Туркельтауб Ищенко.ВВЕДЕНИЕ В ХРОМАТОГРАФИЮ Часть 3

Рисунок 27. Разделение 6 рацемических кислот (обозначены на хроматограмме) на колонке 100х4,2мм с LiChrosorb RP-18, модифицированной адсобцией N– гексадецил-L-гидроксипролина. Подвижная фаза:метанол/вода 15/85, рН 5,0, 0,0001 М Cu(AcO)2.

Скорость потока 2 мл/мин.

На рис..27 приведена хроматограмма разделения смеси 6 рацемических кислот* на одной из таких

колонок. Метод хиральной лигандообменной хроматографии внес значительный вклад в развитие

химии природных соединений, а через нее в фармацевтическую науку и промышленность.

С-С или С-Н связи. Однако его чувствительность по

отношению к органическим соединениям различна.

Она уменьшается в ряду: углеводороды > эфиры >

спирты > кислоты. ПИД определяет органические вещества при их концентрациях порядка 10-3 – 10-5 %. С помощью ПИД нельзя определять инертные газы, водород, кислород, азот, воду, оксиды азота, углерода и серы. Сигнал ПИД пропорционален массе вещества в единицу времени. При детектировании

компоненты пробы полностью разрушаются.

В основе действия детектора электронного

захвата лежит явление уменьшения ионного тока,

образованного ионами газа-носителя после облучения его потоком β-частиц, испускаемых изотопом 63Ni или трития. В отсутствии определяемых веществ через измерительную ячейку протекает ток

постоянной величины. Появление в газе-носителе

веществ, способных захватывать электроны с образованием стабильных анионов, приводит к уменьшению электронного тока. Указанной способностью обладают вещества с электроотрицательными группами –

галогенпроизводные, хиноны, нитросоединения. К

ним ДЭЗ проявляет высокую чувствительность и селективность. По отношению к другим органическим

соединениям - аминам, спиртам, углеводородам – он

малочувствителен или нечувствителен.

К селективным детекторам относятся

термоионный (ТИД), позволяющий определять N- и P-

, пламенно-фотометрический (ПФД) – S- и P- содержащие соединения, а также атомноэмиссионный (АЕД), применяемый для селективного определения N, P, S, C, Si, Hg, Br, Cl, H (D), F,O. В

последнем случае испускаемое излучение

регистрируют при помощи фотометра с диодной

линейкой в области 170-180 нм, относительная

погрешность определения составляет 2-20%. Этот

детектор особенно полезен при анализе сложных, разнородных по составу смесей. Им, например, можно определять спирты в бензине по линии испускания атома кислорода.

6. Жидкостная хроматография

При увеличении молекулярной массы веществ,

анализируемых газовой хроматографией, возрастает вероятность термической деструкции.

Этого легко избежать, если в качестве подвижной фазы использовать жидкость. Сегодня с помощью жидкостной хроматографии производится анализ

более 97% от суммы всех веществ, осуществляемых

хроматографией. Бурное развитие метода жидкостной хроматографии связано с развитием ее

высокоэффективного варианта и с разработкой для

него аппаратуры и сорбентов. Отличительной особенностью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) является использование сорбентов с диаметром частиц 3-10 мкм, что

обеспечивает быстрый массоперенос при очень

высокой эффективности.

Колонки длиной 250 мм, заполненные частицами

размером 3, 5, 10 и 20 мкм, будут иметь эффективность, соответственно 40 000, 25 000, 12500

и 6250 т.т. Казалась бы очевидно, что преимущества

имеет колонка с диаметром частиц 3 мкм. Однако,

чтобы прокачать через такую колонку подвижную фазу с заданной линейной скоростью u придется создать очень высокое давление P

(фосфат тетрабутиламмония) при рН 3 - 7 придают

сорбенту свойства анионообменника. Алкилсульфаты

натрия при рН 2 - 5 придают сорбенту свойства

катионообменника.

Существует иная гипотеза, объясняющая разделение ионных соединений методом ион-парной

хроматографии. По ней ион-парный реагент образует

с анализируемым веществом ионную пару в подвижной фазе. Свойства этой пары и определяют времена удерживания разделяемых компонентов.

6.4. Лигандообменная хроматография.

