Туркельтауб Г.Н., Ищенко А.А.ВВЕДЕНИЕ В ХРОМАТОГРАФИЮ

Рисунок 8. Зависимость сигнала (площади пика) S от содержания компонента % (метод внешнего стандарта) для соединений 1, 2 и 3.

Метод внутреннего стандарта (относительной калибровки). По хроматограммам специально приготовленных смесей с известным соотношением

анализируемого и стандартного веществ находят площади пиков и рассчитывают их отношение. Для каждого вещества строят график зависимости этого

отношения (S/Sст) от величины массового соотношения компонента и стандартного вещества в смеси. При анализе смеси неизвестного состава к ней добавляют точное количество стандартного вещества

и хроматографируют.

Измеряют площади. Находят отношение площадей пиков и рассчитывают массу определяемого вещества. Этот метод позволяет получить правильные и воспроизводимые результаты. Он применим, если на хроматограмме отсутствует значительная часть пиков компонентов анализируемой смеси.

могут включать инертные газы и высокомолекулярные

полимеры. Вещества с молекулярной массой до 500-

1000 обычно разделяют методом газовой

хроматографии. Флюидная хроматография

позволяет разделять вещества с молекулярной массой до 5000. Жидкостная хроматография

успешно разделяет соединения с молекулярной массой до 10 000, а для соединений с молекулярной массой свыше 10 000 используется ситовая

(эксклюзионная) хроматография.

Если вещества необходимо разделить в форме

ионов, то используются различные варианты

ионообменной хроматографии.

Аффинная хроматография использует специфическую селективность некоторых

биологических и биохимических процессов.

Лигандообменная хроматография позволяет разделять даже лево- и право-вращающие изомеры.

Если вещества не удается разделить прямыми методами, то их можно разделить в виде производных. Если необходимо исследовать высокомолекулярное вещество, то его можно

подвергнуть пиролизу.

Хроматограмма, полученная после пиролиза может позволить охарактеризовать исходный

полимер (дать его “характерный спектр”). Другим косвенным методом для характеристики подобных

соединений является обращенная хроматография.

В этом случае анализируемое вещество наносится в

качестве неподвижной фазы. Об изменениях, происходящих в нем, судят по уменьшению (увеличению) времени удерживания и искажению

формы пика нескольких стандартных веществ. Далее мы будем иметь дело в основном с

www.mitht.ru/e-library

аналитической хроматографией.

Из рис.1 и 2 следует, что время удерживания

t		L			L K	(3)
		u			u

K

где L – длина колонки, u - средняя линейная скорость газа-носителя. Соответственно для

несорбирующегося вещества (K = 0) to = L/u.

Однако уравнение (3) справедливо лишь при

условии, что объем неподвижной фазы VS равен

объему подвижной фазы VM. Если это не так, то

время удерживания:

		L (K	VS	)
	t		VM			L k		(4)
		u				u
где k –фактор удерживания (фактор ёмкости),
равный:	k = K (VS/ VM)							( 5)
Фактор	удерживания		можно				определить
непосредственно из хроматограммы:
	k = (tR – to)/ to							(6)
Характеристикой степени				разделения				двух

веществ служит фактор разделения (коэффициент селективности) .

= 2/tt1= k2/ 1k

(7)

Этот коэффициент тоже можно определить непосредственно из хроматограммы.

формуле:

xi% nSi i 100Si i

i 1

При анализе многокомпонентных смесей обычно

возникает ситуация, когда провести градуировку по всем компонентам смеси невозможно. Поэтому приобретает актуальность априорная оценка поправочных коэффициентов. Такая оценка основана на анализе механизма детектирования и учета особенностей химического строения анализируемых

веществ. Так, для пламенно-ионизационного

детектора экспериментальные наблюдения позволили установить, что сигнал детектора при

анализе углеводородов пропорционален числу

атомов углерода в молекуле.

Метод внешнего стандарта (абсолютной

калибровки) заключается в построении графической зависимости площади (высоты) пиков от количества (концентрации) вещества в смеси (рис. 8). При

анализе смеси из i компонентов, строят число графиков, равное их числу. Метод является наиболее

точным, надежным при анализе малых концентраций. При его использовании необходимо точно вводить

пробу и строго соблюдать условия хроматографирования при калибровке и определении

анализируемого вещества.

www.mitht.ru/e-library

на:

-применении специальных детектирующих систем;

-применении корреляционных зависимостей параметров удерживания от физических или физикохимических свойств веществ.

