Тема 4 Будова та фізико-хімічні властивості білків-ферментів. Класифікація та номенклатура ферментів.

Актуальність теми.

Ферменти як високоспецифічні біологічні каталізатори забезпечують проходження багатьох тисяч взаємозв’язаних хімічних реакцій синтезу, розщеплення, взаємоперетворень різноманітних органічних речовин з високою швидкістю. За рахунок ферментів відбуваються найважливіші процеси життєдіяльності: експресія генетичної інформації, біоенергетика, синтез і розщеплення молекул. Вивчення структури іфункцій ферментів дозволяє розкрити суть основних процесів життєдіяльності, а також використовувати знання про природні каталізатори у хімічній, фармацевтичній, харчовій промисловості, медицині.

Мета заняття:

• Засвоїти принципи організації ферментів

• Знати загальні властивості ферментів

• Вивчити класифікацію та номенклатуру ферментів

• Оволодіти методом визначення активності амілази слини

Конкретні цілі:

• Характеризувати основні особливості ферментів як біологічних каталізаторів

• На основі розуміння фізико-хімічних властивостей білків-ферментів пояснювати залежність активності ферментів від рН середовища, температури та інших факторів.

• Класифікувати коферменти відповідно до їх хімічної природи, типу реакції, яку вони каталізують.

• Трактувати біохімічні закономірності будови та функціонування різних класів ферментів.

Теоретичні питання

1. Хімічна природа ферментів та властивості їх як біокаталізаторів.

2. Будова ферментів: активний, регуляторний (алостеричний) центри.

3. Прості та складні білки-ферменти, простетичні групи складних білків-ферментів (кофактори, коферменти).

4. Кофактори та коферменти. Класифікація коферментів за хімічною природою, типом реакції, яку вони каталі­­­зують.

5. Найбільш поширені коферменти: похідні вітаміну В₁, В₂, В₃, В₅, В₆, В_с, В₁₂, Н та похідні ліпоєвої кислоти.

6. Рівні структурної організації ферментів. Мультиферментні комплекси, ферментативні ансамблі, поліфункціональні ферменти, їх переваги.

7. Властивості ферментів:

• залежність активності ферментів від рН середовища;

• залежність активності ферментів від температури.

8. Специфічність дії ферментів, види специфічності та їх характеристика.

9. Номенклатура ферментів та їх класифікація за типом реакції.

Практична робота

Дослід 1. Дослідження термолабільності амілази слини.

Принцип методу. Амілаза відноситься до класу гідролаз – ферментів, що каталізують розрив хімічних зв’язків з приєднанням молекули води. Амілаза слини каталізує гідроліз крохмалю (розрив глікозидних зв’язків) через стадію утворення декстринів до дисахариду мальтози, про що свідчить реакція на крохмаль з йодом Метод ґрунтується на здатності крохмалю при взаємодії з йодом утворювати синє забарвлення за умов оптимальної для амілази температури середовища. Продукт розщеплення крохмалю – мальтоза – з йодом забарвлення не дає і її можна виявити за допомогою проби Тромера.

Хід роботи: Беруть 3 пробірки, у кожну з яких наливають по 1 мл 1% розчину крохмалю. У першу додають 1мл розведеної в 5 разів слини, у другу – 1 мл прокип’яченої слини, у третю – 1 мл фізіологічного раствору як контроль. Всі пробірки ставлять у термостат на 10 хв при 37⁰С. Після інкубації вміст кожної пробірки ділять порівну і проводять якісні реакції на крохмаль і продукти його гідролізу – мальтозу (всього 6 пробірок).

Реакція на крохмаль (йодна проба)

У три пробірки вливають по 1 краплі розчину Люголя (йод у йодиді калію). За наявності крохмалю з’являється синє забарвлення.

Реакція Тромера на мальтозу

Для проведення проби Тромера до вмісту пробірки з реактивною сумішшю додають рівний об’єм 10 % розчину NaOH і 5-7 крапель 5 % розчину CuSO₄. Вміст пробірки перемішують до зникнення помутніння. Верхню частину пробірки обережно нагрівають на відкритому вогні до кипіння, реакція Тромера повинна бути позитивною, що відзначають за появою жовто-червоного осаду.

Результати записують у таблицю і роблять висновки.