Метод лигандообменной хроматографии был предложен в 1961 году Гельферихом, который использовал колонку с ионообменником, насыщенную

аммиакатом меди для выделения диамина. Метод

основан на способности ионакомплексообразователя, находящегося в

неподвижной фазе, обменивать координированные

им лиганды на другие, которые доставляются подвижной фазой. Открытие Даванковым и Гиль-Авом хиральной лигандообменной хроматографии в 19661968 г. явилось прорывом в области

энантиоселективных технологий. Сорбент для

жидкостной хроматографии в 1968 году был получен введением в структуру сшитого полистирола остатков оптически активной -аминокислоты L-пролина. На

колонке 140 мм с диаметром зерен сорбента 50 мкм удалось полностью разделить энантиомеры

практически всех аминокислот. На сегодняшний день

в литературе описано уже более 1300 хиральных неподвижных фаз. Кроме того, обычную обращенофазовую колонку ВЭЖХ можно превратить в хиральную лигандообменную путем простой адсорбции L-оксипролина.

Рисунок 26. Хроматограмма анализа неорганических анионов с карбонатным элюентом.

Хроматограмма неорганических анионов

представлена на рис.26.

На элюирующую силу подвижной фазы большое влияние оказывают рН, природа буферного раствора, ионная сила, содержание органического

растворителя.

Ион-парная хроматография. Ион-парная

хроматография является еще одним вариантом

ионообменной хроматографии. Она позволяет проводить определение ионогенных веществ на колонках с химически модифицированным силикагелем (С8, С18). При этом в подвижную фазу

вводят небольшие количества (0,001-0.01М), которое называют ион-парным реагентом. В качестве ион-

парных реагентов используются додецилсульфат натрия, фосфат тетрабутиламмония и некоторые

другие вещества. Эти вещества сорбируются за счет неспецифического взаимодействия с С18 на сорбенте и придают ему свойства ионообменника. В зависимости от природы ион-парного реагента сорбент приобретает свойства катионообменника или

анионообменника. Так, соли тетраалкиламмония

где d – диаметр частицы; - фактор

сопротивления колонки; - вязкость; L – длина

колонки.

Так, для колонки 250х4 мм, заполненной сорбентом с диаметром частиц 10 мкм, и подвижной

фазе метанол-вода (70:30) при расходе 1 мл/мин

давление на входе в колонку составит 5 МПа. При тех же условиях, но с сорбентом с диаметром частиц 5 мкм, давление будет составлять 20 МПа., а для частиц с диметром 3 мкм - 55 МПа.

Схема современного жидкостного хроматографа

(рис.20) включает насос высокого давления, кран-

дозатор, хроматографическую колонку, термостат колонок, детектор, персональный компьютер.

Использование колонок, работающих при таком

давлении приводит к усложнению всей хроматографической системы. Во первых, необходимы насосы, способные подавать жидкость без пульсаций с таким давлением. При этом для создания градиента (изменения состава подвижной фазы) необходим отбор элюентов из 2-3 емкостей, смешивание этих растворителей, система удаления

растворенных газов. Ввод пробы обычно

осуществляют через петлевые дозаторы. Соединительные капилляры от насоса до колонки

должны выдерживать давление до 60 МПа и иметь минимальный объем для предотвращения

внеколоночного размывания. Объем зерна сорбента 3-5 мкм и диаметра капилляров 0,1 мм требует

установки целого ряда фильтров.

Рисунок 20. Схема современного жидкостного хроматографа.

Такие фильтры используются при заборе элюента, перед петлевым дозатором, перед колонкой. Конструкция колонки разработана таким образом, чтобы свести к минимуму все пустоты. Детектирование в жидкостной хроматографии обычно осуществляют УФспектрофотометрами, дифференциальные рефрактометрами. В ионной

хроматографии используется кондуктометрический

детектор. Спектрофотометрические детекторы –

одни из наиболее используемых.

УФспектрофотометр работает в диапазоне 190-

650 нм. Он позволяет определять 10-9 г, диапазон линейности 5 порядков.

На сегодня все большее распространение получает детектор с диодной матрицей (ДМД). Он

позволяет проводить сканирование каждого из пиков на хроматограмме, с получением его УФ и УВ спектров в области 190-900 нм, определять

определения. Эти уравнения позволяют теоретически

оценить возможность использования того или иного

элюента или сорбента для разделения

анализируемой смеси.

Экспериментально установлены ряды селективности ионов по отношению к

ионообменникам. Так, на сильнокислотных

катионообменниках наблюдается следующий порядок

.

элюирования: Li H Na NH4 K Rb Cs Такой же

порядок элюирования мы видим и на рис. 6.24. В общем случае время удерживания ионов будет

возрастать в таком порядке M1 M2 M3 M4 .

Рисунок 25. Хроматограмма анализа катионов с азотнокислым элюентом.

На сильнокислотных анионообменниках анионы располагаются в следующем порядке

F Cl NO2 Br NO3 PO43 SO42 .