Наиболее полно такие зависимости изучены, например, для температуры кипения, показателя

преломления, молекулярной рефракции, числа

функциональных групп.

Количественный анализ.

Количественный анализ основывается на

измерении площади хроматографического пика S или его высоты h, которые пропорциональны концентрации определяемого вещества.

Обычно используют один из трех методов обработки результатов анализа. Это методы нормировки, внешнего и внутреннего стандарта.

Метод нормировки. Нормировка в хроматографическом анализе представляет собой

расчет массовой доли каждого компонента смеси xi,

путем деления площади соответствующего пика, Si на сумму площадей всех пиков. При этом считают, что из

хроматографа выходят все компоненты смеси и

чувствительность детектора к каждому их них одинакова:

xi% nSi 100%

Si ,

i 1

где n – число компонентов в смеси.

Часто чувствительность детектора к различным

соединениям неодинакова. Эту особенность учитывают введением поправочных коэффициентов,

i. В этом случае массовую долю рассчитывают по

3. Теоретические основы хроматографии

При движении веществ в хроматографической

колонке происходит размывание (уширение) пиков разделяемых веществ, обусловленное кинетическими и диффузионными причинами. При этом пик приобретает форму гауссовой кривой. Поэтому

размывание хроматографического пика может быть

описано через стандартное отклонение и

дисперсию 2. При рассмотрении рис.1 мы

воспользовались теорией теоретических тарелок,

предложенной Мартином и Сингом. По этой теории

движение вещества вдоль колонки можно представить как последовательный его перенос c одной теоретической тарелки на другую.

Число теоретических тарелок n равно отношению длины колонки к высоте, эквивалентной

теоретической тарелке Н:

n = L/H	(8)
Высота, эквивалентная теоретической	тарелке

(ВЭТТ), связана с дисперсией пика в колонке 2 ,

которая выражена в единицах длины 2L или времени

2t..

		2			2
H		L	или H		t	( 9)
					2
		L		t
					R

ВЭТТ имеет размерность длины. Уменьшение

ВЭТТ (8) позволяет, повысить эффективность колонки.

Для пика гауссовой формы (рис.2)

справедливо равенство 4 t . Подставляя в уравнение (9), получим:

www.mitht.ru/e-library

	2 L
H			.	(10)
		2
1 6 t		R

Число теоретических тарелок равно

		t		R	2
	n 16				.	(11)

Эта величина может быть рассчитана непосредственно из хроматограммы. Однако в этом

случае легче измерить ширину пика на половине

высоты , чем (смотри рис.2).

		t		R	2
	n 5.55				.	(11a)

Эта величина рассчитывается из хроматограммы и

позволяет оценить качество используемой колонки.

Принято считать, что в реальном

хроматографическом процессе размывание полосы определяется, совокупностью процессов диффузии и сопротивления межфазового массообмена. Такой подход был впервые сформулирован в 1956 году Ван-Деемтером и получил название теории ВанДеемтера. Согласно этой теории зависимость высоты, эквивалентной теоретической тарелке, H от

скорости газа-носителя описывается уравнением

H A B / u C u

(12)

В это уравнение входят три константы.

концентраций, в пределах которого зависимость

«сигнал – концентрация» имеет линейный характер.

-стабильность работы (низкая чувствительность к колебаниям температуры;

-воспроизводимость. Под воспроизводимостью

работы детектора понимается воспроизводимость его

показаний во времени при постоянных чувствительности, фоновом токе и других условиях эксперимента.

Анализ и методы расчета хроматограмм

Аналитическую хроматографию используют для

качественного и количественного анализа простых и

очень сложных смесей, в том числе таких как пищевые продукты, лекарства, продукты, загрязняющие окружающую среду. Препаративную хроматографию применяют для выделения некоторых

веществ с близкими свойствами (например, лево- и

правовращающие изомеры), для очистки лекарственных препаратов. Промышленную хроматографию используют для контроля и

регулирования различных технологических

процессов.