Номер пробірки	Фермент	Субстрат	Температура	Йодна проба	Проба Тромера
1
2
3

Пояснити отриманий результат. Зробити висновок.

Дослід 2. Дослідження впливу рН середовища на активність амілази слини.

Принцип методу. Метод ґрунтується на здатності крохмалю при взаємодії з йодом утворювати синє забарвлення за умов оптимального для амілази рН середовища. Продукт розщеплення крохмалю – мальтоза – з йодом забарвлення не дає і її можна виявити за допомогою проби Тромера.

Хід роботи. Беруть 3 пробірки, у кожну з яких наливають по 1 мл 1% розчину крохмалю. У першу додають 1 мл фосфатного буферу з рН 5,0, у другу – з рН 7, а в третю – з рН 9. В кожну з пробірок вносять по 1 мл, розведеної у 5 разів, встряхивають і ставлять у термостат при 37⁰С на 10 хв. Після інкубації вміст кожної пробірки ділять порівну і проводять якісні реакції на крохмаль і продукти його гідролізу – мальтозу (всього 6 пробірок).

Результати записують у таблицю і роблять висновки.

Номер пробірки	Фермент	Субстрат	Реакція середовища	Температура	Йодна проба	Проба Тромера
1
2
3

Пояснити отриманий результат. Зробити висновок.

Дослід 3. Вивчення специфічності дії амілази слини.

Принцип методу. Специфічність дії є однією з найбільш характерних властивостей ферментів і полягає в тому, що кожен фермент діє на певний субстрат чи групу субстратів, які мають подібну структуру. Розрізняють абсолютну, відносну (групову) та стереохімічну специфічність. Висока специфічність ферментів обумовлена їх білковою природою та структурою активного центру.

Амілаза слини розщеплює крохмаль до дисахариду мальтози і не діє на дисахарид – сахарозу, сахараза розщеплює сахарозу на глюкозу та фруктозу і не діє на крохмаль. Ступінь гідролізу субстратів оцінюють за результатами реакції Тромера. Мальтоза містить вільну альдегідну групу, а тому утворює забарвлення з реактивом Троммера, а сахароза не містить вільної альдегідної групи, тому не дає реакції.

Хід роботи: У 2 пробірки наливають по 1 мл слини, розведеної у 5 разів. У першу пробірку додають 1 мл 1% розчину крохмалю, у другу – 1 мл 1% розчину сахарози. Обидві пробірки ставлять у термостат при 37⁰С на 10 хв. Після цього зі вмістом пробірок проводять реакцію Тромера.

Результати записують у таблицю і роблять висновки.

Номер пробірки	Фермент	Субстрат	Проба Тромера
1
2

За результатами проведеного досліду зробити висновки.

Література

Основна:

1. Губський Ю. І. Біоорганічна хімія. — Вінниця: НОВА КНИГА, 2004. — 464 с.

2. Гонський Я.І., Максимчук Т.П., Калинський М.І. Біохімія .людини. Підручник .- Тернопіль: Укрмедкнига, 2002.-744 с

3. Біологічна хімія: підруч. для студ. вищ. навч. закл./ Л.М. Вороніна, В.Ф. Десенко, Н.М. Мадієвська та ін.. - Харків: Основа, 2000.- 678с.

4. Біологічна хімія з біохімічними методами дослідження: підруч. для студ. вищ. навч. закл. О.Я. Скляров, Н.В. Фартушок, Л.Д. Сойка, І.С. Смачило.- К.: Медицина, 2009.- 352 с.

5. Лекції, які читаються на кафедрі.

Додаткова:

1. Кучеренко М.Є., Бабенюк Ю.Д., Войціцький В.М. Сучасні методи біохімічних досліджень. К.: Фітосоціоцентр, 2001. – 424 с.

2. А. Ленінджер Основи біохімії - М., Мир, 1988.- в 3-х томах

3. Ангельскі С., Якубовскі З., Домінічак М. Г. Клінічна біохімія. – Сопот, 1998. – 451 с.

4. Березов Т. Т., Коровкин Б. Ф. Биологическая химия. – М.: Медицина, 1990. – 528 с.

5. Кольман Я., Рем К.-Г. Наглядная биохимия. – Москва: Мир, 2000. – 470 с.

6. Марри Р., Греннер Д., Мейес П., Родуэлл В. Биохимия человека. – Москва: Мир, 2004.