Согласно основному уравнению хроматографии (30) исправленный удерживаемый объем V’R равен

V’R = Dх Vs, где Vs — объем сорбента. Отсюда, учитывая уравнение 1, {выражая Dx }

В ионной хроматографии удерживание иона на

сорбенте чаще характеризуют величиной приведенного времени удерживания t'R {t'R = V’R/u}, которое равно

где u — объемная скорость элюента. Объем сорбента обычно определяют по его пористости ( ) и общему объему колонки V:

Vs = (l - ) V. (42)

Тогда уравнение 41 принимает вид:

Таким образом, время удерживания иона X при

элюировании ионом Е прямо пропорционально коэффициенту селективности KE X , обменной

удерживания Q и объему сорбента V. В то же время удерживание иона обратно пропорционально концентрации элюирующего иона и объемной скорости элюента. Уравнения (35) и (37) используют при выборе условий ионохроматографического

оптимальную длину волны. В случае неполного

разделения подавлять мешающий пик, проводить

идентификацию компонентов по библиотеке спектров.

Дифференциальный рефрактометр. С его помощью получают сигнал для всех компонентов, показатель преломления которых отличается от

показателя преломления элюента. Его

чувствительность ~10-6 г, диапазон линейности составляет 4 порядка. Этот детектор чувствителен к изменению температуры, требует хорошего термостатирования. Его недостаток – трудность или

даже невозможность работать в градиентном режиме.

Принцип действия флуориметрического

детектора основан на измерении поглощенного света в виде флуоресценции.

Флуоресцентные детекторы чувствительнее спектрофотометрических примерно в 100 раз. Его

применяют при определении микропримесей.

Кондуктометрический детектор применяют в ионной хроматографии для измерения проводимости

раствора, пропорциональной числу ионов в растворе,

их подвижности. Сигнал детектора линейно зависит от концентрации ионов в широком интервале — от

0,01 мкг/мл до 100 мг/мл. Высокочувствительное кондуктометрическое детектирование дает предел

обнаружения 10-9 г/мл.

Электрохимические детекторы используют для детектирования веществ, способных окисляться или

восстанавливаться под действием электрического тока. Они обладают высокой чувствительностью и селективностью. Их особенно широко используют при анализе биологических объектов.

В последнее время для идентификации и чувствительного детектирования используют масс-

спектрометрические детекторы, сочетание

хроматографов с масс-спектрометрами с ионизацией

связанной плазмой.

Жидкая фаза отличается от газовой большей плотностью и вязкостью. Сопротивление массообмену в жидкой фазе возрастает.

Коэффициент диффузии в жидкости на три-четыре

порядка меньше, чем в газе. Соответственно в уравнении Ван-Деемтера (12) константа В (куда входит коэффициент диффузии в подвижной фазе резко падает, константа А при равномерном

заполнении колонки определяется диаметром зерна

А.

Величина сопротивления массопередаче, определяемого константой С в уравнении Ван-

Деемтера (12), будет зависеть от коэффициента

диффузии Ds и толщины слоя неподвижной фазы. Поскольку частицы сорбента имеют большую

поверхность и состоят из ряда более и менее

глубоких пор, то величина этих пор будет влиять на

скорость массопереноса и размывание

хроматографического пика. Учитывая это обстоятельство, были предложены поверхностно-

пористые сорбенты для жидкостной хроматографии

(рис.21). Использование поверхностно-пористых сорбентов позволило значительно повысить

эффективность колонок ВЭЖХ в начале семидесятых годов*. Однако, в последние годы эти сорбенты

применяются редко. Колонки, заполненные

поверхностно-пористыми сорбентами, уступают объемнопористым сорбентам с малым размерам частиц по эффективности.

сорбента и подвижной фазы. Выбор детектора

зависит от условий разделения, характера задачи и

анализируемого образца. Равновесие ионного

обмена между определяемым и элюирующим ионами является основой оптимизации условий разделения.

При элюировании иона X ионом Е равного заряда

концентрации С в системе устанавливается ионообменное равновесие

X R E E R X

Оно характеризуется константой ионного обмена, или коэффициентом селективности KE X который равен

определяемого и элюирующего ионов в фазе

ионообменника, а [X] и [Е] — равновесные концентрации этих ионов в подвижной фазе.

Отношение [X ] [X] является коэффициентом распределения (Dx)

определяемого иона X и характеризует способность

этого иона удерживаться

Если удельная обменная емкость сорбента Q, то при малых заполнениях колонки [E]= Q [X ] Q, а [Е]

≈СЕ .

Заполнение колонки не должно превышать 10%. Иными словами, количество определяемого иона

должно быть как минимум в 10 раз меньше обменной

Это позволяет использовать сильно разбавленные

растворы элюентов.