Качественный анализ основывается на

сопоставлении времен удерживания компонентов смеси с веществами, выделенными из данной смеси

(или полученными другим путем), которые затем были

идентифицированы иными независимыми методами. Успешная идентификация проводится при сочетании хроматографии с некоторыми спектральными методами. Большое значение приобретает хромато-масс-спектрометрия,

соединение хроматографии с УФ и ИК спектроскопией и некоторыми другими методами.

Широко используется идентификация, основанная

www.mitht.ru/e-library

«Механическая рука» вводит шприц в склянку,

промывает его раствором анализируемой смеси и

вводит в испаритель хроматографа. Затем берется

проба из другой склянки для следующего анализа. В испарителе (4) проба переводится в газообразное состояние. Затем она захватывается потоком подвижной фазы и попадает в колонку. В хроматографической колонке (5) смесь разделяется на отдельные компоненты. Колонки обычно

помещаются в воздушный термостат (6). Компоненты

анализируемой пробы вместе с потоком подвижной фазы поступают в детектор (7). В детекторе

изменение концентрации компонента преобразуется в

электрический сигнал, усиливаемый и затем регистрируемый в виде выходной кривой – хроматограммы (8). В современных хроматографах задание и поддержание температуры, скорости подвижной фазы и всех других параметров хроматографического опыта берет на себя

компьютер.

Схема высокоэффективного жидкостного хроматографа (ВЭЖХ) представлена на рис. 20 будет

рассмотрена позже.

Основными техническими характеристиками

хроматографических детекторов являются:

-чувствительность, которую характеризуют отношением сигнала детектора к количеству

регистрируемого вещества;

-предел детектирования или предел обнаружения

(ПО) - минимальное количество вещества, соответствующее сигналу детектора, вдвое превышающему высоте пика, характерного для шума

детектора;

-линейность, представляющая собой диапазон

Рисунок 3. Зависимость высоты эквивалентной

теоретической тарелки H от скорости газа-носителя

U. А – коэффициент, учитывающий вклад вихревой диффузии, В - молекулярной (продольной) диффузии,

С – сопротивлению массопереносу между фазами.

Константа A описывает вклад в размывание полосы вихревой диффузии за счет неравномерности потока

подвижной фазы (рис. 4)

A = 2 dр

(13)

где dр – средний диаметр зерна твердого носителя; - константа, являющаяся мерой неравномерности заполнения колонки.

Размывание пика по длине колонки

Рисунок 4. Иллюстрация вихревой диффузии. Константа В учитывает вклад молекулярной

(продольной) диффузии, т.е. диффузии молекул в

www.mitht.ru/e-library

прямом и противоположном направлении движения

подвижной фазы:

B = Dm , (14)

где - коэффициент извилистости, учитывающий ограничение пути в насадочной колонки; Dm – коэффициент диффузии анализируемого вещества в подвижной фазе.

Константа Сs учитывает сопротивление массопередачи в неподвижной фазе.

8			k		ds	2		,		(15)
Cs
	2		(1 k)2
					Ds
Таблица 2. Параметры, влияющие на высоту
эквивалентную теоретической тарелке
Величина							Обозна-			Размер-
							чение			ность
Линейная скорость потока							u			см с-1
Коэффициент диффузии в							Dm			см2 с-1
подвижной фазе
Коэффициент диффузии в							Ds			см2 с-1
неподвижной фазе
Размер частиц сорбента							dp			см
Толщина слоя							ds			см
неподвижной фазы
Внутренний диаметр							D			см
колонки

Рассмотренный ранее фактор разделения α показывает только расположение максимумов двух пиков, но не учитывает их размывание.

Очевидно, что при разделении двух веществ, свой

вклад наряду с коэффициентом селективности

состоящей из следующих стадий: подача подвижной

фазы, ввод анализируемой пробы, собственно

хроматографическое разделение, детектирование,

обработка результатов разделения. Каждой из указанной стадий соответствует определенный узел или блок хроматографа. На рис.7 показана схема хроматографа.

Рисунок 7. Схема газового хроматографа.

1 – газ-носитель; 2 – регулятор потока газ-носителя; 3 – микрошприц для ввода пробы; 4 – испаритель; 5 – хроматографические колонки; 6 – термостат колонок; 7 – детектор; 8 – система регистрации.

