуноферментный метод (ифа)

Метод используется для выявления антигенов с помощью соответствующих им антител, конъюгированных с ферментом-меткой (пероксидазой хрена, -галактозой или щелочной фосфатазой). После соединения антигена с меченной ферментом иммунной сывороткой в смесь добавляют субстрат и хромоген. Субстрат расщепляется ферментом, а его продукты деградации вызывают химическую модификацию хромогена. При этом хромоген меняет свой цвет – интенсивность окраски прямо пропорциональна количеству связавшихся молекул антигена и антител (рис. 50).

Рис. 50. Иммуноферментный анализ, выявление антигена прямым и непрямым методами твердофазного ИФА.

Наиболее распространен твердофазный ИФА, при котором один из компонентов иммунной реакции (антиген или антитело) сорбирован на твердом носителе. В качестве твердого носителя используются микропанели из полистирола. При определении антител в лунки с сорбированным антигеном последовательно добавляют сыворотку крови больных, антиглобулиновую сыворотку, меченную ферментом и смесь растворов субстрата для фермента и хромогена. Каждый раз после добавления очередного компонента из лунок удаляют не связавшиеся реагенты путем тщательного промывания. При положительном результате изменяется цвет раствора хромогена.

Твердофазный носитель можно сенсибилизировать не только антигеном, но и антителом. Тогда в лунки с сорбированными антителами вносят искомый антиген, добавляют иммунную сыворотку против антигена, меченную ферментом, а за тем – смесь растворов субстрата для фермента и хромогена.

ИФА применяют для диагностики заболеваний, вызванных вирусными и бактериальными возбудителями.