В этом методе разделение ионов сочетают с кондуктометрическим их определением. Поскольку высокочувствительное кондуктометрическое определение возможно только при невысокой

фоновой электропроводности потока жидкости,

поступающей в детектор, фоновый электролит подвижной фазы, предварительно удаляют пропусканием его через ионообменные смолы.

Предложены два основных метода ионной хроматографии.

Двухколоночная ионная хроматография,

основанная на компенсации (подавлении) электролита,

содержащегося в элюенте для разделения смеси ионов

на колонке с помощью второй (компенсационной) ионообменной колонки, расположенной между

детектором и разделительной колонкой.

Другим вариантом ионной хроматографии является одноколоночная ионная хроматография, основанная на использовании

электролита с невысокой электропроводностью. В этом случае компенсационная колонка отсутствует.

Оптимизация условий в ионной хроматографии заключается в поиске наиболее селективного и

эффективного разделения ионов в сочетании с

минимизацией времени анализа. Большое внимание уделяется чувствительности детектирования.

Оптимальными являются условия разделения, при которых время выхода последнего хроматографического пика не превышает 20 мин, а разрешение соседних пиков равно 1,0-1,5.

В настоящее время условия определения выбирают эмпирически, путем подбора подходящего

Рисунок 21. Типы сорбентов для ВЭЖХ*. а – поверхностно-пористый; б - объемно-пористый; в – объемно-пористый с частицами малого диаметра.

Из рис. 21 видно, что уменьшение диаметра

частицы, сокращает длину диффузионного пути

молекул анализируемого вещества в порах сорбентов обоих типов.

6.1. Адсорбционная жидкостная хроматография

В адсорбционной жидкостной хроматографии (ЖАХ) удерживание анализируемого вещества объясняется на основе так называемой

“конкурентной модели”, согласно которой твердая поверхность покрыта

молекулами подвижной фазы, и молекулы образца вынуждены конкурировать с молекулами, расположенными в этом адсорбированном слое, за

связывание с центрами адсорбции. Сильно адсорбирующиеся на поверхности растворители

трудно заместить, и поэтому их относят к “сильным

растворителям”, снижающим время удерживания анализируемого вещества. В то же время растворители, слабо взаимодействующие с неподвижной фазой, заместить легко, и поэтому они выступают в качестве “слабых растворителей”. Ясно,

что, согласно “конкурентной модели”, удерживание в ЖАХ определяется именно различием

между сродством подвижной фазы и образца к неподвижной фазе.

Было предложено следующее уравнение* для

количественного описания упомянутого эффекта

конкурирования:

В этом уравнении Ka — константа распределения

анализируемого вещества; S°i — энергия адсорбции образца на стандартном адсорбенте; Va — объем

адсорбированного растворителя в расчете на грамм неподвижной фазы; Ai—площадь, занятая адсорбированной молекулой образца; — активность сорбента; 0—удельная энергия адсорбции растворителя (энергия адсорбции, отнесенная к единице площади поверхности) на том же стандартном адсорбенте, которую обычно называют силой растворителя или элюирующей силой.

Отношение факторов удерживания для молекул анализируемого вещества, которое получено на двух

Параметр ° позволяет также оценить полярность

растворителя (см. таблицу 6).

6.2. Хроматография “жидкость-жидкость”

В хроматографии “жидкость-жидкость” более

полярные молекулы подвижной фазы “выталкивают” менее полярные молекулы анализируемого вещества к поверхности сорбента. Так как современная

жидкостная хроматография в большинстве разделений использует воду, то для меры этого

Простейшая методика ионообменного разделения

состоит в поглощении компонентов смеси ионитом и

последовательном элюировании каждого компонента

соответствующим растворителем. Например, разделение ионов Na и K раствором соляной кислоты

(0,1 М HCl).

Рисунок 24. Типичные хроматограммы анализа

углеводов. А – сыворотки крови поглощение при 481 нм; Б - анализ мочи; С - идентификация сахаров, концентрация каждого 1 мкмоль/л, поглощение при

481 нм.

Использование ионообменной хроматографии высокого давления* позволяет проводить анализ сыворотки крови, анализ мочи на содержание

углеводов. Хроматограмма представлена на рис. 24.

В 1975 году Смол, Стивенс и Бауман предложили новый вариант ионообменной хроматографии –

ионную хроматографию. В ионной хроматографии используются поверхностно-пористые сорбенты с

небольшой емкостью 0,01-0,1 мэкв/г, объемнопористые полистирольные ионообменники и объемно-

пористые кремнеземы с размером частиц 5-10 мкм.