Газ-носитель из газового баллона через редуктор

поступает в хроматограф (1). Регулятором расхода устанавливается скорость газа-носителя (2). Ввод

пробы обычно осуществляется с помощью шприца (3) или дозатора. Автоматические дозаторы позволяют

работать в полностью автоматизированном режиме.

В дозаторе в специальных гнездах располагаются

склянки с образцами анализируемых смесей.

www.mitht.ru/e-library

Тип изотермы

Линейная Выпуклая Вогнутая

S

Форма пика вещества, элюирующего из колонки

Концентрация вещества CA

Рисунок 6. Связь изотермы распределения, формы хроматографического пика и объема удерживания. CA, CB - концентрация анализируемого вещества в неподвижной и подвижной фазе соответственно; VR – объем удерживания;

S– сигнал детектора.

4.Общая схема хроматографического анализа.

Несмотря на большое многообразие вариантов хроматографии, процесс хроматографического анализа можно представить единой схемой,

должна вносить и эффективность колонки.

Предложенный критерий разделения (разрешение пиков) RS включает в себя оба этих критерия.

R	tR		tR	2	tR	tR	,	(16)
		2	1		2	1
	(	)/2
s
	2		1	2		1

где 2 и 1 – ширина пиков у их оснований, т.е.

расстояние между точками пересечения касательных

в точках перегиба пика с осью абсцисс (рис.2). Критерий разделения RS непосредственно связан с чистотой выделяемой пары веществ (при выделении без промежуточной фракции). Так, концентрация выделенных веществ будет составлять чуть более

98% при Rs = 1 и около 99,9% при Rs = 1,5.

Рисунок 5. Оценка эффективности и селективности хроматографического разделения.

На рис.5 представлены три хроматограммы, соответственно при Rs = 0,75; 1,0 и 1,5. Такое

улучшение разделения достигается при увеличении

www.mitht.ru/e-library

эффективности или возрастании фактора разделения

.

Уравнение (16) можно представить в ином виде, связав критерий разделения Rs c фактором емкости k, коэффициентом разделения и числом

теоретических тарелок n.

Примем 1 2= . Подставим в уравнение (16) ширину

пика у основания , представленную через число теоретических тарелок n из соотношения (11):

RS	tR	2	tR1		n
						(17)
			tR2		4

Подставим в полученное выражение величины коэффициентов ёмкости из уравнения (6):

R		k2 k1		n	(18)
				4
S		k 1

Если в полученное выражение (18)

подставить из уравнения (7) величину коэффициента

селективности , тогда можем записать:

R		1		1						k							(19)
														n
								k 1
S	4
			2			2 k 1 2
n 16Rs																	(20)
					1									k	'

Из уравнения (20) следует, что при заданном значении критерия разделения Rs и коэффициента селективности , который определяется свойствами хроматографируемых соединений необходимо

увеличить эффективность колонки. Для разделения соединений с близкими свойствами надо увеличить

длину колонки или уменьшить ВЭТТ. Последнее может быть достигнуто уменьшением размера частиц, увеличением однородности насадки колонки,

уменьшением толщины пленки жидкой фазы при

одновременном снижении адсорбционной активности

поверхности, на которую наносится эта неподвижная

фаза. Помимо этого можно увеличить фактор разделения . Для этого необходимо подобрать более селективную неподвижную, а для жидкостной

хроматографии и подвижную фазу. В газовой

хроматографии снизить температуру колонки.

Помимо диффузии и сопротивления

массопередачи размывание пика будет происходить в случае нелинейности изотермы распределения.

До сих пор мы исходили из теории «идеальных растворов», когда константа распределения не зависит от концентрации. При этом, как видно из рисунка 6 (первый столбец) изотерма распределения имеет линейный характер, пик остается симметричным, а время удерживания

постоянным. Если изотерма распределения имеет

выпуклый характер, то с увеличением концентрации время удерживания уменьшается, а у пика появляется «хвост». Если изотерма распределения имеет вогнутую форму, то с увеличением концентрации время удерживания увеличивается, а у пика появляется «нос».

При этом происходит дополнительное размывание полосы (увеличение ширины пика). Для уменьшения

этого в газожидкостной хроматографии проводится очень тщательная обработка твердого носителя,

который промывается кислотами и затем

обрабатывается парами хлорсиланов.

www.mitht.ru/e-library